Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Bu tekniğin geliştirilmesi, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'nın Ulusal Anahtar Ar-Ge planı (2018YF0902604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın Uluslararası Genç Bilim İnsanları Araştırma Fonu (22050410270) ve Shenzhen İleri Teknoloji Dış Fonları Enstitüleri (DWKF20190001) fonlarıyla desteklenmiştir. Bayan Chen Xinyi'ye, belgenin düzeltilmesinde ve laboratuvar yönetiminde yardımcı olduğu için içten şükranlarımızı sunmak istiyoruz.

1. Degrade sürü plakalarının hazırlanması
<ol><li>Sürü ortamının hazırlanması NOT: Farklı ortam viskozitelerinin kısa bir karşılaştırması için tartışma bölümüne bakın; Bu protokolde sürü ortamının %0.7 (w/v) agar konsantrasyonu kullanılmıştır.<ol>
<li>İki konik şişede agar ile Lysogeny et suyu (LB) tozu hazırlayın; Her şişe 2 g tripton, 2 g sodyum klorür, 1 g maya ekstresi ve 1.4 g agar içerir. Çift damıtılmış su (ddH2O) ekleyin ve manyetik ...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

Yarı katı gradyan plakalar üzerindeki bakteri kaynaşma hareketliliğinin araştırılması, substrat viskozitesi, nem ve orta bileşenler gibi birden fazla faktörü içerdiğinden zorlu bir görev olabilir18,19,20. Bu faktörler arasında, agar konsantrasyonu, yüzme veya sürü hareketliliğine mikrobiyal geri dönüşün belirlenmesinde belirleyici bir rol oynar. Agar konsantrasyonu %0,3'ten (w/v) %1'e (w/v) yükseldikç...

Bakteriyel kaynama hareketliliği, bakteri hücrelerinin bir maddenin yüzeyi boyunca toplu göçünü ifade eder. Laboratuvarda özel olarak hazırlanan yarı katı agar plakalarına1 ek olarak, bu fenotip, hayvan dokuları2, hidratlanmış yüzeyler3 ve bitki kökleri4 gibi bazı yumuşak substratlarda da gözlenir. Yarı katı bir yüzey, bakteri kaynaşmasının temel koşullarından biri olarak kabul edilirken, bazı türler de sürü hareketliliklerini desteklemek için enerji açısından zengin bir ortama ihtiyaç duyarlar5. Flagella rotasyonu hem yüzmeye hem de kaynama hareketliliğine güç verir-yüzme, sıvı bir ortamdaki tek hücreli hareketliliği tanımlarken, kaynama, mikrobiyal bir popülasyonun yarı katı yüzeyler boyunca senkronize hareketidir.
Substrat viskozitesi bakteriyel motiliteyi etkiler; Helicobacter pylori gibi patojenik mikroplar üzerinde yapılan çalışmalar, patojenin hareketliliğinin, insan konakçısındaki çevresel asitleşmeden etkilenen müsin tabakası viskozitesine bağlı olarak değiştiğini göstermiştir6. Bu ortamları çoğaltmak için,% 0.3'ün (w / v) üzerindeki agar konsantrasyonunu kullanan daha önceki çalışmalar, yüzey kaynamasına kademeli bir kaymayı etkilemek için bakteriyel yüzme hareketliliğini kısıtlamaktadır. Agar konsantrasyonunun %1'in (w/v) üzerinde kullanılması, birçok türün kaynama hareketliliğini önler7. Yüzeyde oluşan koloni desenleri, özelliksiz mat8, boğa gözü9, dendritler10 ve vorteks11 dahil olmak üzere çeşitlidir.
Bu tür kalıpların alaka düzeyi belirsizliğini korusa da, bu kalıplar çevresel ve kimyasal ipuçlarına bağlı gibi görünmektedir12. Çevresel ipuçları, sıcaklık, tuzluluk, ışık ve pH dahil olmak üzere farklı yönleri kapsarken, kimyasal ipuçları mikrobiyal çekirdek algılama moleküllerinin, biyokimyasal yan ürünlerin ve besin maddelerinin varlığını içerir. AHL (N-hekzanoil-L homoserin lakton) gibi otoindükleyici çekirdek algılama sinyal molekülleri, yüzey aktif madde üretimini düzenleyerek yüzey kaynamasını etkileyebilir13,14. Bir fitoaleksin bileşiği olan Resveratrol, bakteriyel sürü hareketliliğini kısıtlayabilir15.
Bu çalışmada, resveratrolün gradyan konsantrasyonlarının vahşi tip Escherichia coli K12 suşu üzerindeki etkisini araştırıyoruz ve mühendislik ürünü E. coli K12-YdeH ve Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH türlerinin arabinoz ile indüklenebilir sürü hareketliliğini araştırıyoruz. YdeH enziminin üretimi, arabinoz tarafından araBAD promotörü aracılığıyla indüklenir, bu da hücresel c-di-GMP pertürbasyonuna neden olur ve bakteriyel sürü hareketliliğini etkiler16,17. Bu indüklenebilir sürü davranışı, E. coli K12-YdeH ve P. aeruginosa PAO1-YdeH suşları ile arabinoz gradyan sürü plakaları kullanılarak incelenmiştir.
Gradyan sürü plakaları, çift katmanlı ortamın art arda katılaşmasıyla hazırlanır (Şekil 1B). Alt tabaka, desteklenmiş bir Petri kabının bir tarafına dökülen indükleyici ile eklenen ortamı içerir. Alt tabakanın katılaşması üzerine, Petri kabı düz bir yüzeye geri döndürülür, burada indükleyici olmadan ortamı içeren üst tabaka plakanın diğer tarafından eklenir. Sürü plakaları tamamen katılaştıktan sonra, izometrik olarak düzenlenmiş tutma kuyuları, sabit bir düzen izlenerek sürü plakaları üzerindeki deliklerin delinmesiyle (Şekil 1C) veya orta kürleme işlemi sırasında mandallar içeren plaka kapağının 3D baskılı bir modeli kullanılarak kuyucukların basılmasıyla üretilir (Ek Şekil S1). Farklı zaman noktalarındaki sürü morfolojilerini yakalamak için bir jel görüntüleme sistemi kullanılır (Şekil 2). ImageJ yazılımı kullanılarak yüzey kaynamasının analizi (Ek Şekil S2), yüzey kaynatma işleminin nicel sonuçlarını sağlar (Şekil 3).
Bu nedenle, bir indükleyici konsantrasyon aralığında yüzey kaynama hareketliliğini test etmek için basit bir yöntem öneriyoruz. Bu yöntem, indükleyiciyi alt tabaka ortamına karıştırarak diğer indükleyicilerin çoklu konsantrasyon tepkilerini test etmek için kullanılabilir ve diğer hareketli türlere (örneğin, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica) uygulanabilir. Bu yaklaşım, tek bir kimyasal indükleyicinin taranması için güvenilir kalitatif ve kantitatif sonuçlar sağlayabilir ve daha fazla kimyasal indükleyiciyi değerlendirmek için ayrı plakalar kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

Bakteriyel sürü hareketliliği, bakteri topluluklarının yarı katı yüzeyler üzerinde göç etmek için kullandıkları yaygın bir mikrobiyolojik fenotiptir. İndüklenmiş sürü hareketliliğinin araştırılmasında, bir indükleyicinin spesifik konsantrasyonu, bir türden istenen yanıtları ortaya çıkarmak için optimal konsantrasyon aralığında meydana gelen olayları rapor edemeyebilir. Birden fazla konsantrasyon içeren yarı katı plakalar, bir indükleyici konsantrasyon aralığındaki yanıtı araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, ayrı yarı katı plakalar, düzgün olmayan katılaşma süresi nedeniyle her plakadaki orta viskozite ve nem içeriğindeki değişimleri arttırır.
Bu yazıda, izometrik olarak düzenlenmiş test kuyularının çok konsantrasyonlu yanıtların eşzamanlı olarak elde edilmesine izin verdiği tek bir gradyan plaka üzerinde yüzey kaynatma hareketliliğini aynı anda test etmek için tek adımlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada, Escherichia coli K12 ve Pseudomonas aeruginosa PAO1'in yüzey sürüsü, resveratrol ve arabinoz gibi indükleyicilerin konsantrasyon gradyanına yanıt olarak değerlendirilmiştir. Periyodik olarak, sürü morfolojileri, tüm yüzey kaynama sürecini yakalamak için bir görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülendi.
Sürü morfolojilerinin kantitatif ölçümü, sürü alanının analiz edilebilir bilgilerini sağlayan ImageJ yazılımı kullanılarak elde edildi. Bu yazıda, indükleyicilerin yüzey kaynaması üzerindeki etkileri hakkında kalitatif ve nicel bilgi sağlayan basit bir gradyan sürü plakası yöntemi sunulmaktadır; bu, diğer indükleyicilerin daha geniş bir hareketli bakteri türü yelpazesi üzerindeki etkilerini incelemek için genişletilebilir.

Degrade sürü plakalarının hazırlanması, aşılama ve inkübasyondan oluşan iş akışı Şekil 1B'de gösterilmiştir. Degrade yüzme plakaları oluşturmak için, alt tabaka ortamı, yatay düzlemden ~ 4.3 ° 'de (Ek Şekil S3) desteklenmiş tabaklara dökülür, ardından alt tabaka tamamen katılaştıktan sonra üst katman ortamı dökülür. Çift katmanlı ortamın bileşimi Tablo 1'de gösterilmiştir. Daha sonra, gece boyunca kültürlenen bak...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Burada, aynı anda çoklu konsantrasyon tepkileri elde ederken bakteriyel kaynama hareketliliğini değerlendirmek için indükleyici gradyan plakalarının kullanımını açıklıyoruz.

İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Protokol aynı anda yarı katı bir agar üzerindeki farklı indükleyici konsantrasyonlarına bakteriyel kaynaşma tepkilerini izler. Bu, uygun maliyetli bir şekilde elde edilir. Bu yüksek verimli tarama tekniği, mikrokemotaktik yanıtları gözlemlemek için çeşitli indükleyici konsantrasyonlarına sahip agar ihtiyacını ortadan kaldırır.Bu teknik, ilaç taraması ve ayrıca mikropatojen SD yanıtlarını gözlemlemek için tasarlanmıştır. Ayrıca, insan konakçısındaki çeşitli biyokimyasal ipuçlarına mikro tepkileri incelemek için de kullanılabilir. Bu yöntem bakteriyel kemotaksiler hakkında fikir verebilir.Bakteriler, pozitif kemotaksis veya negatif kemotaksis olarak bilinen kimyasal kovucular olarak bilinen çeşitli kimyasal çekicilik konsantrasyonlarına cevap verecektir. Tekrarlanabilirlik sorununu önlemek için alt tabakanın jel açısı arasında bir değişiklik olmasını önlemek için dikkatlice hazırlanmış bir kurulum gereklidir. Başlamak için, 13 x 13 santimetre kare Petri yemeklerini lekeler ve indükleyici isimlerle etiketleyin.Ardından bulaşıkları kapakların kenarından yukarı doğru yerleştirin. Sıcak alt tabaka ortamına arabinoz çözeltisi ekleyin. 40 mililitre ılık alt tabaka ortamı ekleyin.Alt tabaka ortamının, laminer bir akış başlığının içinde rahatsız edilmeden bir saat boyunca açıkta kalmasını bekleyin. Alt tabaka tamamen katılaştıktan sonra, kapakları çıkarın ve Petri kaplarını laminer bir akış başlığı içine yerleştirin. Motorlu pipet filtresi kullanarak 40 mililitre sıcak üst tabaka ortamı ekleyin.Kapalı ve rahatsız edilmemiş çift katmanlı plakaları bir saat boyunca kürleyin, ardından 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. İşaretli A4 kağıdını iyi katılaşmış bir gradyan plakasının altına yerleştirin. 100 mikrolitrelik pipet ucunun daha geniş tarafını işaretli konumda yarı katı ortam yüzeyine itin ve pipet ucunu üst tabaka ortamının dibine ulaşana kadar bastırın.Uç tabana dokunduğunda, uca herhangi bir dikey kuvvet uygulamayı bırakın ve silindirik kuyucuğun içeriğini izole etmek için ucu yavaşça döndürün. Pipet ucunu yatay olarak küçük bir mesafe boyunca hareket ettirerek hava akışının bir kenara bırakılan dar yere girmesini sağlayın. Ucun içindeki gaz akışını engellemek için ucu işaret parmağınızla bastırın.Ucu dikey olarak dışarı çekin, dışarı çekerken kuyu içeriğini uçta tutun. Her kuyucuğa gecelik büyüme kültürünün 80 mikrolitresini ekleyin. Sürü plakalarını her 12 saatte bir inkübatörden birer birer çıkarın ve jel görüntüleme sistemine yerleştirin.Jel görüntüleme modunu seçin, sürü plakasını beyaz ışığa maruz bırakın ve sürülerin net bir görünümünü elde etmek için odak uzaklığını ayarlayın. Pozlama süresini 300 milisaniyeye ayarlayarak hassas gözlem için sürülerin parlaklığını artırın. Arka plan ışığından kaynaklanan paraziti en aza indirmek için eşiği ayarlayın.Daha fazla analiz için görüntü dosyasını kaydedin. Görüntüleme süresini, indükleyici türünü, gradyan yönünü ve gerinimleri bir txt dosyasına kaydedin. Görüntünün keskinliğini artırmak için İşleme'yi, ardından Gölgeler'i tıklayın.Görüntüyü işlemek için İşlem'e ve ardından Toplu İşlem'e tıklayın. Ardından İşlem, Gölgeler ve Güney'e tıklayarak bir görüntüyü referans olarak işleyin. Toplu İşlem penceresini açmak için İşlem, Toplu İşlem, Makro'yu tıklatın.Pencerede görüntülenen komutları arayın. Toplu İşlem penceresinde İşlem'i tıklatarak çıktı dosyası adresine özgün görüntülerin klasör adresini yazın. Sürüleri tek tek seçmek için değnek izleme aracını kullanın ve oluşturulan çizgi sürü sınırına doğru şekilde uyana kadar toleransı ayarlamak için değnek izleme aracına çift tıklayın.Alan değerini dışa aktarmak için Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayın. E.coli K12 YdeH, bitişik kuyucuklar arasında meydana gelen örtüşme ile yüzey kaynama işlemini göstermek için kullanılan arabinoz gradyan plakaları üzerinde test edilmiştir. Üç test kuyusuna sahip bir plaka, örtüşmeyen sınırların oluşumunu sağladı.P.aeruginosa PAO1 YdeH kaynama hareketliliği, en düşük konsantrasyondan artan arabinoz konsantrasyonu ile desteklendi, ancak kademeli olarak daha yüksek konsantrasyonlarda arabinoz konsantrasyonları ile sınırlandırıldı. Sıfır ila 400 mikrolitre konsantrasyon aralığındaki resveratrol gradyan plakaları üzerinde test edilen E.coli K12 vahşi tip suşlar, artan resveratrol konsantrasyonu ile sürü hareketliliğinin mütevazı bir kısıtlamasını göstermiştir. Sürü alanları ImageJ yazılımı ile ölçüldü.Sürü eğrisi çoklu konsantrasyon tepkilerini gösterdi. Bu prosedürün en önemli kısmı, belirli bir konsantrasyon aralığında indükleyicilere sahip çift katmanlı bir sürü plakası üretmektir. Bu yöntem, araştırmacıların belirli bir konsantrasyon aralığında indüklenen yüzey kaynaşmasını araştırmalarını ve diğer indükleyicilerin ve bileşenlerin kaynaşma üzerindeki etkilerini ölçmelerini sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...