Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Utvecklingen av denna teknik stöddes av medel från ministeriet för vetenskap och tekniks nationella nyckelforskningsplan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) och Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vill framföra vår uppriktiga tacksamhet till fröken Chen Xinyi för hennes hjälp med korrekturläsning av dokumentet och laboratoriehanteringen.

1. Beredning av gradientsvärmplattor
<ol><li>Framställning av svärmmedium OBS: Se diskussionsavsnittet för en kort jämförelse av olika medelviskositeter; 0,7% (w/v) agarkoncentration av svärmmedium användes i detta protokoll.<ol>
<li>Förbered lysogenbuljongpulver (LB) med agar i två koniska kolvar; varje kolv innehåller 2 g trypton, 2 g natriumklorid, 1 g jästextrakt och 1,4 g agar. Tillsätt dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och rör om suspensionen med en magnetisk omrörning...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

Undersökning av bakteriell svärmande rörlighet på halvfatta gradientplattor kan vara en utmanande uppgift18,19,20, eftersom det involverar flera faktorer såsom substratviskositet, fuktighet och medelstora komponenter. Bland dessa faktorer spelar agarkoncentrationen en avgörande roll för att bestämma mikrobiell återgång till antingen simning eller svärmande rörlighet. När agarkoncentrationen ökar från 0,3 % (w/v) t...

Bakteriell svärmande motilitet avser den kollektiva migrationen av bakterieceller över ytan av ett ämne. Förutom halvfafa agarplattor speciellt framställda i laboratoriet1 observeras denna fenotyp också på vissa mjuka substrat såsom djurvävnader2, hydratiserade ytor3 och växtrötter4. Medan en halvfast yta anses vara en av de grundläggande förutsättningarna för bakteriell svärmning, kräver vissa arter också ett energirikt medium för att stödja deras svärmande rörlighet5. Flagellarotationskrafter både simning och svärmande motilitetssimning beskriver den encelliga rörligheten i en flytande miljö, medan svärmning är den synkrona rörelsen hos en mikrobiell population över halvfatta ytor.
Substratviskositet påverkar bakteriell motilitet; Studier av patogena mikrober, såsom Helicobacter pylori, har visat att patogenens rörlighet förändras beroende på mucinskiktets viskositet, vilket påverkas av miljöförsurning i den mänskliga värden6. För att replikera dessa miljöer begränsar tidigare studier med agarkoncentration över 0,3% (w / v) bakteriell simningsmotilitet för att åstadkomma en gradvis övergång till ytsvärmning. Användningen av agarkoncentration över 1 % (w/v) förhindrar svärmande rörlighet hos många arter7. Kolonimönstren som bildas på ytan är olika, inklusive funktionslös matta8, tjuröga9, dendriter10 och virvel11.
Även om relevansen av sådana mönster fortfarande är oklar verkar dessa mönster vara beroende av miljömässiga och kemiska signaler12. Miljösignaler täcker olika aspekter, inklusive temperatur, salthalt, ljus och pH, medan kemiska signaler inkluderar närvaron av mikrobiella kvorumavkänningsmolekyler, biokemiska biprodukter och näringsämnen. Autoinducerares kvorumavkännande signalmolekyler såsom AHL (N-hexanoyl-L homoserinlakton) kan påverka ytsvärmningen genom att reglera produktionen av ytaktivt medel13,14. Resveratrol, en fytoalexinförening, kan begränsa bakteriell svärmande rörlighet15.
I det aktuella arbetet undersöker vi effekten av gradientkoncentrationer av resveratrol på vildtyp Escherichia coli K12-stam och undersöker arabinosinducerbar svärmande motilitet hos konstruerade E. coli K12-YdeH och Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-arter. Produktionen av YdeH-enzymet induceras av arabinos via araBAD-promotorn, vilket resulterar i cellulär c-di-GMP-störning och påverkar bakteriell svärmande motilitet16,17. Detta inducerbara svärmningsbeteende studeras med användning av arabinosgradientsvärmplattor med E. coli K12-YdeH och P. aeruginosa PAO1-YdeH-stammar.
Gradientsvärmplattorna framställs genom successivt stelnande dubbelskiktsmedium (figur 1B). Bottenskiktet består av mediet tillsatt med induceraren, hälld på ena sidan av en uppspänd petriskål. Vid stelningen av bottenskiktet återförs petriskålen till en plan yta, där det övre skiktet innehållande mediet utan induceraren tillsätts från andra sidan plattan. Efter att svärmplattorna har stelnat helt produceras isometriskt anordnade hållbrunnar genom uppborrningshål på svärmplattorna efter en fast layout (figur 1C) eller genom att brunnarna präglas med hjälp av en 3D-printad modell av plattkåpan som innehåller pinnar under medelhärdningsprocessen (tilläggsfigur S1). Ett gelarvbildningssystem används för att fånga de svärmande morfologierna vid olika tidpunkter (figur 2). Analys av ytsvärmning med hjälp av ImageJ-programvara (kompletterande figur S2) ger kvantitativa resultat av ytsvärmningsprocessen (figur 3).
Således föreslår vi en enkel metod för att testa ytsvärmande rörlighet inom ett koncentrationsområde av inducerare. Denna metod kan användas för att testa flera koncentrationssvar från andra inducerare genom att blanda induceraren i bottenskiktets medium och kan appliceras på andra rörliga arter (t.ex. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Detta tillvägagångssätt kan ge tillförlitliga kvalitativa och kvantitativa resultat för screening av en enda kemisk inducerare, och separata plattor kan användas för att utvärdera fler kemiska inducerare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

Bakteriell svärmande rörlighet är en vanlig mikrobiologisk fenotyp som bakteriesamhällen använder för att migrera över halvfatta ytor. Vid undersökningar av inducerad svärmande motilitet kan det vara möjligt att specifik koncentration av en inducerare inte kan rapportera händelser som inträffar inom det optimala koncentrationsområdet för att framkalla de önskade svaren från en art. Halvfacitplattor innehållande flera koncentrationer används vanligen för att undersöka responsen inom ett inducerarkoncentrationsområde. Separata halvfasta plattor ökar emellertid variationerna i medelviskositet och fuktinnehåll inom varje platta på grund av ojämn stelningstid.
Detta dokument beskriver en enstegsmetod för att samtidigt testa ytans svärmande rörlighet på en enda gradientplatta, där de isometriskt anordnade testbrunnarna möjliggör samtidig förvärv av multikoncentrationssvar. I det aktuella arbetet utvärderades ytsvärmningen av Escherichia coli K12 och Pseudomonas aeruginosa PAO1 som svar på en koncentrationsgradient av inducerare såsom resveratrol och arabinos. Periodiskt avbildades svärmmorfologierna med hjälp av ett bildsystem för att fånga hela ytsvärmningsprocessen.
Den kvantitativa mätningen av svärmmorfologierna förvärvades med hjälp av ImageJ-programvaran, vilket gav analyserbar information om svärmområdet. Denna uppsats presenterar en enkel gradient swarm plate metod som ger kvalitativ och kvantitativ information om inducerarnas effekter på ytsvärmning, som kan utvidgas för att studera effekterna av andra inducerare på ett bredare spektrum av rörliga bakteriearter.

Arbetsflödet som består av beredning av gradientsvärmplattor, ympning och inkubation visas i figur 1B. För att generera gradientsvadplattor hälls bottenskiktets medium i uppspända diskar vid ~ 4,3 ° från horisontalplanet (kompletterande figur S3), följt av att hälla det övre skiktmediet efter att bottenskiktet har stelnat helt. Sammansättningen av dubbelskiktsmediet visas i tabell 1. Därefter pipetteras bakterieodling över natten i testbrunnarn...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Här beskriver vi användningen av inducerargradientplattor för att utvärdera bakteriell svärmande rörlighet samtidigt som man erhåller flera koncentrationssvar.

Kvantifiering av bakteriell yta som svärmar motilitet på inducerargradientplattor

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Protokollet spårar samtidigt bakteriella svärmningssvar på olika inducerarkoncentrationer på en halvfast agar. Detta uppnås på ett kostnadseffektivt sätt. Denna screeningteknik med hög genomströmning förnekar behovet av agar med olika inducerarkoncentrationer för att observera de mikrokemotaktiska svaren.Tekniken är utformad för läkemedelsscreening och även för att observera mikropatogen sd-svar. Det kan också användas för att studera mikrorespons på olika biokemiska signaler i den mänskliga värden. Denna metod kan ge insikt i bakteriell kemotaxis.Bakterier kommer att svara på olika koncentrationer av kemiska lockmedel som kallas positiva kemotaxis eller kemiska repellenter som kallas negativa kemotaxis. En noggrant förberedd uppsättning är avgörande för att undvika variationer mellan gelvinkeln på det nedre lagret för att förhindra reproducerbarhetsproblemet. Börja med att märka 13 med 13 centimeter kvadratiska petriskålar med fläckar och inducerarnamn.Stötta sedan diskarna upp över lockkanten. Tillsätt arabinoslösning till varmt bottenskiktsmedium. Tillsätt 40 ml varmt bottenskiktmedium.Låt bottenskiktets medium härda utan lock i en timme inuti en laminär flödeshuva ostört. När bottenskiktet är helt stelnat, ta bort locken och lägg petriskålarna inuti en laminär flödeshuva. Tillsätt 40 ml varmt övre lagermedium med ett motoriserat pipettfilter.Bota de dubbla skiktplattorna täckta och ostörda i en timme och förvara dem sedan vid fyra grader Celsius i 24 timmar. Placera det märkta A4-papperet under en väl stelnad lutningsplatta. Tryck in den bredare sidan av en 100 mikroliter pipettspets i den halvfasta medieytan vid det markerade läget och tryck på pipettspetsen tills den når botten av det övre lagermediet.När spetsen rör vid botten, sluta applicera någon vertikal kraft på spetsen och rotera försiktigt spetsen för att isolera innehållet i den cylindriska brunnen. Flytta pipettspetsen horisontellt längs ett litet avstånd för att tillåta luftflöde till den smala platsen som är avsatt. Tryck på spetsen med pekfingret för att blockera gasflödet inuti spetsen.Dra ut spetsen vertikalt och håll brunnsinnehållet i spetsen medan du drar ut den. Tillsätt 80 mikroliter av tillväxtkulturen över natten i varje brunn. Ta svärmplattorna ur inkubatorn en i taget var 12: e timme och placera dem i gelarvbildningssystemet.Välj gelavbildningsläge, utsätt svärmplattan för vitt ljus och justera brännvidden för att få en tydlig bild av svärmar. Förbättra svärmarnas ljusstyrka för exakt observation genom att justera exponeringstiden till 300 millisekunder. Justera tröskeln för att minimera störningar från bakgrundsljuset.Spara bildfilen för vidare analys. Registrera bildtid, inducerartyp, gradientorientering och stammar i en txt-fil. Klicka på Process och sedan på Skuggor för att förbättra bildens skärpa.Klicka på Process följt av Batch för att bearbeta bilden. Bearbeta sedan en bild som referens genom att klicka på Process, Shadows och South. Klicka på Process, Batch, Macro för att öppna fönstret Batchprocess.Leta efter kommandona som visas i fönstret. Skriv mappadressen för originalbilderna i utdatafilens adress genom att klicka på Bearbeta i batchprocessfönstret. Använd trollstavsspårningsverktyget för att välja svärmar individuellt och dubbelklicka på trollstavsspårningsverktyget för att justera toleransen tills den genererade linjen passar svärmgränsen korrekt.Klicka på Analysera och sedan på Mät för att exportera områdesvärdet. E.coli K12 YdeH testades på arabinosgradientplattor som användes för att demonstrera ytsvärmningsprocessen med överlappning mellan intilliggande brunnar. En platta med tre testbrunnar möjliggjorde bildandet av icke-överlappande gränser.P.aeruginosa PAO1 YdeH svärmande rörlighet främjades med ökad arabinoskoncentration från den lägsta koncentrationen, men begränsades gradvis med högre koncentrationer av arabinoskoncentrationer. E.coli K12 vilda typstammar testade på resveratrolgradientplattor inom koncentrationsområdet noll till 400 mikroliter visade en blygsam begränsning av svärmningsmotiliteten med ökande resveratrolkoncentration. Svärmområden kvantifierades av ImageJ-programvaran.Svärmningskurvan visade de flera koncentrationssvaren. Den mest avgörande delen av denna procedur är att tillverka en dubbelskikts svärmplatta med ett specifikt koncentrationsområde av inducerare. Denna metod gör det möjligt för forskare att undersöka den inducerade ytsvärmningen inom ett specifikt koncentrationsområde och att kvantifiera effekterna av andra inducerare och komponenter på svärmning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Bedömningen av lönsamheten för ett syntetiskt bakteriell konsortium för värd-mikrob In Vitro Gut gränssnittet

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering av Glomeruli och In Vivo märkning av glomerulär Cell ytproteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En Planarian Motility Assay att mäta biomodulerande egenskaper naturliga produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellfraktionering av U937-celler genom isopycnic density gradient reification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosinspecifika anpassningar av in vitro-fluorescensmikroskopibaserade motilitetsanalyser

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Densitet gradient ultracentrifugation för att undersöka endocytisk återvinning i däggdjursceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomprofilering utan övertoningstillverkare eller fraktioneringssystem

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...