Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
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El desarrollo de esta técnica fue apoyado por los fondos del plan nacional clave de I + D del Ministerio de Ciencia y Tecnología (2018YF0902604), el Fondo de Investigación para Jóvenes Científicos Internacionales (22050410270) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y los Fondos Externos de los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen (DWKF20190001). Nos gustaría ofrecer nuestro sincero agradecimiento a la señorita Chen Xinyi por su ayuda en la revisión del documento y la gestión del laboratorio.

1. Preparación de placas de enjambre de gradiente
<ol><li>Preparación del medio de enjambre NOTA: Consulte la sección de discusión para obtener una breve comparación de las diferentes viscosidades medias; En este protocolo se utilizó una concentración de agar del medio de enjambre al 0,7% (p/v).<ol>
<li>Preparar caldo de lisogenia (LB) en polvo con agar en dos matraces cónicos; cada matraz contiene 2 g de triptona, 2 g de cloruro de sodio, 1 g de extracto de levadura y 1,4 g de agar. Agregue...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

La investigación de la motilidad del enjambre bacteriano en placas de gradiente semisólido puede ser una tarea desafiante18,19,20, ya que involucra múltiples factores como la viscosidad del sustrato, la humedad y los componentes medios. Entre estos factores, la concentración de agar juega un papel decisivo en la determinación de la reversión microbiana a la motilidad de natación o enjambre. A medida que la concentración ...

La motilidad del enjambre bacteriano se refiere a la migración colectiva de células bacterianas a través de la superficie de una sustancia. Además de las placas de agar semisólido especialmente preparadas en el laboratorio1, este fenotipo también se observa en algunos sustratos blandos como tejidos animales2, superficies hidratadas3 y raíces de plantas4. Si bien una superficie semisólida se considera una de las condiciones fundamentales para el enjambre bacteriano, algunas especies también requieren un medio rico en energía para soportar su motilidad de enjambre5. La rotación de flagelos potencia tanto para nadar como para enjambre: la natación describe la motilidad unicelular dentro de un ambiente líquido, mientras que el enjambre es el movimiento sincrónico de una población microbiana a través de superficies semisólidas.
La viscosidad del sustrato influye en la motilidad bacteriana; los estudios de microbios patógenos, como Helicobacter pylori, han demostrado que la motilidad del patógeno cambia en función de la viscosidad de la capa de mucina, que está influenciada por la acidificación ambiental en el huésped humano6. Para replicar estos entornos, estudios anteriores que utilizaron una concentración de agar superior al 0,3% (p/v) restringen la motilidad bacteriana de la natación para efectuar un cambio gradual hacia el enjambre superficial. El uso de concentraciones de agar por encima del 1% (p/v) previene la motilidad del enjambre de muchas especies7. Los patrones de colonia formados en la superficie son diversos, incluyendo mat8 sin rasgos, ojo de buey9, dendritas10 y vórtice11.
Aunque la relevancia de tales patrones sigue sin estar clara, esos patrones parecen depender de señales ambientales y químicas12. Las señales ambientales cubren diferentes aspectos, incluida la temperatura, la salinidad, la luz y el pH, mientras que las señales químicas incluyen la presencia de moléculas de detección de quórum microbiano, subproductos bioquímicos y nutrientes. Las moléculas de señalización de detección de quórum autoinductoras como AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) pueden afectar el enjambre superficial al regular la producción de surfactante13,14. El resveratrol, un compuesto fitoalexina, podría restringir la motilidad del enjambre bacteriano15.
En el presente trabajo, investigamos el efecto de las concentraciones de gradiente de resveratrol en la cepa K12 de Escherichia coli de tipo silvestre e investigamos la motilidad de enjambre inducible por arabinosa de las especies de E. coli K12-YdeH y Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La producción de la enzima YdeH es inducida por la arabinosa a través del promotor araBAD, resultando en perturbación celular c-di-GMP y afectando la motilidad del enjambre bacteriano16,17. Este comportamiento de enjambre inducible se estudia utilizando placas de enjambre de gradiente de arabinosa con cepas de E. coli K12-YdeH y P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Las placas de enjambre de gradiente se preparan solidificando sucesivamente el medio de doble capa (Figura 1B). La capa inferior comprende el medio agregado con el inductor, vertido en un lado de una placa de Petri apoyada. Tras la solidificación de la capa inferior, la placa de Petri se devuelve a una superficie plana, donde la capa superior que contiene el medio sin el inductor se agrega desde el otro lado de la placa. Después de que las placas de enjambre están completamente solidificadas, los pozos de retención dispuestos isométricamente se producen perforando agujeros en las placas de enjambre siguiendo un diseño fijo (Figura 1C) o imprimiendo los pozos utilizando un modelo impreso en 3D de la cubierta de la placa que contiene clavijas durante el proceso de curado del medio (Figura suplementaria S1). Se utiliza un sistema de imágenes en gel para capturar las morfologías del enjambre en diferentes puntos temporales (Figura 2). El análisis del enjambre de superficies utilizando el software ImageJ (Figura suplementaria S2) proporciona resultados cuantitativos del proceso de enjambre de superficies (Figura 3).
Por lo tanto, proponemos un método simple para probar la motilidad del enjambre de superficie dentro de un rango de concentración de inductores. Este método se puede utilizar para probar múltiples respuestas de concentración de otros inductores mezclando el inductor en el medio de la capa inferior y se puede aplicar a otras especies móviles (por ejemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Este enfoque podría proporcionar resultados cualitativos y cuantitativos confiables para la detección de un solo inductor químico, y se pueden emplear placas separadas para evaluar más inductores químicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

La motilidad del enjambre bacteriano es un fenotipo microbiológico común que las comunidades bacterianas utilizan para migrar sobre superficies semisólidas. En las investigaciones de la motilidad del enjambre inducido, la concentración específica de un inductor puede no ser capaz de informar eventos que ocurren dentro del rango de concentración óptimo para provocar las respuestas deseadas de una especie. Las placas semisólidas que contienen múltiples concentraciones se usan comúnmente para investigar la respuesta dentro de un rango de concentración del inductor. Sin embargo, las placas semisólidas separadas aumentan las variaciones en la viscosidad media y el contenido de humedad dentro de cada placa debido al tiempo de solidificación no uniforme.
Este artículo describe un método de un solo paso para probar simultáneamente la motilidad del enjambre de superficie en una sola placa de gradiente, donde los pozos de prueba dispuestos isométricamente permiten la adquisición simultánea de respuestas de multiconcentración. En el presente trabajo, se evaluó el enjambre superficial de Escherichia coli K12 y Pseudomonas aeruginosa PAO1 en respuesta a un gradiente de concentración de inductores como el resveratrol y la arabinosa. Periódicamente, las morfologías del enjambre se fotografiaban utilizando un sistema de imágenes para capturar todo el proceso de enjambre de superficie.
La medición cuantitativa de las morfologías del enjambre se adquirió utilizando el software ImageJ, proporcionando información analizable del área del enjambre. Este artículo presenta un método simple de placa de enjambre de gradiente que proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre los efectos de los inductores en el enjambre de superficie, que puede ampliarse para estudiar los efectos de otros inductores en una gama más amplia de especies bacterianas móviles.

El flujo de trabajo que consiste en la preparación de placas de enjambre de gradiente, inoculación e incubación se muestra en la Figura 1B. Para generar placas de natación de gradiente, el medio de la capa inferior se vierte en platos apuntalados a ~ 4.3 ° desde el plano horizontal (Figura suplementaria S3), seguido de verter el medio de la capa superior después de que la capa inferior esté completamente solidificada. La composición del medio de doble capa se muestra...

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Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Aquí, describimos el uso de placas de gradiente inductoras para evaluar la motilidad del enjambre bacteriano y, al mismo tiempo, obtener múltiples respuestas de concentración.

Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

El protocolo rastrea simultáneamente las respuestas de enjambre bacteriano a diferentes concentraciones de inductores en un agar semisólido. Esto se logra de una manera rentable. Esta técnica de cribado de alto rendimiento niega la necesidad de agar con varias concentraciones de inductores para observar las respuestas microquimiotácticas.La técnica está diseñada para el cribado de fármacos y también para observar las respuestas de SD del micropatógeno. Además, se puede utilizar para estudiar microrespuestas a varias señales bioquímicas en el huésped humano. Este método puede proporcionar información sobre la quimiotaxis bacteriana.Las bacterias responderán a varias concentraciones de atrayentes químicos conocidos como quimiotaxis positiva o repelentes químicos conocidos como quimiotaxis negativa. Una configuración cuidadosamente preparada es esencial para evitar variaciones entre el ángulo de gel de la capa inferior para evitar el problema de reproducibilidad. Para comenzar, etiquete placas de Petri cuadradas de 13 por 13 centímetros con manchas y nombres de inductores.Luego apoye los platos sobre el borde de las tapas. Agregue la solución de arabinosa al medio de capa inferior caliente. Agregue 40 mililitros de medio de capa inferior cálida.Deje que el medio de la capa inferior se cure sin tapar durante una hora dentro de una campana de flujo laminar sin ser molestado. Una vez que la capa inferior esté completamente solidificada, retire las tapas y coloque las placas de Petri dentro de una campana de flujo laminar. Agregue 40 mililitros de medio de capa superior caliente utilizando un filtro de pipeta motorizado.Cure las placas de doble capa cubiertas y sin perturbaciones durante una hora, luego guárdelas a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Coloque el papel A4 marcado debajo de una placa de gradiente bien solidificada. Empuje el lado más ancho de la punta de una pipeta de 100 microlitros en la superficie media semisólida en la posición marcada y presione la punta de la pipeta hasta que llegue a la parte inferior del medio de la capa superior.Cuando la punta toque la parte inferior, deje de aplicar cualquier fuerza vertical a la punta y gire suavemente la punta para aislar el contenido del pozo cilíndrico. Mueva horizontalmente la punta de la pipeta a lo largo de una pequeña distancia para permitir el flujo de aire en el lugar estrecho reservado. Presione la punta con el dedo índice para bloquear el flujo de gas dentro de la punta.Tire de la punta hacia afuera verticalmente, manteniendo el contenido del pozo en la punta mientras lo extrae. Agregue 80 microlitros de la cultura de crecimiento durante la noche en cada pozo. Saque las placas de enjambre de la incubadora una a la vez cada 12 horas y colóquelas en el sistema de imágenes en gel.Seleccione el modo de imagen en gel, exponga la placa de enjambre a la luz blanca y ajuste la distancia focal para obtener una vista clara de los enjambres. Mejore el brillo de los enjambres para una observación precisa ajustando el tiempo de exposición a 300 milisegundos. Ajuste el umbral para minimizar la interferencia de la luz de fondo.Guarde el archivo de imagen para su posterior análisis. Registre el tiempo de imagen, el tipo de inductor, la orientación del degradado y las deformaciones en un archivo txt. Haga clic en Procesar y, a continuación, en Sombras para mejorar la nitidez de la imagen.Haga clic en Procesar seguido de Lote para procesar la imagen. A continuación, procese una imagen como referencia haciendo clic en Proceso, Sombras y Sur. Haga clic en Proceso, Lote, Macro para abrir la ventana Proceso por lotes.Busque los comandos que se muestran en la ventana. Escriba la dirección de carpeta de las imágenes originales en la dirección del archivo de salida haciendo clic en Procesar en la ventana Proceso por lotes. Utilice la herramienta de trazado de varitas para seleccionar enjambres individualmente y haga doble clic en la herramienta de trazado de varitas para ajustar la tolerancia hasta que la línea generada se ajuste correctamente al límite de enjambre.Haga clic en Analizar, luego en Medir para exportar el valor del área. E.coli K12 YdeH se probó en placas de gradiente de arabinosa utilizadas para demostrar el proceso de enjambre de superficie con superposición entre pozos adyacentes. Una placa con tres pozos de prueba permitió la formación de límites no superpuestos.La motilidad del enjambre de P.aeruginosa PAO1 YdeH se promovió con una mayor concentración de arabinosa a partir de la concentración más baja, pero se restringió gradualmente con concentraciones más altas de arabinosa. Las cepas de tipo salvaje K12 de E.coli probadas en placas de gradiente de resveratrol dentro del rango de concentración de cero a 400 microlitros mostraron una restricción modesta de la motilidad del enjambre con una concentración creciente de resveratrol. Las áreas de enjambre fueron cuantificadas por el software ImageJ.La curva de enjambre mostraba las múltiples respuestas de concentración. La parte más crucial de este procedimiento es la fabricación de una placa de enjambre de doble capa con un rango de concentración específico de inductores. Este método permite a los investigadores investigar el enjambre de superficie inducido dentro de un rango de concentración específico y cuantificar los efectos de otros inductores y componentes en el enjambre.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Un ensayo de motilidad planarian para medir las propiedades biomodulantes de los productos naturales

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...