Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

פיתוח טכניקה זו נתמך על ידי הכספים מתוכנית המו"פ הלאומית של משרד המדע והטכנולוגיה (2018YF0902604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של קרן המחקר של סין למדענים צעירים בינלאומיים (22050410270) ומכוני שנזן לקרנות חיצוניות טכנולוגיות מתקדמות (DWKF20190001). ברצוננו להביע את תודתנו הכנה למיס צ'ן שינאי על עזרתה בגיהיית המסמך וניהול המעבדה.

1. הכנת לוחות נחיל הדרגתיים
<ol><li>הכנת מדיום נחיל הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת השוואה קצרה של צמיגות בינונית שונה; 0.7% (w / v) ריכוז אגר של מדיום נחיל שימש בפרוטוקול זה.<ol>
<li>להכין אבקת מרק Lysogeny (LB) עם אגר בשני בקבוקונים חרוטיים; כל בקבוק מכיל 2 גרם טריפטון, 2 גרם של נתרן כלורי, 1 גרם של תמצ?...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

חקירה של תנועתיות נחיל חיידקים על לוחות הדרגתיים חצי-אולידים יכולה להיות משימה מאתגרת 18,19,20, שכן היא כוללת גורמים רבים כגון צמיגות מצע, לחות ורכיבים בינוניים. בין גורמים אלה, ריכוז אגר ממלא תפקיד מכריע בקביעת חזרה מיקרוביאלית לשחייה או תנ?...

תנועתיות נוהרת חיידקית מתייחסת להגירה קולקטיבית של תאים חיידקיים על פני השטח של חומר. בנוסף לוחות אגר semisolid שהוכנו במיוחד במעבדה1, פנוטיפ זה נצפה גם על כמה מצעים רכים כגון רקמות בעלי חיים2, משטחים hydrated3, ושורשי צמחים4. בעוד משטח חצי-סוליד נחשב לאחד התנאים הבסיסיים עבור נחיל חיידקים, מינים מסוימים דורשים גם מדיום עשיר באנרגיה כדי לתמוך תנועתיות הנוהרת שלהם5. סיבוב פלאגלה מפעיל הן שחייה והן שחיית תנועתיות שורצת מתאר את תנועתיות חד-תאית בתוך סביבה נוזלית, ואילו נחיל הוא תנועה סינכרונית של אוכלוסייה מיקרוביאלית על פני משטחים חצי-קוליים.
צמיגות מצע משפיעה על תנועתיות חיידקים; מחקרים של חיידקים פתוגניים, כגון הליקובקטר פילורי, הראו כי תנועתיות הפתוגן משתנה בהתאם לצמיגות שכבת המוצין, המושפעת מהחמצה סביבתית במארח האנושי6. כדי לשכפל סביבות אלה, מחקרים קודמים באמצעות ריכוז אגר מעל 0.3% (w / v) להגביל תנועתיות שחייה חיידקית כדי לבצע שינוי הדרגתי לתוך נחיל פני השטח. השימוש בריכוז אגר מעל 1% (w / v) מונע את תנועתיות נחיל של מינים רבים7. דפוסי המושבה הנוצרים על פני השטח הם מגוונים, כולל mat8 ללא תכונות, עין שור9, dendrites10, ו מערבולת11.
למרות הרלוונטיות של דפוסים כאלה עדיין לא ברור, דפוסים אלה נראים תלויים רמזים סביבתיים וכימיים12. רמזים סביבתיים מכסים היבטים שונים, כולל טמפרטורה, מליחות, אור ו- pH, ואילו רמזים כימיים כוללים נוכחות של מולקולות חישת מניין מיקרוביאלי, תוצרי לוואי ביוכימיים וחומרים מזינים. מולקולות איתות של מניין Autoinducer כגון AHL (לקטון הומוסרין N-hexanoyl-L) יכול להשפיע על נחיל פני השטח על ידי ויסות הייצור של פעילי שטח13,14. רזברטרול, תרכובת פיטואלקסין, יכול להגביל תנועתיות נחיל חיידקים15.
בעבודה הנוכחית, אנו חוקרים את ההשפעה של ריכוזים הדרגתיים של רזברטרול על סוג בר Escherichia coli K12 זן ולחקור תנועתיות נחיל arabinose-inducable של מהונדס E. coli K12-YdeH ו Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH מינים. הייצור של האנזים YdeH מושרה על ידי arabinose באמצעות מקדם araBAD, וכתוצאה מכך הפרעה c-di-GMP הסלולר והשפעה על תנועתיות נוהר חיידקים16,17. התנהגות נחיל בלתי ניתנת לחינוך זו נחקרת באמצעות לוחות נחיל הדרגתיים arabinose עם E. coli K12-YdeH ו P. aeruginosa PAO1-YdeH זנים.
לוחות הנחיל ההדרגתיים מוכנים על-ידי מיצוק רציף של מדיום דו-שכבתי (איור 1B). השכבה התחתונה כוללת את המדיום שנוסף עם הממריץ, שנמזג על צד אחד של צלחת פטרי. עם התגבשות השכבה התחתונה, צלחת הפטרי מוחזרת למשטח שטוח, שם מוסיפים את השכבה העליונה המכילה את המדיום ללא הממריץ מהצד השני של הצלחת. לאחר שליחות הנחיל מתגמצמים לחלוטין, בארות ההחזקה המסודרות באופן איזומטרי מיוצרות על ידי חורים משעממים בלוחות הנחיל לאחר פריסה קבועה (איור 1C) או על ידי הטבעת הבארות באמצעות דגם מודפס תלת-ממדי של כיסוי הלוח המכיל יתדות במהלך תהליך הריפוי הבינוני (איור S1 משלים). מערכת דימות ג'ל משמשת ללכידת המורפולוגיות הנוהרות בנקודות זמן שונות (איור 2). ניתוח נחיל פני השטח באמצעות תוכנת ImageJ (איור S2 משלים) מספק תוצאות כמותיות של תהליך נחיל פני השטח (איור 3).
לכן, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי לבדוק את תנועתיות נחיל פני השטח בתוך טווח ריכוז של ממריצים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבדוק תגובות ריכוז מרובות של ממריצים אחרים על ידי ערבוב הממריץ למדיום השכבה התחתונה והוא יכול להיות מיושם על מינים אחרים של רגש (למשל, Bacillus subtilis, סלמונלה enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). גישה זו יכולה לספק תוצאות איכותיות וכמותיות אמינות להקרנת ממריץ כימי יחיד, וניתן להשתמש בלוחות נפרדים כדי להעריך יותר ממריצים כימיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

תנועתיות נוהרת חיידקית היא פנוטיפ מיקרוביולוגי נפוץ שקהילות חיידקים משתמשות בו כדי לנדוד על פני משטחים חצי-קוליים. בחקירות של תנועתיות נחיל המושרה, ריכוז ספציפי של ממריץ לא יוכל לדווח על אירועים המתרחשים בטווח הריכוז האופטימלי כדי לעורר את התגובות הרצויות ממין. לוחות semisolid המכילים ריכוזים מרובים משמשים בדרך כלל כדי לחקור את התגובה בתוך טווח ריכוז ממריץ. עם זאת, לוחות חצי-סוליד נפרדים מגבירים את הווריאציות בצמיגות בינונית ובתכולת לחות בתוך כל צלחת עקב זמן התגבשות לא יוניפורמי.
מאמר זה מתאר שיטה חד-שלבית לבדיקת תנועתיות נוהרת משטח בו זמנית על צלחת הדרגתית אחת, שבה בארות הבדיקה המסודרות באופן איזומטרי מאפשרות רכישה סימולטנית של תגובות רב-מרכזיות. בעבודה הנוכחית, נחיל פני השטח של Escherichia coli K12 ו Pseudomonas aeruginosa PAO1 הוערכו בתגובה שיפוע ריכוז של ממריצים כגון רזברטרול ו arabinose. מעת לעת, המורפולוגיות של הנחיל צולמו באמצעות מערכת הדמיה כדי ללכוד את כל תהליך נחיל פני השטח.
המדידה הכמותית של מורפולוגיות הנחיל נרכשה באמצעות תוכנת ImageJ, המספקת מידע ניתן לניתוח של אזור הנחיל. מאמר זה מציג שיטת לוח נחיל שיפוע פשוט המספקת מידע איכותי וכמותי על ההשפעות של הממריצים על נחיל פני השטח, אשר ניתן להרחיב כדי ללמוד את ההשפעות של ממריצים אחרים על מגוון רחב יותר של מינים חיידקיים רגש.

זרימת העבודה המורכבת מהכנת לוחות נחיל הדרגתיים, חיסון ודגרה מוצגת באיור 1B. כדי ליצור לוחות שחייה הדרגתיים, המדיום של השכבה התחתונה נשפך לתוך כלים נפוחים ב~4.3° מהמישור האופקי (איור S3 משלים), ולאחר מכן שופך את המדיום של השכבה העליונה לאחר שהשכבה התחתונה מתגובקת לחלוט...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.

כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

הפרוטוקול עוקב בו זמנית אחר תגובות נוהרות חיידקים לריכוזים שונים של ממריצים על אגר חצי-סולידי. זה מושג בצורה חסכונית. טכניקת סינון תפוקה גבוהה זו שוללת את הצורך של אגר עם ריכוזי ממריצים שונים כדי לבחון את התגובות המיקרו-כימוטקטיות.הטכניקה מיועדת להקרנת סמים וגם להתבונן בתגובות המיקרופתוגן SD. כמו כן, זה יכול לשמש כדי ללמוד microresponses רמזים ביוכימיים שונים בפונדקאי האנושי. שיטה זו יכולה לספק תובנה על כימוטקסיס חיידקי.חיידקים יגיבו לריכוזים שונים של מושכים כימיים המכונים כימוטקסיס חיובי או דוחה כימי המכונה כימוטקסיס שלילי. הגדרה מוכנה בקפידה היא חיונית כדי למנוע וריאציות בין זווית הג'ל של השכבה התחתונה כדי למנוע את בעיית הרבייה. בתור התחלה, תווית 13 על 13 ס"מ מרובע פטרי מנות עם כתמים ושמות ממריצים.ואז להצמיד את הכלים מעל קצה המכסים. הוסיפו את תמיסת arabinose למדיום השכבה התחתונה החמה. מוסיפים 40 מיליליטר של שכבה תחתונה חמה בינונית.אפשרו למדיום השכבה התחתונה לרפא שנחשף במשך שעה אחת בתוך מכסה מנוע זרימה למינארי ללא הפרעה. לאחר שהשכבה התחתונה מתגבשת לחלוטין, הסירו את המכסים והניחו את צלחות הפטרי בתוך מכסה מנוע זרימה למינארי. מוסיפים 40 מיליליטר של מדיום שכבה עליונה חמה באמצעות מסנן פיפטה ממונע.לרפא את לוחות השכבה הכפולה מכוסה ללא הפרעה במשך שעה אחת, ולאחר מכן לאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מניחים את נייר ה- A4 המסומן מתחת ללוח הדרגתי ממוצק היטב. דחפו את הצד הרחב יותר של קצה פיפטה של 100 מיקרוליטר למשטח הבינוני למחצה במיקום המסומן ולחצו על קצה הפיפטה עד שהוא מגיע לתחתית המדיום של השכבה העליונה.כאשר הקצה נוגע בתחתית, הפסק להפעיל כל כוח אנכי על הקצה וסובב בעדינות את הקצה כדי לבודד את התוכן של הבאר הגלילית. הזיזו אופקית את קצה הפיפטה לאורך מרחק קטן כדי לאפשר זרימת אוויר למקום הצר המופרש בצד. לחץ על הקצה עם האצבע המורה כדי לחסום את זרימת הגז בתוך הקצה.משוך את הקצה החוצה אנכית, שמירה על תוכן הבאר בקצה תוך משיכתו החוצה. הוסף 80 מיקרוליטרים של תרבות הצמיחה הלילית לכל באר. הוציאו את צלחות הנחיל מהחממה אחת בכל פעם כל 12 שעות והניחו אותן במערכת ההדמיה של הג'ל.בחר מצב הדמיה ג'ל, לחשוף את צלחת הנחיל לאור לבן, ולהתאים את אורך המוקד כדי לקבל תצוגה ברורה של נחילים. שפר את הבהירות של הנחילים לתצפית מדויקת על ידי התאמת זמן החשיפה ל-300 אלפיות השנייה. התאם את הסף כדי למזער הפרעות מנורית הרקע.שמור את קובץ התמונה לניתוח נוסף. הקלט את זמן ההדמיה, את סוג הממריץ, את כיוון מעבר הצבע ואת הזנים בקובץ txt. לחץ על עבד ולאחר מכן על צללים כדי לשפר את חדות התמונה.לחץ על תהליך ואחריו אצווה כדי לעבד את התמונה. לאחר מכן עבד תמונה כהפניה על-ידי לחיצה על תהליך, צללים ודרום. לחץ על תהליך, אצווה, מאקרו כדי לפתוח את החלון תהליך אצווה.חפש את הפקודות המוצגות בחלון. הקלד את כתובת התיקיה של התמונות המקוריות בכתובת קובץ הפלט על-ידי לחיצה על תהליך בחלון תהליך אצווה. השתמש בכלי מעקב השרביט כדי לבחור נחילים בנפרד ולחץ פעמיים על כלי עקיבת השרביט כדי להתאים את הסבילות עד שהקו שנוצר יתאים כראוי לגבול הנחיל.לחץ על נתח ולאחר מכן מדוד כדי לייצא את ערך האזור. E.coli K12 YdeH נבדק על לוחות הדרגתיים arabinose המשמשים להדגמת תהליך נחיל פני השטח עם חפיפה המתרחשת בין בארות סמוכות. צלחת עם שלוש בארות בדיקה אפשרה היווצרות של גבולות שאינם חופפים.תנועתיות נחיל P.aeruginosa PAO1 YdeH קודמה עם ריכוז ערבינוז מוגבר מהריכוז הנמוך ביותר, אך הוגבלה בהדרגה עם ריכוזים גבוהים יותר של ערבינוז. E.coli K12 זני סוג בר נבדקו על לוחות הדרגתיים רזברטרול בתוך טווח ריכוז אפס עד 400 מיקרוליטר הראה הגבלה צנועה של תנועתיות נוהר עם ריכוז רזברטרול גובר. אזורי נחיל היו כימותו על ידי תוכנת ImageJ.עקומת הנחיל הציגה את תגובות הריכוז המרובות. החלק המכריע ביותר של הליך זה הוא ייצור צלחת נחיל שכבה כפולה עם טווח ריכוז מסוים של ממריצים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את פני השטח המושרים בתוך טווח ריכוז מסוים ולכמת את ההשפעות של ממריצים ורכיבים אחרים על נחיל.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...