Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
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Lo sviluppo di questa tecnica è stato supportato dai fondi del piano di ricerca e sviluppo nazionale chiave del Ministero della Scienza e della Tecnologia (2018YF0902604), della National Natural Science Foundation del Fondo di ricerca cinese per giovani scienziati internazionali (22050410270) e dei fondi esterni degli Shenzhen Institutes of Advanced Technology (DWKF20190001). Vorremmo offrire la nostra sincera gratitudine alla signorina Chen Xinyi per la sua assistenza nella revisione del documento e nella gestione del laboratorio.

1. Preparazione delle piastre dello sciame gradiente
<ol><li>Preparazione dello sciame medio NOTA: Vedere la sezione di discussione per un breve confronto tra diverse viscosità medie; In questo protocollo è stata utilizzata una concentrazione di agar dello 0,7% (p/v) di mezzo sciame.<ol>
<li>Preparare il brodo di lisogenia (LB) in polvere con agar in due palloni conici; ogni pallone contiene 2 g di triptone, 2 g di cloruro di sodio, 1 g di estratto di lievito e 1,4 g di agar. Aggiungere acqua a do...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

Lo studio della motilità dello sciame batterico su piastre a gradiente semisolido può essere un compito impegnativo18,19,20, in quanto coinvolge molteplici fattori come la viscosità del substrato, l'umidità e i componenti medi. Tra questi fattori, la concentrazione di agar svolge un ruolo decisivo nel determinare la reversione microbica alla motilità del nuoto o dello sciame. Man mano che la concentrazione di agar aumenta d...

La motilità dello sciame batterico si riferisce alla migrazione collettiva delle cellule batteriche attraverso la superficie di una sostanza. Oltre alle piastre di agar semisolide appositamente preparate in laboratorio1, questo fenotipo si osserva anche su alcuni substrati molli come tessuti animali2, superfici idratate3 e radici vegetali4. Mentre una superficie semisolida è considerata una delle condizioni fondamentali per lo sciame batterico, alcune specie richiedono anche un mezzo ricco di energia per supportare la loro motilità dello sciame5. La rotazione dei flagelli alimenta sia il nuoto che lo sciame motilità: il nuoto descrive la motilità unicellulare all'interno di un ambiente liquido, mentre lo sciame è il movimento sincrono di una popolazione microbica su superfici semisolide.
La viscosità del substrato influenza la motilità batterica; studi su microbi patogeni, come l'Helicobacter pylori, hanno dimostrato che la motilità del patogeno cambia a seconda della viscosità dello strato di mucina, che è influenzata dall'acidificazione ambientale nell'ospite umano6. Per replicare questi ambienti, studi precedenti che utilizzavano una concentrazione di agar superiore allo 0,3% (p / v) limitano la motilità del nuoto batterico per effettuare un graduale spostamento nello sciame superficiale. L'uso di concentrazioni di agar superiori all'1% (p/v) previene la motilità brulicante di molte specie7. I modelli di colonie formati sulla superficie sono diversi, tra cui mat8 senza caratteristiche, occhio di bue9, dendrites10 e vortex11.
Sebbene la rilevanza di tali modelli rimanga poco chiara, tali modelli sembrano dipendere da segnali ambientali e chimici12. I segnali ambientali coprono diversi aspetti, tra cui temperatura, salinità, luce e pH, mentre i segnali chimici includono la presenza di molecole microbiche di quorum sensing, sottoprodotti biochimici e sostanze nutritive. Molecole di segnalazione con quorum sensing autoinduttore come AHL (N-esanolo-L omoserina lattone) possono avere un impatto sullo sciame superficiale regolando la produzione di tensioattivo13,14. Il resveratrolo, un composto fitoalessico, potrebbe limitare la motilità dello sciame batterico15.
Nel presente lavoro, studiamo l'effetto delle concentrazioni di gradiente di resveratrolo sul ceppo Escherichia coli K12 di tipo selvatico e studiamo la motilità dello sciame inducibile dall'arabinosio delle specie ingegnerizzate E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La produzione dell'enzima YdeH è indotta dall'arabinosio attraverso il promotore araBAD, con conseguente perturbazione cellulare c-di-GMP e influenza la motilità dello sciame batterico16,17. Questo comportamento di sciame inducibile è studiato utilizzando piastre di sciame a gradiente di arabinosio con ceppi di E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Le piastre dello sciame gradiente vengono preparate solidificando successivamente il mezzo a doppio strato (Figura 1B). Lo strato inferiore comprende il mezzo aggiunto con l'induttore, versato su un lato di una capsula di Petri appoggiata. Dopo la solidificazione dello strato inferiore, la capsula di Petri viene restituita a una superficie piana, dove lo strato superiore contenente il mezzo senza l'induttore viene aggiunto dall'altro lato della piastra. Dopo che le piastre dello sciame sono state completamente solidificate, i pozzetti di tenuta disposti isometricamente vengono prodotti perforando i fori sulle piastre dello sciame seguendo un layout fisso (Figura 1C) o imprimendo i pozzetti utilizzando un modello stampato in 3D del coperchio della piastra contenente pioli durante il processo di polimerizzazione media (Figura supplementare S1). Un sistema di imaging su gel viene utilizzato per catturare le morfologie dello sciame in diversi punti temporali (Figura 2). L'analisi dello sciame superficiale utilizzando il software ImageJ (Figura supplementare S2) fornisce risultati quantitativi del processo di sciame superficiale (Figura 3).
Pertanto, proponiamo un metodo semplice per testare la motilità dello sciame superficiale all'interno di un intervallo di concentrazione di induttori. Questo metodo può essere utilizzato per testare risposte di concentrazione multiple di altri induttori mescolando l'induttore nel mezzo dello strato inferiore e può essere applicato ad altre specie mobili (ad esempio, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Questo approccio potrebbe fornire risultati qualitativi e quantitativi affidabili per lo screening di un singolo induttore chimico e possono essere utilizzate piastre separate per valutare più induttori chimici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

La motilità dello sciame batterico è un fenotipo microbiologico comune che le comunità batteriche usano per migrare su superfici semisolide. Nelle indagini sulla motilità dello sciame indotto, la concentrazione specifica di un induttore potrebbe non essere in grado di segnalare eventi che si verificano entro l'intervallo di concentrazione ottimale per suscitare le risposte desiderate da una specie. Le piastre semisolide contenenti concentrazioni multiple sono comunemente usate per studiare la risposta all'interno di un intervallo di concentrazione dell'induttore. Tuttavia, le piastre semisolide separate aumentano le variazioni della viscosità media e del contenuto di umidità all'interno di ciascuna piastra a causa del tempo di solidificazione non uniforme.
Questo documento descrive un metodo in un'unica fase per testare contemporaneamente la motilità dello sciame superficiale su una singola piastra a gradiente, in cui i pozzetti di prova disposti isometricamente consentono l'acquisizione simultanea di risposte multiconcentranti. Nel presente lavoro, lo sciame superficiale di Escherichia coli K12 e Pseudomonas aeruginosa PAO1 è stato valutato in risposta a un gradiente di concentrazione di induttori come il resveratrolo e l'arabinosio. Periodicamente, le morfologie dello sciame sono state fotografate utilizzando un sistema di imaging per catturare l'intero processo di sciame superficiale.
La misurazione quantitativa delle morfologie dello sciame è stata acquisita utilizzando il software ImageJ, fornendo informazioni analizzabili dell'area dello sciame. Questo documento presenta un semplice metodo di piastra a sciame a gradiente che fornisce informazioni qualitative e quantitative sugli effetti degli induttori sullo sciame superficiale, che può essere esteso per studiare gli effetti di altri induttori su una gamma più ampia di specie batteriche mobili.

Il flusso di lavoro costituito dalla preparazione di piastre di sciame gradienti, inoculazione e incubazione è mostrato nella Figura 1B. Per generare piastre nuotate sfumate, il mezzo dello strato inferiore viene versato in piatti appoggiati a ~ 4,3 ° dal piano orizzontale (Figura supplementare S3), seguito dal versamento del mezzo dello strato superiore dopo che lo strato inferiore è stato completamente solidificato. La composizione del mezzo a doppio strato è mostrata ...

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Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Qui, descriviamo l'uso di piastre a gradiente induttore per valutare la motilità dello sciame batterico ottenendo contemporaneamente risposte di concentrazione multiple.

Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Il protocollo tiene traccia simultaneamente delle risposte dello sciame batterico a diverse concentrazioni di induttori su un agar semisolido. Ciò si ottiene in modo economicamente vantaggioso. Questa tecnica di screening ad alto rendimento annulla la necessità di agar con varie concentrazioni di induttori per osservare le risposte microchemiotattiche.La tecnica è progettata per lo screening farmacologico e anche per osservare le risposte SD micropatogene. Inoltre, può essere utilizzato per studiare microrisposte a vari segnali biochimici nell'ospite umano. Questo metodo può fornire informazioni sulla chemiotassi batterica.I batteri risponderanno a varie concentrazioni di attrattivi chimici noti come chemiotassi positiva o repellenti chimici noti come chemiotassi negativa. Un set up accuratamente preparato è essenziale per evitare variazioni tra l'angolo del gel dello strato inferiore per evitare il problema della riproducibilità. Per iniziare, etichettare 13 per 13 centimetri quadrati piastre di Petri con macchie e nomi di induttori.Quindi appoggiare i piatti oltre il bordo dei coperchi. Aggiungere la soluzione di arabinosio al mezzo caldo dello strato inferiore. Aggiungere 40 millilitri di medio strato inferiore caldo.Lasciare indisturbato il mezzo dello strato inferiore scoperto per un'ora all'interno di una cappa a flusso laminare. Una volta che lo strato inferiore è completamente solidificato, rimuovere i coperchi e posare le piastre di Petri all'interno di una cappa a flusso laminare. Aggiungere 40 millilitri di terreno caldo dello strato superiore utilizzando un filtro a pipetta motorizzato.Curare le piastre a doppio strato coperte e indisturbate per un'ora, quindi conservarle a quattro gradi Celsius per 24 ore. Posizionare la carta A4 contrassegnata sotto una piastra sfumata ben solidificata. Spingere il lato più ampio di una punta della pipetta da 100 microlitri nella superficie media semisolida nella posizione contrassegnata e premere la punta della pipetta fino a raggiungere il fondo del mezzo dello strato superiore.Quando la punta tocca il fondo, smettere di applicare qualsiasi forza verticale alla punta e ruotare delicatamente la punta per isolare il contenuto del pozzetto cilindrico. Spostare orizzontalmente la punta della pipetta lungo una piccola distanza per consentire il flusso d'aria nel luogo stretto messo da parte. Premere la punta con l'indice per bloccare il flusso di gas all'interno della punta.Estrarre la punta verticalmente, mantenendo il contenuto del pozzo nella punta mentre la si estrae. Aggiungi 80 microlitri della cultura della crescita notturna in ogni pozzo. Estrarre le piastre dello sciame dall'incubatrice una alla volta ogni 12 ore e inserirle nel sistema di imaging del gel.Selezionare la modalità di imaging su gel, esporre la piastra dello sciame alla luce bianca e regolare la lunghezza focale per ottenere una visione chiara degli sciami. Migliora la luminosità degli sciami per un'osservazione precisa regolando il tempo di esposizione a 300 millisecondi. Regolare la soglia per ridurre al minimo le interferenze provenienti dalla luce di sfondo.Salvare il file immagine per ulteriori analisi. Registrare il tempo di imaging, il tipo di induttore, l'orientamento del gradiente e i ceppi in un file txt. Fare clic su Elabora, quindi su Ombre per migliorare la nitidezza dell'immagine.Fare clic su Processo seguito da Batch per elaborare l'immagine. Quindi elaborare un'immagine come riferimento facendo clic su Elabora, Ombre e Sud. Fare clic su Elabora, Batch, Macro per aprire la finestra Processo batch.Cerca i comandi visualizzati nella finestra. Digitare l'indirizzo della cartella delle immagini originali nell'indirizzo del file di output facendo clic su Elabora nella finestra Processo batch. Utilizzate lo strumento di traccia della bacchetta per selezionare gli sciami singolarmente e fate doppio clic sullo strumento di traccia della bacchetta per regolare la tolleranza fino a quando la linea generata non si adatta correttamente al limite dello sciame.Fare clic su Analizza, quindi su Misura per esportare il valore dell'area. E.coli K12 YdeH è stato testato su piastre a gradiente di arabinosio utilizzate per dimostrare il processo di sciame superficiale con sovrapposizione che si verifica tra pozzi adiacenti. Una piastra con tre pozzetti di prova ha permesso la formazione di confini non sovrapposti.La motilità dello sciame di P.aeruginosa PAO1 YdeH è stata promossa con un aumento della concentrazione di arabinosio dalla concentrazione più bassa, ma gradualmente limitato con concentrazioni più elevate di arabinosio. I ceppi di tipo selvaggio di E.coli K12 testati su piastre a gradiente di resveratrolo entro l'intervallo di concentrazione da zero a 400 microliti hanno mostrato una modesta restrizione della motilità dello sciame con l'aumento della concentrazione di resveratrolo. Le aree dello sciame sono state quantificate dal software ImageJ.La curva dello sciame mostrava le risposte di concentrazione multiple. La parte più cruciale di questa procedura è la produzione di una piastra a sciame a doppio strato con un intervallo di concentrazione specifico di induttori. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare lo sciame superficiale indotto all'interno di uno specifico intervallo di concentrazione e di quantificare gli effetti di altri induttori e componenti sullo sciame.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

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