Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Разработка этой методики была поддержана средствами Национального ключевого плана исследований и разработок Министерства науки и технологий (2018YF0902604), Национального фонда естественных наук Китая, Исследовательского фонда для международных молодых ученых (22050410270) и Внешних фондов Шэньчжэньских институтов передовых технологий (DWKF20190001). Мы хотели бы выразить нашу искреннюю благодарность мисс Чэнь Синьи за ее помощь в корректуре документа и управлении лабораторией.

1. Подготовка градиентных роевых пластин
<ol><li>Подготовка роевой среды ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое сравнение различных вязкостей среды см. в разделе обсуждения; В этом протоколе использовалась 0,7% (мас./об.) концентрация агара роевой среды.<ol>
<li>Приготовить порошок лизогенного отвара (...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

Исследование подвижности бактериального роения на полутвердых градиентных пластинах может быть сложной задачей18,19,20, поскольку оно включает в себя множество факторов, таких как вязкость субстрата, влажность и компоненты среды. Среди ...

Бактериальная роевая подвижность относится к коллективной миграции бактериальных клеток по поверхности вещества. В дополнение к полутвердым агаровым пластинам, специально подготовленным в лаборатории1, этот фенотип также наблюдается на некоторых мягких субстратах, таких как ткани животных2, гидратированные поверхности3 и корни растений4. В то время как полутвердая поверхность считается одним из фундаментальных условий для бактериального роения, некоторым видам также требуется богатая энергией среда для поддержки их роевой подвижности5. Вращение жгутиков как плавает, так и роевая подвижность - плавание описывает одноклеточную подвижность в жидкой среде, тогда как роение - это синхронное движение микробной популяции по полутвердым поверхностям.
Вязкость субстрата влияет на подвижность бактерий; Исследования патогенных микробов, таких как Helicobacter pylori, показали, что подвижность возбудителя изменяется в зависимости от вязкости слоя муцина, на которую влияет закисление окружающей среды в организме человека-хозяина6. Чтобы воспроизвести эти среды, более ранние исследования с использованием концентрации агара выше 0,3% (мас./об.) ограничивают подвижность бактериального плавания, чтобы обеспечить постепенный переход к поверхностному роению. Использование концентрации агара выше 1% (мас./об.) предотвращает роение подвижности многих видов7. Колониальные узоры, образующиеся на поверхности, разнообразны, включая безликий mat8, бычий глаз9, дендриты10 и вихрь11.
Хотя актуальность таких моделей остается неясной, эти модели, по-видимому, зависят от экологических и химических сигналов12. Экологические сигналы охватывают различные аспекты, включая температуру, соленость, свет и рН, тогда как химические сигналы включают присутствие молекул микробного кворума, биохимических побочных продуктов и питательных веществ. Сигнальные молекулы, чувствительные к кворуму, такие как AHL (N-гексаноил-L гомосерин лактон), могут влиять на поверхностное роение, регулируя выработку поверхностно-активного вещества13,14. Ресвератрол, соединение фитоалексинов, может ограничить подвижность бактериального роя15.
В настоящей работе исследуется влияние градиентных концентраций ресвератрола на штамм Escherichia coli K12 дикого типа и исследуется арабиноза-индуцируемая роевая подвижность инженерных видов E. coli K12-YdeH и Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. Производство фермента YdeH индуцируется арабинозой через промотор araBAD, что приводит к клеточному возмущению c-di-GMP и влияет на подвижность бактериального роения16,17. Это индуцируемое роевое поведение изучается с использованием арабинозных градиентных роевых пластин с штаммами E. coli K12-YdeH и P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Градиентные роевые пластины получают путем последовательного затвердевания двухслойной среды (рис. 1В). Нижний слой содержит среду, добавленную с индуктором, вылитую на одну сторону подпираемой чашки Петри. После затвердевания нижнего слоя чашка Петри возвращается на плоскую поверхность, где верхний слой, содержащий среду без индуктора, добавляется с другой стороны пластины. После того, как роевые пластины полностью затвердевают, изометрически расположенные удерживающие скважины получают путем бурения отверстий на роевых пластинах по фиксированной компоновке (рисунок 1C) или путем отпечатывания скважин с использованием 3D-печатной модели крышки пластины, содержащей колышки, во время процесса отверждения среды (дополнительный рисунок S1). Гелевая система визуализации используется для захвата роевых морфологий в разные моменты времени (рисунок 2). Анализ поверхностного роения с помощью программного обеспечения ImageJ (дополнительный рисунок S2) дает количественные результаты процесса поверхностного роения (рисунок 3).
Таким образом, мы предлагаем простой метод проверки подвижности роя поверхности в диапазоне концентраций индукторов. Этот метод может быть использован для проверки множественных реакций концентрации других индукторов путем смешивания индуктора в среде нижнего слоя и может быть применен к другим подвижным видам (например, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Этот подход может обеспечить надежные качественные и количественные результаты для скрининга одного химического индуктора, и отдельные пластины могут быть использованы для оценки большего количества химических индукторов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

Бактериальная роевая подвижность является распространенным микробиологическим фенотипом, который бактериальные сообщества используют для миграции по полутвердым поверхностям. При исследованиях индуцированной роевой подвижности специфическая концентрация индуктора может быть не в состоянии сообщить о событиях, происходящих в пределах оптимального диапазона концентраций, чтобы вызвать желаемые ответы у вида. Полутвердые пластины, содержащие несколько концентраций, обычно используются для исследования реакции в диапазоне концентраций индуктора. Однако отдельные полутвердые пластины увеличивают изменения вязкости среды и содержания влаги в каждой пластине из-за неравномерного времени затвердевания.
В данной работе описан одноэтапный метод одновременного испытания подвижности роя поверхности на одной градиентной пластине, где изометрически расположенные испытательные скважины позволяют одновременно получать мультиконцентрационные ответы. В настоящей работе поверхностное роение Escherichia coli K12 и Pseudomonas aeruginosa PAO1 оценивали в ответ на градиент концентрации индукторов, таких как ресвератрол и арабиноза. Периодически морфологии роя визуализировались с использованием системы визуализации для захвата всего процесса роения поверхности.
Количественное измерение морфологии роя было получено с помощью программного обеспечения ImageJ, предоставляющего анализируемую информацию о области роя. В данной работе представлен простой метод градиентных роевых пластин, который предоставляет качественную и количественную информацию о влиянии индукторов на поверхностное роение, которая может быть расширена для изучения воздействия других индукторов на более широкий спектр подвижных видов бактерий.

Рабочий процесс, состоящий из подготовки градиентных роевых пластин, инокуляции и инкубации, показан на рисунке 1B. Для получения градиентных плавающих пластин нижнюю слой среды заливают в подпертую посуду под ~4,3° от горизонтальной плоскости (дополнительный рисуно...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Здесь мы описываем использование пластин градиента индуктора для оценки подвижности бактериального роя при одновременном получении множественных реакций концентрации.

Количественная оценка подвижности роя бактериальной поверхности на градиентных пластинах индуктора

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Протокол одновременно отслеживает реакцию бактериального роения на различные концентрации индуктора на полутвердом агаре. Это достигается экономически эффективным способом. Этот высокопроизводительный метод скрининга сводит на нет необходимость использования агара с различными концентрациями индукторов для наблюдения за микрохемотаксическими реакциями.Методика предназначена для скрининга лекарств, а также для наблюдения за реакциями микропатогена SD. Также его можно использовать для изучения микроответов на различные биохимические сигналы у человека-хозяина. Этот метод может дать представление о бактериальном хемотаксисе.Бактерии будут реагировать на различные концентрации химических аттрактантов, известных как положительный хемотаксис или химические репелленты, известные как отрицательный хемотаксис. Тщательно подготовленная настройка необходима, чтобы избежать изменений между гелевым углом нижнего слоя, чтобы предотвратить проблему воспроизводимости. Для начала наклейте 13 на 13 сантиметров квадратные чашки Петри с пятнами и индукторными названиями.Затем подпирайте посуду через край крышек. Добавить раствор арабинозы в теплый нижний слой среды. Добавьте 40 миллилитров теплой среды нижнего слоя.Дайте среде нижнего слоя отверждаться непокрытой в течение одного часа внутри ламинарной вытяжки без помех. Как только нижний слой полностью затвердеет, снимите крышки и положите чашки Петри внутрь ламинарной вытяжки. Добавьте 40 миллилитров теплой среды верхнего слоя с помощью моторизованного пипеточного фильтра.Отвержьте двухслойные пластины, покрытые и нетронутые в течение одного часа, затем храните их при четырех градусах Цельсия в течение 24 часов. Поместите маркированную бумагу формата А4 под хорошо затвердевшую градиентную пластину. Протолкните более широкую сторону наконечника пипетки объемом 100 микролитров на поверхность полутвердой среды в отмеченном положении и нажимайте на кончик пипетки до тех пор, пока он не достигнет нижней части среды верхнего слоя.Когда наконечник коснется дна, прекратите прикладывать любую вертикальную силу к наконечнику и осторожно поверните наконечник, чтобы изолировать содержимое цилиндрического колодца. Горизонтально переместите наконечник пипетки на небольшое расстояние, чтобы обеспечить воздушный поток в узкое отведенное место. Нажмите указательным пальцем на кончик, чтобы заблокировать поток газа внутри кончика.Вытяните наконечник вертикально, удерживая содержимое колодца в наконечнике, вытаскивая его наружу. Добавьте 80 микролитров культуры ночного роста в каждую лунку. Вынимайте роевые пластины из инкубатора по одному каждые 12 часов и помещайте их в систему визуализации геля.Выберите режим визуализации геля, подвергните пластину роя воздействию белого света и отрегулируйте фокусное расстояние, чтобы получить четкое представление о роях. Увеличьте яркость роев для точного наблюдения, регулируя время экспозиции до 300 миллисекунд. Отрегулируйте пороговое значение, чтобы свести к минимуму помехи от фонового света.Сохраните файл изображения для дальнейшего анализа. Запишите время обработки изображений, тип индуктора, ориентацию градиента и деформации в txt-файле. Нажмите «Обработать», затем «Тени», чтобы повысить резкость изображения.Нажмите «Процесс», а затем «Пакет», чтобы обработать изображение. Затем обработайте изображение в качестве ссылки, щелкнув «Процесс», «Тени» и «Юг». Щелкните Обработка, Пакет, Макрос, чтобы открыть окно Пакетный процесс.Найдите команды, отображаемые в окне. Введите адрес папки исходных изображений в адрес выходного файла, щелкнув Обработать в окне Пакетный процесс. Используйте инструмент трассировки палочек для выбора роев по отдельности и дважды щелкните инструмент трассировки палочек, чтобы настроить допуск до тех пор, пока сгенерированная линия не будет правильно соответствовать границе роя.Нажмите «Анализировать», затем «Измерить», чтобы экспортировать значение области. E.coli K12 YdeH был протестирован на арабинозных градиентных пластинах, используемых для демонстрации процесса роения поверхности с перекрытием, происходящим между соседними скважинами. Плита с тремя испытательными скважинами позволила сформировать неперекрывающиеся границы.P.aeruginosa PAO1 YdeH роевая подвижность способствовала повышению концентрации арабинозы от самой низкой концентрации, но постепенно ограничивалась более высокими концентрациями арабинозы. Штаммы дикого типа E.coli K12, протестированные на пластинах градиента ресвератрола в диапазоне концентраций от нуля до 400 микролитров, показали умеренное ограничение подвижности роя с увеличением концентрации ресвератрола. Области роя были количественно определены программным обеспечением ImageJ.Кривая роения отображала множественные реакции концентрации. Наиболее важной частью этой процедуры является изготовление двухслойной роевой пластины с определенным диапазоном концентраций индукторов. Этот метод позволяет исследователям исследовать индуцированное поверхностное роение в определенном диапазоне концентраций и количественно оценивать влияние других индукторов и компонентов на роение.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Оценка жизнеспособности синтетических бактерий консорциума на интерфейсе в Vitro хост микробов кишечника

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Планарный анализ подвижности для оценки биомодулирующих свойств натуральных продуктов

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ультрацентрифугирование градиента плотности для исследования эндоцитарной рециркуляции в клетках млекопитающих

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Полисомное профилирование без градиентных строителей или систем фракционирования

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...