Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Le développement de cette technique a été soutenu par les fonds du plan national de R&D clé du ministère de la Science et de la Technologie (2018YF0902604), du Fonds de recherche de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour les jeunes scientifiques internationaux (22050410270) et des fonds externes des Instituts de technologie avancée de Shenzhen (DWKF20190001). Nous tenons à exprimer notre sincère gratitude à Mlle Chen Xinyi pour son aide dans la relecture du document et la gestion du laboratoire.

1. Préparation des plaques d’essaim gradient
<ol><li>Préparation du milieu d’essaim NOTE: Voir la section de discussion pour une brève comparaison des différentes viscosités moyennes; Une concentration de 0,7 % (p/v) de gélose dans le milieu de l’essaim a été utilisée dans ce protocole.<ol>
<li>Préparer le bouillon de lysogénie (LB) en poudre avec de la gélose dans deux flacons coniques; chaque flacon contient 2 g de tryptone, 2 g de chlorure de sodium, 1 g d’extrait de levure et...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

L’étude de la motilité de l’essaimage bactérien sur les plaques de gradient semi-solides peut être une tâche difficile18,19,20, car elle implique de multiples facteurs tels que la viscosité du substrat, l’humidité et les composants du milieu. Parmi ces facteurs, la concentration de gélose joue un rôle décisif dans la détermination de la réversion microbienne vers la motilité de nage ou d’essaimage. Au fur et...

La motilité d’essaimage bactérien fait référence à la migration collective de cellules bactériennes à travers la surface d’une substance. Outre les plaques de gélose semi-solides spécialement préparées en laboratoire1, ce phénotype est également observé sur certains substrats mous tels que les tissus animaux2, les surfaces hydratées3 et les racines végétales4. Alors qu’une surface semi-solide est considérée comme l’une des conditions fondamentales de l’essaimage bactérien, certaines espèces ont également besoin d’un milieu riche en énergie pour soutenir leur motilité d’essaimage5. La rotation des flagelles alimente à la fois la nage et l’essaimage, la nage de motilité décrit la motilité unicellulaire dans un environnement liquide, tandis que l’essaimage est le mouvement synchrone d’une population microbienne sur des surfaces semi-solides.
La viscosité du substrat influence la motilité bactérienne; des études sur des microbes pathogènes, tels que Helicobacter pylori, ont montré que la motilité de l’agent pathogène change en fonction de la viscosité de la couche de mucine, qui est influencée par l’acidification environnementale chez l’hôte humain6. Pour reproduire ces environnements, des études antérieures utilisant une concentration de gélose supérieure à 0,3% (p / v) limitent la motilité de nage bactérienne pour effectuer un déplacement progressif vers l’essaimage de surface. L’utilisation d’une concentration de gélose supérieure à 1 % (p/v) empêche la motilité d’essaimage de nombreuses espèces7. Les motifs de colonie formés à la surface sont divers, y compris mat8 sans caractéristiques, œil de taureau9, dendrites10 et vortex11.
Bien que la pertinence de ces modèles reste incertaine, ces modèles semblent dépendre d’indices environnementaux et chimiques12. Les indices environnementaux couvrent différents aspects, y compris la température, la salinité, la lumière et le pH, tandis que les indices chimiques comprennent la présence de molécules microbiennes de détection du quorum, de sous-produits biochimiques et de nutriments. Les molécules de signalisation de détection de quorum auto-inducteurs telles que l’AHL (N-hexanoyl-L homosérine lactone) peuvent avoir un impact sur l’essaimage de surface en régulant la production de tensioactif13,14. Le resvératrol, un composé phytoalexine, pourrait limiter la motilité de l’essaimage bactérien15.
Dans le présent travail, nous étudions l’effet des concentrations de gradient de resvératrol sur la souche Escherichia coli K12 de type sauvage et étudions la motilité d’essaimage inductible à l’arabinose des espèces E. coli K12-YdeH et Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La production de l’enzyme YdeH est induite par l’arabinose via le promoteur araBAD, ce qui entraîne une perturbation cellulaire c-di-GMP et affecte la motilité de l’essaimage bactérien16,17. Ce comportement d’essaimage inductible est étudié à l’aide de plaques d’essaim à gradient arabinose avec des souches E. coli K12-YdeH et P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Les plaques d’essaim gradient sont préparées en solidifiant successivement un milieu à double couche (Figure 1B). La couche inférieure comprend le milieu ajouté avec l’inducteur, versé sur un côté d’une boîte de Petri soutenue. Lors de la solidification de la couche inférieure, la boîte de Petri est renvoyée sur une surface plane, où la couche supérieure contenant le milieu sans inducteur est ajoutée de l’autre côté de la plaque. Une fois les plaques d’essaim complètement solidifiées, des puits de rétention disposés isométriquement sont produits en forant des trous sur les plaques d’essaim suivant une disposition fixe (figure 1C) ou en imprimant les puits à l’aide d’un modèle imprimé en 3D du couvercle de la plaque contenant des chevilles pendant le processus de durcissement du milieu (figure supplémentaire S1). Un système d’imagerie sur gel est utilisé pour capturer les morphologies d’essaimage à différents moments (Figure 2). L’analyse de l’essaimage de surface à l’aide du logiciel ImageJ (figure supplémentaire S2) fournit des résultats quantitatifs du processus d’essaimage de surface (figure 3).
Ainsi, nous proposons une méthode simple pour tester la motilité de l’essaimage de surface dans une plage de concentration d’inducteurs. Cette méthode peut être utilisée pour tester les réponses de concentration multiples d’autres inducteurs en mélangeant l’inducteur dans le milieu de la couche inférieure et peut être appliquée à d’autres espèces mobiles (par exemple, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Cette approche pourrait fournir des résultats qualitatifs et quantitatifs fiables pour le criblage d’un seul inducteur chimique, et des plaques séparées pourraient être utilisées pour évaluer davantage d’inducteurs chimiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

La motilité d’essaimage bactérien est un phénotype microbiologique commun que les communautés bactériennes utilisent pour migrer sur les surfaces semi-solides. Dans les études de la motilité d’essaimage induite, la concentration spécifique d’un inducteur peut ne pas être en mesure de signaler des événements se produisant dans la plage de concentration optimale pour obtenir les réponses souhaitées d’une espèce. Les plaques semi-solides contenant plusieurs concentrations sont couramment utilisées pour étudier la réponse dans une plage de concentration d’inducteur. Cependant, les plaques semi-solides séparées augmentent les variations de viscosité moyenne et de teneur en humidité à l’intérieur de chaque plaque en raison du temps de solidification non uniforme.
Cet article décrit une méthode en une étape pour tester simultanément la motilité de l’essaimage de surface sur une seule plaque de gradient, où les puits d’essai disposés isométriquement permettent l’acquisition simultanée de réponses multiconcentrations. Dans les présents travaux, l’essaimage de surface d’Escherichia coli K12 et de Pseudomonas aeruginosa PAO1 a été évalué en réponse à un gradient de concentration d’inducteurs tels que le resvératrol et l’arabinose. Périodiquement, les morphologies de l’essaim ont été imagées à l’aide d’un système d’imagerie pour capturer l’ensemble du processus d’essaimage de surface.
La mesure quantitative des morphologies de l’essaim a été acquise à l’aide du logiciel ImageJ, fournissant des informations analysables sur la zone de l’essaim. Cet article présente une méthode simple de plaque d’essaim à gradient qui fournit des informations qualitatives et quantitatives sur les effets des inducteurs sur l’essaimage de surface, qui peut être étendue pour étudier les effets d’autres inducteurs sur un plus large éventail d’espèces bactériennes mobiles.

Le flux de travail consistant en la préparation de plaques d’essaim de gradient, l’inoculation et l’incubation est illustré à la figure 1B. Pour générer des plaques de nage en dégradé, le milieu de la couche inférieure est versé dans des plats appuyés à environ 4,3 ° du plan horizontal (figure supplémentaire S3), puis verse le milieu de la couche supérieure une fois la couche inférieure complètement solidifiée. La composition du milieu à double couche...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Ici, nous décrivons l’utilisation de plaques de gradient inducteur pour évaluer la motilité de l’essaimage bactérien tout en obtenant simultanément plusieurs réponses de concentration.

Quantification de la motilité de l’essaimage de surface bactérienne sur les plaques de gradient inducteur

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Le protocole suit simultanément les réponses d’essaimage bactérien à différentes concentrations d’inducteurs sur une gélose semi-solide. Ceci est réalisé de manière rentable. Cette technique de criblage à haut débit annule le besoin d’une gélose avec diverses concentrations inductrices pour observer les réponses microchimiotactiques.La technique est conçue pour le dépistage de drogues et aussi pour observer les réponses SD micropathogènes. En outre, il peut être utilisé pour étudier les microréponses à divers indices biochimiques chez l’hôte humain. Cette méthode peut fournir un aperçu de la chimiotaxie bactérienne.Les bactéries réagiront à diverses concentrations d’attractifs chimiques connus sous le nom de chimiotaxie positive ou de répulsifs chimiques connus sous le nom de chimiotaxie négative. Une configuration soigneusement préparée est essentielle pour éviter les variations entre l’angle de gel de la couche inférieure afin d’éviter le problème de reproductibilité. Pour commencer, étiquetez des boîtes de Petri carrées de 13 par 13 centimètres avec des taches et des noms d’inducteurs.Ensuite, soutenez la vaisselle sur le bord des couvercles. Ajouter la solution d’arabinose au milieu de la couche inférieure chaude. Ajouter 40 millilitres de milieu de couche inférieure chaud.Laissez le milieu de la couche inférieure durcir à découvert pendant une heure à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire sans être dérangé. Une fois la couche inférieure complètement solidifiée, retirez les couvercles et posez les boîtes de Petri à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire. Ajouter 40 millilitres de milieu chaud de la couche supérieure à l’aide d’un filtre à pipette motorisé.Durcissez les plaques à double couche couvertes et non perturbées pendant une heure, puis conservez-les à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Placez le papier A4 marqué sous une plaque dégradée bien solidifiée. Poussez le côté plus large d’une pointe de pipette de 100 microlitres dans la surface du milieu semi-solide à la position marquée et appuyez sur la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’elle atteigne le bas du milieu de la couche supérieure.Lorsque la pointe touche le fond, arrêtez d’appliquer une force verticale sur la pointe et faites pivoter doucement la pointe pour isoler le contenu du puits cylindrique. Déplacez horizontalement l’embout de la pipette le long d’une petite distance pour permettre à l’air de circuler dans l’endroit étroit mis de côté. Appuyez sur la pointe avec l’index pour bloquer le flux de gaz à l’intérieur de la pointe.Retirez la pointe verticalement, en gardant le contenu du puits dans la pointe tout en la retirant. Ajoutez 80 microlitres de la culture de croissance du jour au lendemain dans chaque puits. Sortez les plaques d’essaim de l’incubateur une à la fois toutes les 12 heures et placez-les dans le système d’imagerie en gel.Sélectionnez le mode d’imagerie sur gel, exposez la plaque d’essaim à la lumière blanche et ajustez la distance focale pour obtenir une vue claire des essaims. Améliorez la luminosité des essaims pour une observation précise en ajustant le temps d’exposition à 300 millisecondes. Ajustez le seuil pour minimiser les interférences de la lumière de fond.Enregistrez le fichier image pour une analyse plus approfondie. Enregistrez le temps d’imagerie, le type d’inducteur, l’orientation du gradient et les déformations dans un fichier txt. Cliquez sur Processus, puis sur Ombres pour améliorer la netteté de l’image.Cliquez sur Processus suivi de Batch pour traiter l’image. Ensuite, traitez une image comme référence en cliquant sur Processus, Ombres et Sud. Cliquez sur Processus, Lot, Macro pour ouvrir la fenêtre Traitement par lots.Recherchez les commandes affichées dans la fenêtre. Tapez l’adresse du dossier des images d’origine dans l’adresse du fichier de sortie en cliquant sur Processus dans la fenêtre Traitement par lots. Utilisez l’outil de traçage de baguette pour sélectionner les essaims individuellement et double-cliquez sur l’outil de traçage de baguette pour ajuster la tolérance jusqu’à ce que la ligne générée s’adapte correctement à la limite de l’essaim.Cliquez sur Analyser, puis sur Mesurer pour exporter la valeur de la zone. E. coli K12 YdeH a été testé sur des plaques de gradient arabinose utilisées pour démontrer le processus d’essaimage de surface avec chevauchement se produisant entre les puits adjacents. Une plaque avec trois puits d’essai a permis la formation de limites qui ne se chevauchaient pas.La motilité d’essaimage de P.aeruginosa PAO1 YdeH a été favorisée par une augmentation de la concentration d’arabinose à partir de la concentration la plus faible, mais progressivement limitée avec des concentrations plus élevées d’arabinose. Les souches de type sauvage E. coli K12 testées sur des plaques de gradient de resvératrol dans la plage de concentration de zéro à 400 microlitres ont montré une restriction modeste de la motilité d’essaimage avec une concentration croissante de resvératrol. Les zones d’essaim ont été quantifiées par le logiciel ImageJ.La courbe d’essaimage affichait les multiples réponses de concentration. La partie la plus cruciale de cette procédure consiste à fabriquer une plaque d’essaim à double couche avec une plage de concentration spécifique d’inducteurs. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier l’essaimage de surface induit dans une plage de concentration spécifique et de quantifier les effets d’autres inducteurs et composants sur l’essaimage.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Recherche

Biochimie

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Un test de motilité planaire pour évaluer les propriétés biomodulantes des produits naturels

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...