Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
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Die Entwicklung dieser Technik wurde durch die Mittel des National Key R&D Plan (2018YF0902604) des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, des Forschungsfonds für internationale Nachwuchswissenschaftler (22050410270) der National Natural Science Foundation of China und der Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001) unterstützt. Wir möchten Frau Chen Xinyi unseren aufrichtigen Dank für ihre Unterstützung beim Korrekturlesen des Dokuments und des Labormanagements aussprechen.

1. Herstellung von Gradientenschwarmplatten
<ol><li>Herstellung von Schwarmmedium HINWEIS: Im Diskussionsabschnitt finden Sie einen kurzen Vergleich verschiedener mittlerer Viskositäten. 0,7% (w/v) Agarkonzentration von Schwarmmedium wurde in diesem Protokoll verwendet.<ol>
<li>Lysogeny Brühe (LB) Pulver mit Agar in zwei konischen Kolben vorbereiten; Jeder Kolben enthält 2 g Trypton, 2 g Natriumchlorid, 1 g Hefeextrakt und 1,4 g Agar. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) hin...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

Die Untersuchung der bakteriellen Schwarmmotilität auf halbfesten Gradientenplatten kann eine herausfordernde Aufgabe sein18,19,20, da sie mehrere Faktoren wie Substratviskosität, Feuchtigkeit und mittlere Komponenten umfasst. Unter diesen Faktoren spielt die Agarkonzentration eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der mikrobiellen Rückkehr zur Schwimm- oder Schwarmmotilität. Wenn die Agarkonzentration von 0,3% (w/v) a...

Die bakterielle Schwarmmotilität bezieht sich auf die kollektive Migration von Bakterienzellen über die Oberfläche einer Substanz. Neben halbfesten Agarplatten, die speziell im Labor hergestellt wurden1, wird dieser Phänotyp auch auf einigen weichen Substraten wie tierischem Gewebe2, hydratisierten Oberflächen3 und Pflanzenwurzeln beobachtet4. Während eine halbfeste Oberfläche als eine der Grundbedingungen für bakterielle Schwärme gilt, benötigen einige Arten auch ein energiereiches Medium, um ihre Schwarmmotilität zu unterstützen5. Flagellenrotation treibt sowohl Schwimmen als auch Schwärmen Motilität an - Schwimmen beschreibt die einzellige Motilität innerhalb einer flüssigen Umgebung, während Schwärmen die synchrone Bewegung einer mikrobiellen Population über halbfeste Oberflächen ist.
Die Substratviskosität beeinflusst die bakterielle Motilität; Studien an pathogenen Mikroben wie Helicobacter pylori haben gezeigt, dass sich die Motilität des Erregers in Abhängigkeit von der Viskosität der Mucinschicht ändert, die durch die Versauerung der Umwelt im menschlichen Wirt beeinflusst wird6. Um diese Umgebungen zu replizieren, beschränken frühere Studien mit einer Agarkonzentration über 0,3% (w / v) die bakterielle Schwimmmotilität, um eine allmähliche Verschiebung in die Oberflächenschwärme zu bewirken. Die Verwendung einer Agarkonzentration über 1% (w/v) verhindert die Schwarmmotilität vieler Arten7. Die auf der Oberfläche gebildeten Koloniemuster sind vielfältig, darunter featureless mat8, bull's eye9, Dendrites10 und vortex11.
Obwohl die Relevanz solcher Muster unklar bleibt, scheinen diese Muster von umweltbedingten und chemischen Hinweisen abhängig zu sein12. Umwelthinweise decken verschiedene Aspekte ab, einschließlich Temperatur, Salzgehalt, Licht und pH-Wert, während chemische Hinweise das Vorhandensein von mikrobiellen Quorum Sensing-Molekülen, biochemischen Nebenprodukten und Nährstoffen umfassen. Autoinduktor-Quorum-Sensing-Signalmoleküle wie AHL (N-Hexanoyl-L-Homoserinlacton) können das Schwärmen der Oberfläche beeinflussen, indem sie die Produktion von Tensid regulieren13,14. Resveratrol, eine Phytoalexinverbindung, könnte die Motilität des bakteriellen Schwärmens einschränken15.
In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir die Wirkung von Gradientenkonzentrationen von Resveratrol auf den Wildtyp-Escherichia coli K12-Stamm und untersuchen die Arabinose-induzierbare Schwarmmotilität von technisch hergestellten E. coli K12-YdeH- und Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-Arten. Die Produktion des YdeH-Enzyms wird durch Arabinose über den araBAD-Promotor induziert, was zu einer zellulären c-di-GMP-Störung führt und die bakterielle Schwarmmotilität beeinflusst16,17. Dieses induzierbare Schwarmverhalten wird unter Verwendung von Arabinose-Gradienten-Schwarmplatten mit E. coli K12-YdeH- und P. aeruginosa PAO1-YdeH-Stämmen untersucht.
Die Gradientenschwarmplatten werden durch sukzessives Erstarren von doppellagigem Medium hergestellt (Abbildung 1B). Die untere Schicht besteht aus dem mit dem Induktor hinzugefügten Medium, das auf eine Seite einer abgestützten Petrischale gegossen wird. Nach dem Erstarren der unteren Schicht wird die Petrischale auf eine ebene Oberfläche zurückgeführt, wobei die obere Schicht, die das Medium ohne den Induktor enthält, von der anderen Seite der Platte hinzugefügt wird. Nachdem die Schwarmplatten vollständig verfestigt sind, werden isometrisch angeordnete Haltebrunnen erzeugt, indem Löcher auf die Schwarmplatten nach einem festen Layout gebohrt werden (Abbildung 1C) oder indem die Vertiefungen mit einem 3D-gedruckten Modell der Plattenabdeckung, die Stifte enthält, während des mittleren Aushärtungsprozesses bedruckt werden (Ergänzende Abbildung S1). Ein Gelbildgebungssystem wird verwendet, um die Schwarmmorphologien zu verschiedenen Zeitpunkten zu erfassen (Abbildung 2). Die Analyse des Oberflächenschwärmens mit der ImageJ-Software (Supplemental Figure S2) liefert quantitative Ergebnisse des Oberflächenschwarmprozesses (Abbildung 3).
Daher schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Motilität des Oberflächenschwärmens innerhalb eines Konzentrationsbereichs von Induktoren zu testen. Diese Methode kann verwendet werden, um mehrere Konzentrationsreaktionen anderer Induktoren zu testen, indem der Induktor in das Medium der unteren Schicht gemischt wird, und kann auf andere bewegliche Spezies (z. B. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica) angewendet werden. Dieser Ansatz könnte zuverlässige qualitative und quantitative Ergebnisse für das Screening eines einzelnen chemischen Induktors liefern, und separate Platten können verwendet werden, um mehr chemische Induktoren zu bewerten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

Die bakterielle Schwarmmotilität ist ein häufiger mikrobiologischer Phänotyp, den Bakteriengemeinschaften verwenden, um über halbfeste Oberflächen zu wandern. Bei Untersuchungen der induzierten Schwarmmotilität ist die spezifische Konzentration eines Induktors möglicherweise nicht in der Lage, Ereignisse zu melden, die innerhalb des optimalen Konzentrationsbereichs auftreten, um die gewünschten Reaktionen einer Spezies hervorzurufen. Halbfeste Platten, die mehrere Konzentrationen enthalten, werden üblicherweise verwendet, um die Reaktion innerhalb eines Induktorkonzentrationsbereichs zu untersuchen. Separate halbfeste Platten erhöhen jedoch die Schwankungen der mittleren Viskosität und des Feuchtigkeitsgehalts innerhalb jeder Platte aufgrund der ungleichmäßigen Erstarrungszeit.
Dieses Papier beschreibt eine einstufige Methode zum gleichzeitigen Testen der Motilität des Oberflächenschwärmens auf einer einzelnen Gradientenplatte, wobei die isometrisch angeordneten Testvertiefungen die gleichzeitige Erfassung von Multikonzentrationsreaktionen ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Oberflächenschwärme von Escherichia coli K12 und Pseudomonas aeruginosa PAO1 als Reaktion auf einen Konzentrationsgradienten von Induktoren wie Resveratrol und Arabinose untersucht. In regelmäßigen Abständen wurden die Schwarmmorphologien mit einem Bildgebungssystem abgebildet, um den gesamten Oberflächenschwarmprozess zu erfassen.
Die quantitative Messung der Schwarmmorphologien wurde mit der ImageJ-Software erfasst und lieferte analysierbare Informationen über das Schwarmgebiet. Dieses Papier stellt eine einfache Gradientenschwarmplattenmethode vor, die qualitative und quantitative Informationen über die Auswirkungen der Induktoren auf die Oberflächenschwärme liefert, die erweitert werden können, um die Auswirkungen anderer Induktoren auf ein breiteres Spektrum beweglicher Bakterienarten zu untersuchen.

Der Arbeitsablauf, bestehend aus der Vorbereitung von Gradientenschwarmplatten, Impfung und Inkubation, ist in Abbildung 1B dargestellt. Um Gradientenschwimmplatten zu erzeugen, wird das Medium der unteren Schicht bei ~4,3° von der horizontalen Ebene in abgestützte Schalen gegossen (Ergänzende Abbildung S3), gefolgt von dem Gießen des oberen Schichtmediums, nachdem die untere Schicht vollständig erstarrt ist. Die Zusammensetzung des zweischichtigen Mediums ist in <stron...

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Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Hier beschreiben wir die Verwendung von Induktorgradientenplatten, um die Motilität des bakteriellen Schwarms zu bewerten und gleichzeitig mehrere Konzentrationsreaktionen zu erhalten.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Das Protokoll verfolgt gleichzeitig bakterielle Schwarmreaktionen auf unterschiedliche Induktorkonzentrationen auf einem halbfesten Agar. Dies wird kostengünstig erreicht. Diese Hochdurchsatz-Screening-Technik macht die Notwendigkeit von Agar mit verschiedenen Induktorkonzentrationen zur Beobachtung der mikrochemotaktischen Reaktionen zunichte.Die Technik ist für das Wirkstoff-Screening und auch zur Beobachtung der mikropathogenen SD-Reaktionen konzipiert. Es kann auch verwendet werden, um Mikroreaktionen auf verschiedene biochemische Hinweise im menschlichen Wirt zu untersuchen. Diese Methode kann einen Einblick in die bakterielle Chemotaxis geben.Bakterien reagieren auf verschiedene Konzentrationen von chemischen Lockstoffen, die als positive Chemotaxis oder chemische Repellentien bekannt sind, die als negative Chemotaxis bekannt sind. Ein sorgfältig vorbereiteter Aufbau ist unerlässlich, um Abweichungen zwischen dem Gelwinkel der unteren Schicht zu vermeiden, um das Reproduzierbarkeitsproblem zu vermeiden. Beschriften Sie zunächst 13 x 13 Zentimeter große quadratische Petrischalen mit Flecken und Induktornamen.Dann stützen Sie das Geschirr über den Rand der Deckel. Fügen Sie Arabinoselösung zu warmem Bodenschichtmedium hinzu. Fügen Sie 40 Milliliter warmes unteres Schichtmedium hinzu.Lassen Sie das untere Schichtmedium eine Stunde lang unbedeckt in einer Laminar-Flow-Haube ungestört aushärten. Sobald die untere Schicht vollständig erstarrt ist, entfernen Sie die Deckel und legen Sie die Petrischalen in eine Laminar-Flow-Haube. Fügen Sie 40 Milliliter warmes Oberschichtmedium mit einem motorisierten Pipettenfilter hinzu.Die doppellagigen Platten abgedeckt und ungestört eine Stunde lang aushärten und dann 24 Stunden bei vier Grad Celsius lagern. Legen Sie das markierte A4-Papier unter eine gut verfestigte Verlaufsplatte. Schieben Sie die breitere Seite einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze an der markierten Position in die halbfeste mittlere Oberfläche und drücken Sie die Pipettenspitze, bis sie den Boden des oberen Schichtmediums erreicht.Wenn die Spitze den Boden berührt, hören Sie auf, vertikale Kraft auf die Spitze auszuüben, und drehen Sie die Spitze vorsichtig, um den Inhalt des zylindrischen Brunnens zu isolieren. Bewegen Sie die Pipettenspitze horizontal in einem kleinen Abstand, um den Luftstrom in den schmalen Platz zu ermöglichen. Drücken Sie die Spitze mit dem Zeigefinger, um den Gasfluss in der Spitze zu blockieren.Ziehen Sie die Spitze vertikal heraus und halten Sie den Brunneninhalt in der Spitze, während Sie ihn herausziehen. Fügen Sie 80 Mikroliter der Übernachtwachstumskultur in jedes Bohrloch hinzu. Nehmen Sie die Schwarmplatten alle 12 Stunden nacheinander aus dem Inkubator und legen Sie sie in das Gelbildgebungssystem.Wählen Sie den Gelbildgebungsmodus, setzen Sie die Schwarmplatte weißem Licht aus und passen Sie die Brennweite an, um eine klare Sicht auf Schwärme zu erhalten. Verbessern Sie die Helligkeit der Schwärme für eine präzise Beobachtung, indem Sie die Belichtungszeit auf 300 Millisekunden einstellen. Passen Sie den Schwellenwert an, um Störungen durch das Hintergrundlicht zu minimieren.Speichern Sie die Bilddatei zur weiteren Analyse. Notieren Sie die Abbildungszeit, den Induktortyp, die Verlaufsausrichtung und die Dehnungen in einer txt-Datei. Klicken Sie auf "Verarbeiten" und dann auf "Schatten", um die Schärfe des Bildes zu verbessern.Klicken Sie auf Prozess, gefolgt von Batch, um das Bild zu verarbeiten. Verarbeiten Sie dann ein Bild als Referenz, indem Sie auf Prozess, Schatten und Süden klicken. Klicken Sie auf Prozess, Stapel, Makro, um das Fenster Stapelverarbeitungsprozess zu öffnen.Suchen Sie nach den Befehlen, die im Fenster angezeigt werden. Geben Sie die Ordneradresse der Originalbilder in die Adresse der Ausgabedatei ein, indem Sie im Fenster Stapelverarbeitung auf Verarbeiten klicken. Verwenden Sie das Zauberstab-Nachlaufwerkzeug, um Schwärme einzeln auszuwählen, und doppelklicken Sie auf das Zauberstab-Nachlaufwerkzeug, um die Toleranz anzupassen, bis die erzeugte Linie korrekt zur Schwarmgrenze passt.Klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen, um den Flächenwert zu exportieren. E.coli K12 YdeH wurde auf Arabinose-Gradientenplatten getestet, die verwendet wurden, um den Oberflächenschwarmprozess mit Überlappung zwischen benachbarten Bohrlöchern zu demonstrieren. Eine Platte mit drei Testvertiefungen ermöglichte die Bildung von nicht überlappenden Grenzen.P.aeruginosa PAO1 YdeH Schwarmmotilität wurde mit erhöhter Arabinosekonzentration von der niedrigsten Konzentration gefördert, aber allmählich mit höheren Konzentrationen Arabinose-Konzentrationen eingeschränkt. E.coli K12 Wildtyp-Stämme, die auf Resveratrol-Gradientenplatten im Konzentrationsbereich von null bis 400 Mikrolitern getestet wurden, zeigten eine moderate Einschränkung der Schwarmmotilität mit zunehmender Resveratrol-Konzentration. Schwarmflächen wurden von der ImageJ-Software quantifiziert.Die Schwarmkurve zeigte die multiplen Konzentrationsreaktionen an. Der wichtigste Teil dieses Verfahrens ist die Herstellung einer zweilagigen Schwarmplatte mit einem bestimmten Konzentrationsbereich von Induktoren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, das induzierte Oberflächenschwärmen innerhalb eines bestimmten Konzentrationsbereichs zu untersuchen und die Auswirkungen anderer Induktoren und Komponenten auf das Schwärmen zu quantifizieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Ein planarischer Motilitätstest zur Messung der biomodulierenden Eigenschaften natürlicher Produkte

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...