Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
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O desenvolvimento dessa técnica foi apoiado pelos recursos do plano Nacional de P&D do Ministério da Ciência e Tecnologia (2018YF0902604), da National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) e do Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Gostaríamos de oferecer nossa sincera gratidão à Srta. Chen Xinyi por sua ajuda na revisão do documento e da gestão laboratorial.

1. Preparação de placas de enxame de gradiente
<ol><li>Preparação do meio enxame NOTA: Consulte a seção de discussão para uma breve comparação de diferentes viscosidades médias; Neste protocolo foi utilizada concentração de 0,7% (c/v) de ágar do meio enxame.<ol>
<li>Preparar caldo de lysogeny (LB) em pó com ágar em dois frascos cônicos; cada frasco contém 2 g de triptona, 2 g de cloreto de sódio, 1 g de extrato de levedura e 1,4 g de ágar. Adicione água duplamente destilada (<sub...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

A investigação da motilidade bacteriana em placas de gradiente semisólidas pode ser uma tarefa desafiadora18,19,20, pois envolve múltiplos fatores como viscosidade substrato, umidade e componentes médios. Entre esses fatores, a concentração de ágar desempenha um papel decisivo na determinação da reversão microbiana à motilidade da natação ou do enxame. À medida que a concentração de ágar aumenta de 0,3% (w/v) p...

A motilidade bacteriana refere-se à migração coletiva de células bacterianas através da superfície de uma substância. Além das placas de ágar semisóidas especialmente preparadas em laboratório1, este fenótipo também é observado em alguns substratos macios, como tecidos animais2, superfícies hidratadas3 e raízes vegetais4. Embora uma superfície semisóida seja considerada uma das condições fundamentais para o enxame bacteriano, algumas espécies também requerem um meio rico em energia para apoiar sua motilidade em enxame5. A rotação flagela alimenta tanto a natação quanto a motilidade-natação infestada descreve a motilidade unicelular dentro de um ambiente líquido, enquanto o enxame é o movimento síncrona de uma população microbiana através de superfícies semisócidas.
A viscosidade substrato influencia a motilidade bacteriana; estudos de micróbios patogênicos, como Helicobacter pylori, mostraram que a motilidade do patógeno muda dependendo da viscosidade da camada de mucina, que é influenciada pela acidificação ambiental no hospedeiro humano6. Para replicar esses ambientes, estudos anteriores usando concentração de ágar acima de 0,3% (w/v) restringem a motilidade da natação bacteriana para efetuar uma mudança gradual no enxame de superfície. O uso da concentração de ágar acima de 1% (c/v) impede a motilidade de muitas espécies7. Os padrões da colônia formados na superfície são diversos, incluindo tapete sem características, olho de touro9, dendritos10 e vórtice11.
Embora a relevância desses padrões ainda não esteja clara, esses padrões parecem depender de pistas ambientais e químicas12. As pistas ambientais abrangem diferentes aspectos, incluindo temperatura, salinidade, luz e pH, enquanto as pistas químicas incluem a presença de moléculas sensoriais de quórum microbiano, subprodutos bioquímicos e nutrientes. O quórum de autoindutores que detectam moléculas de sinalização como a AHL (N-hexanoyl-L homoserina lactona) pode impactar o enxame de superfície, regulando a produção de surfactante13,14. Resveratrol, um composto de fitoalexina, poderia restringir a motilidade bacteriana 15.
No presente trabalho, investigamos o efeito das concentrações gradientes de resveratrol na cepa Escherichia coli K12 do tipo selvagem e investigamos a motilidade de enxame arabinose da espécie E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. A produção da enzima YdeH é induzida por arabinose através do promotor araBAD, resultando em perturbação c-di-GMP celular e afetando motilidade bacteriana 16,17. Este comportamento de enxame indutível é estudado usando placas de enxame de gradiente arabinose com cepas E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.
As placas de enxame de gradiente são preparadas solidificando sucessivamente o meio de dupla camada (Figura 1B). A camada inferior compreende o meio adicionado com o indutor, derramado em um lado de uma placa de Petri apoiada. Após a solidificação da camada inferior, a placa de Petri é devolvida a uma superfície plana, onde a camada superior contendo o meio sem o indutor é adicionada do outro lado da placa. Depois que as placas de enxame são completamente solidificadas, os poços de retenção isometricamente organizados são produzidos por furos chatos nas placas do enxame seguindo um layout fixo (Figura 1C) ou imprimindo os poços usando um modelo impresso em 3D da tampa da placa contendo pinos durante o processo de cura média (Figura Suplementar S1). Um sistema de imagem em gel é usado para capturar as morfologias em diferentes pontos de tempo (Figura 2). A análise do enxame de superfície usando o software ImageJ (Figura Suplementar S2) fornece resultados quantitativos do processo de enxame de superfície (Figura 3).
Assim, propomos um método simples para testar a motilidade de enxame de superfície dentro de uma faixa de concentração de indutores. Este método pode ser usado para testar múltiplas respostas de concentração de outros indutores misturando o indutor no meio de camada inferior e pode ser aplicado a outras espécies motile (por exemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Esta abordagem poderia fornecer resultados qualitativos e quantitativos confiáveis para a triagem de um único indutor químico, e placas separadas podem ser empregadas para avaliar mais indutores químicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

A motilidade bacteriana é um fenótipo microbiológico comum que as comunidades bacterianas usam para migrar sobre superfícies semisóidas. Em investigações de motilidade induzida, a concentração específica de um indutor pode não ser capaz de relatar eventos ocorridos dentro da faixa de concentração ideal para obter as respostas desejadas de uma espécie. Placas semisóidas contendo múltiplas concentrações são comumente usadas para investigar a resposta dentro de uma faixa de concentração de indutor. No entanto, placas semisóidas separadas aumentam as variações no teor médio de viscosidade e umidade dentro de cada placa devido ao tempo de solidificação não uniforme.
Este artigo descreve um método de uma etapa para testar simultaneamente a motilidade de enxame de superfície em uma única placa de gradiente, onde os poços de teste organizados isometricamente permitem a aquisição simultânea de respostas multiconcentração. No presente trabalho, o enxame superficial de Escherichia coli K12 e Pseudomonas aeruginosa PAO1 foram avaliados em resposta a um gradiente de concentração de indutores como resveratrol e arabinose. Periodicamente, as morfologias do enxame eram imagens usando um sistema de imagem para capturar todo o processo de enxame de superfície.
A medição quantitativa das morfologias do enxame foi adquirida por meio do software ImageJ, fornecendo informações analisáveis da área do enxame. Este artigo apresenta um método simples de placa de enxame gradiente que fornece informações qualitativas e quantitativas sobre os efeitos dos indutores sobre o enxame superficial, que podem ser estendidos para estudar os efeitos de outros indutores em uma gama mais ampla de espécies bacterianas motile.

O fluxo de trabalho constituído pela preparação de placas de enxame de gradiente, inoculação e incubação é mostrado na Figura 1B. Para gerar placas de nado gradiente, o meio de camada inferior é derramado em pratos apoiados a ~4,3° do plano horizontal (Figura Suplementar S3), seguido por derramar o meio de camada superior após a camada inferior ser completamente solidificada. A composição do meio de camada dupla é mostrada na Tabela 1. Em segui...

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Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Aqui, descrevemos o uso de placas de gradiente indutor para avaliar a motilidade bacteriana, ao mesmo tempo em que obstruindo múltiplas respostas de concentração.

Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

O protocolo rastreia simultaneamente respostas bacterianas a diferentes concentrações de indutores em um ágar semisólida. Isso é conseguido de forma econômica. Esta técnica de triagem de alto rendimento nega a necessidade de ágar com várias concentrações indutoras para observar as respostas microquimotacticas.A técnica foi projetada para triagem de medicamentos e também para observar as respostas do Micropatagen SD. Além disso, pode ser usado para estudar microresponsos a várias pistas bioquímicas no hospedeiro humano. Este método pode fornecer informações sobre quimiotaxis bacterianos.As bactérias responderão a várias concentrações de atrativos químicos conhecidos como quimitaxis positivos ou repelentes químicos conhecidos como quimiotaxis negativos. Uma configuração cuidadosamente preparada é essencial para evitar variações entre o ângulo de gel da camada inferior para evitar o problema de reprodubilidade. Para começar, rotule 13 por 13 centímetros quadrados de placas de Petri com manchas e nomes de indutores.Em seguida, apoie os pratos sobre a borda das tampas. Adicione a solução arabinose ao meio de camada inferior quente. Adicione 40 mililitros de meio de camada inferior quente.Deixe que o meio de camada inferior cure descoberto por uma hora dentro de um capô de fluxo laminar sem ser perturbado. Uma vez que a camada inferior esteja completamente solidificada, remova as tampas e coloque as placas de Petri dentro de um capô de fluxo laminar. Adicione 40 mililitros de meio de camada superior quente usando um filtro de pipeta motorizado.Cure as placas de camada dupla cobertas e imperturbáveis por uma hora, depois armazene-as a quatro graus Celsius por 24 horas. Coloque o papel A4 marcado sob uma placa de gradiente bem solidificada. Empurre o lado mais amplo de uma ponta de pipeta de 100 microliter para dentro da superfície média semisóida na posição marcada e pressione a ponta da pipeta até atingir a parte inferior do meio da camada superior.Quando a ponta tocar na parte inferior, pare de aplicar qualquer força vertical na ponta e gire suavemente a ponta para isolar o conteúdo do poço cilíndrico. Mova horizontalmente a ponta da pipeta a uma pequena distância para permitir o fluxo de ar para o lugar estreito reservado. Pressione a ponta com o dedo indicador para bloquear o fluxo de gás dentro da ponta.Puxe a ponta verticalmente, mantendo o bem conteúdo na ponta enquanto puxa-o para fora. Adicione 80 microliters da cultura de crescimento da noite para o dia em todos os poços. Tire as placas de enxame da incubadora uma de cada vez a cada 12 horas e coloque-as no sistema de imagem em gel.Selecione o modo de imagem em gel, exponha a placa do enxame à luz branca e ajuste a distância focal para obter uma visão clara dos enxames. Aumente o brilho dos enxames para observação precisa, ajustando o tempo de exposição a 300 milissegundos. Ajuste o limiar para minimizar a interferência da luz de fundo.Salve o arquivo de imagem para análise suplementar. Registo o tempo de imagem, o tipo de indutor, a orientação gradiente e as cepas em um arquivo txt. Clique em Process, em seguida, Sombras para melhorar a nitidez da imagem.Clique em Processo seguido de Batch para processar a imagem. Em seguida, processe uma imagem como referência clicando em Process, Shadows e South. Clique em Processar, Lote, Macro para abrir a janela Processo de lote.Procure os comandos exibidos na janela. Digite o endereço da pasta das imagens originais no endereço do arquivo de saída clicando em Processar na janela Processo de lote. Use a ferramenta de rastreamento de varinha para selecionar enxames individualmente e clique duas vezes na ferramenta de rastreamento de varinha para ajustar a tolerância até que a linha gerada se encaixe corretamente no limite do enxame.Clique em Analisar e, em seguida, Meça para exportar o valor da área. E.coli K12 YdeH foi testado em placas de gradiente arabinose usadas para demonstrar o processo de enxame de superfície com sobreposição ocorrendo entre poços adjacentes. Uma placa com três poços de teste permitiu a formação de limites não sobrepostos.P.aeruginosa PAO1 YdeH foi promovida com maior concentração arabinosa a partir da menor concentração, mas gradualmente restrita com maiores concentrações arabinosas. As cepas de tipo selvagem E.coli K12 testadas em placas gradientes de resveratrol dentro da faixa de concentração de microliter de zero a 400 microlitera mostraram uma restrição modesta da motilidade de enxame com crescente concentração de resveratrol. As áreas de enxame foram quantificadas pelo software ImageJ.A curva de enxame exibiu as múltiplas respostas de concentração. A parte mais crucial deste procedimento é a fabricação de uma placa de enxame de camada dupla com uma faixa de concentração específica de indutores. Este método permite que os pesquisadores investiguem a superfície induzida dentro de uma faixa de concentração específica e quantifiquem os efeitos de outros indutores e componentes no enxame.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Um ensaio planário de motilidade para medir as propriedades biomodulantes de produtos naturais

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Adaptações específicas de miose de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...