Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

يتم تمويل هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة من إدارة التكنولوجيا الحيوية BT/PR8742/AGR/36/773/2013 إلى SRV ؛ وإدارة التكنولوجيا الحيوية في الهند BT/COE/34/SP13432/2015 ووزارة العلوم والتكنولوجيا في الهند: EMR/2017/003880 إلى P.B. يتم دعم RVS و P.B. من قبل Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 و IA/S/15/1/501842 ، على التوالي. يتم دعم S.D. من قبل زمالة CSIR-UGC ، ويتم دعم S.I. من قبل زمالة أبحاث ICMR العليا. نشكر Abhirup Bagchi و Sandya Rani وموظفي المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي CSCR على مساعدتهم. كما نشكر MedGenome Inc. على المساعدة في تسلسل الإنتاجية العالية وتحليل البيانات.

اتبع المبادئ التوجيهية للجنة السلامة الأحيائية المؤسسية (IBSC) واستخدم المرفق المناسب للتعامل مع الفيروس اللئيم (BSL-2). وينبغي تدريب الموظفين تدريبا مناسبا على مناولة الفيروس الخبيث والتخلص منه. يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية للكلية الطبية المسيحية في فيلور.
<p clas...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

يستخدم تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) على نطاق واسع في دراسات الجينوم الوظيفية، والتي تشمل فحص الحمض النووي الريبوزي المرسال والحمض النووي الريبوزي المرسال. تتمثل فائدة shRNA في أنه يمكن دمجها في ناقلات البلازميد ودمجها في الحمض النووي الجيني ، مما يؤدي إلى تعبير مستقر ، وبالتالي ، ضربة قاض?...

ظلت الخيارات العلاجية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) دون تغيير على مدى العقود الخمسة الماضية تقريبا ، مع السيتارابين (AraC) والجمرة الخبيثة كحجر الزاوية لعلاج المرض. أحد التحديات التي تواجه نجاح العلاج AML هو مقاومة الخلايا الجذعية الكروية البيض للعلاج الكيميائي ، مما يؤدي إلى انتكاس المرض 1,2. يلعب التنظيم اللاجيني دورا حيويا في التسبب في السرطان ومقاومة الأدوية ، وقد ظهرت العديد من العوامل اللاجينية كأهداف علاجية واعدة3،4،5. تؤثر الآليات التنظيمية اللاجينية على الانتشار والبقاء على قيد الحياة في ظل التعرض المستمر لعقاقير العلاج الكيميائي. وقد أفادت الدراسات التي أجريت على الأورام الخبيثة غير الدموية أن جزءا صغيرا من الخلايا التي تتغلب على تأثير الدواء تخضع لتعديلات جينية مختلفة ، مما يؤدي إلى بقاء تلك الخلايا على قيد الحياة 6,7. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف دور العوامل اللاجينية في التوسط في المقاومة المكتسبة للسيتارابين في AML.
الفحص عالي الإنتاجية هو نهج لاكتشاف الأدوية اكتسب أهمية عالمية بمرور الوقت وأصبح طريقة قياسية في جوانب مختلفة لتحديد الأهداف المحتملة في الآليات الخلوية ، لتوصيف المسار ، وعلى المستوى الجزيئي 8,9. ينطوي مفهوم الفتك الاصطناعي على التفاعل بين جينين حيث يكون اضطراب أي من الجين وحده قابلا للتطبيق ولكن كلا الجينين في وقت واحد يؤدي إلى فقدان الجدوى10. يمكن أن يساعد استغلال الفتك الاصطناعي في علاج السرطان في تحديد التفاعلات الجينية القاتلة الاصطناعية القوية وتوصيفها ميكانيكيا11. لقد اعتمدنا نهجا توافقيا لفحص الحمض النووي الريبوزي المرسال عالي الإنتاجية مع الفتك الاصطناعي لتحديد العوامل اللاجينية المسؤولة عن مقاومة السيتارابين المكتسبة في AML.
من المعروف أن سرطان الدم الحاد الناجم عن نقل الكروموسومات لجين سرطان الدم المختلط السلالة (MLL أو KMT2A) يرتبط بضعف البقاء على قيد الحياة لدى المرضى. يمكن للمنتجات الخيمرية الناتجة عن إعادة ترتيب جين MLL ، أي بروتينات اندماج MLL (MLL-FPs) ، تحويل الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم (HSPCs) إلى انفجارات اللوكيميا بمشاركة عوامل جينية متعددة. تشكل هذه المنظمين اللاجينيين شبكة معقدة تملي الحفاظ على برنامج سرطان الدم ، وبالتالي ، يمكن أن تشكل أهدافا علاجية محتملة. في هذا السياق ، استخدمنا خط الخلايا MV4-11 (الذي يؤوي جين الاندماج MLL MLL-AF4 مع طفرة FLT3-ITD ؛ يطلق عليه MV4-11 P) لتطوير خط الخلايا المقاوم للسيتارابين المكتسب ، والذي يطلق عليه MV4-11 AraC R. تعرض خط الخلية لجرعات متزايدة من السيتارابين مع الشفاء المتقطع من العلاج الدوائي ، والمعروف باسم عطلة المخدرات. تم تقييم التركيز المثبط نصف الأقصى (IC50) عن طريق فحص السمية الخلوية في المختبر .
استخدمنا مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة (انظر جدول المواد) التي يقودها مروج hEF1a مع العمود الفقري pZIP lentivirus. تضم هذه المكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يستهدف 407 عوامل جينية. يحتوي كل عامل على 5-24 shRNAs ، مع ما مجموعه 5,485 shRNAs ، بما في ذلك خمسة shRNAs غير مستهدفة. تم تحسين سقالة "UltrmiR" المعدلة miR-30 من أجل التكوين الحيوي الأولي الفعال ل shRNA والتعبير12,13.
ويوضح الشكل 1 ألف الخطوط العريضة لهذه التجربة. يركز البروتوكول الحالي على فحص الحمض النووي الريبي باستخدام مكتبة العامل اللاجيني shRNA في خط خلية MV4-11 AraC R (الشكل 1B) ، وهو خط خلية معلقة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص أي مكتبة مستهدفة في أي خط خلية مقاوم للأدوية من اختياره. تجدر الإشارة إلى أن بروتوكول النقل سيكون مختلفا بالنسبة للخلايا الملتصقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

يعد فهم آليات المحرك ذات الصلة سريريا للمقاومة الكيميائية المكتسبة أمرا بالغ الأهمية لتوضيح طرق التحايل على المقاومة وتحسين البقاء على قيد الحياة لدى المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). جزء صغير من خلايا اللوكيميا التي تنجو من العلاج الكيميائي لديها حالة جينية متزنة لتحمل إهانة العلاج الكيميائي. يسمح التعرض الإضافي للعلاج الكيميائي لهذه الخلايا الثابتة للأدوية بالوصول إلى حالة جينية ثابتة ، مما يؤدي إلى تغيير التعبير الجيني ، مما يؤدي إلى انتشار هذه المجموعات السكانية المقاومة للأدوية وفي النهاية الانتكاس أو المرض الحراري. لذلك ، فإن تحديد التعديلات اللاجينية التي تتطلب بقاء خلايا اللوكيميا المقاومة للأدوية أمر بالغ الأهمية. نحن نفصل بروتوكولا لتحديد المعدلات اللاجينية التي تتوسط المقاومة للسيتارابين التناظري للنيوكليوزيد (AraC) باستخدام فحص مكتبة shRNA المجمعة في خط خلية AML مقاوم للسيتارابين مكتسب. تتكون المكتبة من 5,485 بنية shRNA تستهدف 407 عوامل جينية بشرية ، مما يسمح بفحص العوامل اللاجينية عالية الإنتاجية.

ويبين الشكل 1 ألف سير عمل الفحص العام. كشفت السمية الخلوية في المختبر ل MV4-11 AraC R (48 ساعة) أن IC50 إلى cytarabine في MV4-11 AraC R أعلى من MV4-11 P (الشكل 1B). تم استخدام هذا الخط الخلوي في الدراسة كنموذج لفحص العوامل اللاجينية المسؤولة عن مقاومة السيتارابين.
<p class=...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

يمكن أن يكون فحص تداخل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNAi) باستخدام مجموعة من الحمض النووي الريبوزي المرسال (shRNAs) الفيروسي الوراثي أداة للكشف عن الأهداف القاتلة الاصطناعية ذات الصلة علاجيا في الأورام الخبيثة. نحن نقدم نهج فحص shRNA مجمع للتحقيق في المؤثرات اللاجينية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML).

فحص مكتبة shRNA المجمعة لتحديد العوامل التي تعدل النمط الظاهري لمقاومة الأدوية

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

الهدف العام من الفيديو التالي هو إظهار استخدام مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة لإجراء فحص اختيار سلبي. يمكن هذا الفحص من تحديد أهداف جينية محددة من خلال التسلسل. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في تحديد العوامل اللاجينية المسؤولة عن التوسط في مقاومة السيتارابين المكتسبة في AML الخطوات هي كما يلي.اختيار المروج الأكثر فعالية للحصول على تعبير مستمر وطويل الأمد عن shRNAs. يركز البروتوكول الحالي على فحص الحمض النووي الريبي باستخدام مكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال للعامل اللاجيني في خط الخلايا MV4-11 المقاوم للسيتارابين. المروجون المستخدمون لهذا الغرض هم EF-1 alpha البشري و CMV البشري و SFFV ، المروجون الذين يعبرون عن بروتين التألق الأخضر.خذ عدد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق. تعليق الخلايا في 10٪ RPMI المتوسطة التي تحتوي على 8 ميكروغرام لكل مل بوليبرين. البذور 1 مليون خلية في 1.5 مل من الوسط لكل بئر من صفيحة من ستة آبار في ثلاثة أضعاف.أضف كميات مختلفة من فيروسات lentivirus المركزة. على سبيل المثال ، lentiviruses ، على سبيل المثال ، 10 و 20 و 40 ميكرولتر ، اعتمادا على عيار فيروسات lentiviruses لكل بئر. قم بتدوير الطبق بلطف لخلط المحتويات.قم بإجراء التصويب عن طريق الطرد المركزي عند 920 جم عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. احتضان الألواح على الفور في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. راقب GFP في نهاية 48 ساعة وحدد كميا في نهاية 72 ساعة.بعد ذلك، اتبع الخطوات الموضحة في المخطط الانسيابي لاختيار المروج الذي يعرض تعبيرا متسقا عن GFP في جميع أنحاء الثقافة. إعداد مكتبة الحمض النووي الريبوزي المشبع بالفيروس الوراثي البشري المجمعة shRNA. زراعة الخلايا التائية 293T في عدد مرور منخفض مع معدل انتشار جيد في ثلاثة أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 8 مل من 10٪ DMFM المتوسطة في كل طبق.بمجرد أن تصل الخلايا إلى 60٪ من الالتقاء ، استبدلها بوسط طازج تماما. تحضير مزيج النقل كما هو موضح الذي يحتوي على وسط خال من المصل ، بلازميد تغليف lentiviral PAX2 ، غلاف بلازميد pMD2. G ، بلازميدات المكتبة المجمعة ، وأخيرا كاشف النقل.اضغط على الخليط لمزجه جيدا واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف خليط النقل إلى خلايا 293T واخلطه بلطف عن طريق تدوير الأطباق. احتضان الألواح في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.تغيير الوسط بعد 24 ساعة. بعد 48 ساعة، تحقق من تعبير GFP تحت المجهر الفلوري لضمان كفاءة نقل عالية إلى خلايا 293T. جمع الخارقين للفيروس بعد 48 و 60 و 72 ساعة وتخزينها عند 4 درجات ، وإضافة وسط جديد ، 8 مل ، في كل نقطة زمنية بعد جمع الفيروس.قم بتصفية الفيروسات المجمعة باستخدام مرشح 0.4 ميكرون. للحصول على عيار عال من الفيروسات ، ركز الفيروسات المجمعة عن طريق الطرد المركزي الفائق. انقل المواد الفائقة للفيروسات المصفاة إلى 70 أنبوب Ti ، وأجهزة الطرد المركزي عند 18،000 غرام لمدة 2 ساعة.استخدم الدوار المبرد مسبقا وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات. أخرج الأنابيب من جهاز الطرد المركزي بعناية وقم بإزالة supernatant تماما. أعد تعليق الكريات بلطف في 400 ميكرولتر من DMEM بدون FBS والمضادات الحيوية باستخدام ماصة دقيقة ، احتضنها على الجليد لمدة 1 ساعة.Aliquot الفيروسات وتجميدها عند درجة سالب 80. احسب تركيز الفيروس كما هو موضح. تقدير كفاءة نقل فيروسات lentivirus.قم بتحويل الخلايا التائية 293T مع فيروس مركز بأحجام مختلفة ، 2 و 4 و 8 ، لتأكيد التحضير الناجح للفيروس lentivirus. القيمة للفيروس المركز إلى 100X لإجراء تجربة معايرة بالتحليل الحجمي في خط الخلية الهدف. البذور 1 مليون خط خلية مستهدفة في 1.5 مل من 10٪ RPMI المتوسطة تحتوي على 8 ميكروغرام لكل مل من البولي برين في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار.أضف أربعة وحدات تخزين مختلفة ، 1 ، 1.5 ، 2 ، 2.5 ميكرولتر من فيروسات 100X. قم بإجراء التطهير عن طريق الطرد المركزي للصفيحة عند 920 جم لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد 72 ساعة ، قم بقياس النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي.تحديد حجم الفيروسات للحصول على كفاءة نقل 30٪. هذه الكفاءة المنخفضة في النقل هي ضمان تكامل shRNA واحد لكل خلية. نقل مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة في خط الخلايا المقاومة للأدوية.احسب عدد الخلايا التي سيتم أخذها للتجربة على النحو التالي بناء على عدد التكاملات الفيروسية. إعادة تعليق 11 مليون خلية في 16 مل من 10٪ RPMI المتوسطة. أضف البوليبرين ، ثمانية ميكروغرام لكل مل واخلطه جيدا ، ثم أضف الحجم المطلوب من الفيروسات للحصول على كفاءة نقل 30٪ كما تم حسابها من قبل.زرع جميع الخلايا على صفيحة من ستة آبار بكثافة مليون خلية لكل 1.5 مل لكل بئر. الطرد المركزي للصفيحة لمدة 90 دقيقة عند 920 جم عند 37 درجة مئوية. احتضان اللوحة بين عشية وضحاها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسط ونقل الخلايا المحولة إلى قارورة T-75. بعد 48 ساعة ، تحقق من GFP تحت المجهر الفلوري لضمان النقل الناجح. بعد 72 ساعة ، قم بقياس GFP كميا عن طريق قياس التدفق الخلوي.إثراء الخلايا الإيجابية GFP. قم بتوسيع الخلايا المحولة عن طريق زراعتها بكثافة 0.5 مليون لكل مل لمدة 5 إلى 7 أيام ، وقم بإجراء فرز التدفق مع إعداد فرز التدفق المحدد على أنه نقاء عال وعائد منخفض. استزرع الخلايا التي تم فرزها في وسط RPMI بنسبة 10٪.بعد 72 ساعة ، قم بإجراء تقدير ما بعد الفرز للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP لضمان كفاءة فرز أكثر من 95٪. فحص التسرب لتحديد العوامل اللاجينية التي تتوسط في مقاومة الأدوية. قم بزراعة الخلايا المحولة إلى مكتبة shRNA في 10٪ RPMI لمدة تصل إلى 5 أيام.جهاز الطرد المركزي 10 ملايين خلية في نسختين مكررتين. تخلص من السوبرناتانت وخزن الكريات عند درجة حرارة 80 تحت الصفر. وستكون هذه العينات بمثابة مرجع أساسي لمكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال اللاجيني.قم بزراعة الخلايا المحولة المتبقية كتكرارات ، R1 و R2 ، يتم الاحتفاظ بكل منها في عدد الخلايا الذي يوفر تمثيلا 500X للمكتبة. علاج واحد من التكرارات مع المخدرات ، 10 سيتارابين ميكرومولار ، والآخر دون علاج بالعقاقير. تغيير الوسط للقوارير مع ، وبدون الدواء ، كل 72 ساعة.كرر التغيير المتوسط ثلاث مرات للتعرض التراكمي للدواء لمدة 9 أيام. بعد اليوم 9 من العلاج من تعاطي المخدرات ، تحقق من جدوى الخلايا عن طريق طريقة استبعاد تريبان الأزرق. قم بتدوير الخلايا المتبقية القابلة للحياة ، واغسلها باستخدام PBS المعقمة وأجهزة الطرد المركزي عند 280 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.تخلص من السوبرناتانت وخزن الكريات عند ناقص 80 لاستخراج الحمض النووي. تضخيم shRNAs المتكاملة بواسطة PCR. استخراج الحمض النووي من خلايا خط الأساس المحولة ، والخلايا المعالجة وغير المعالجة ، تليها التحقق من التركيز باستخدام مقياس الفلورومتر ، وحساب كمية الحمض النووي المطلوبة كما هو موضح وإخضاع العينات للجولة الأولى من PCR.ويبين الجدول 2 خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع ظروف التدوير الحراري. قم بإعداد تفاعلات متعددة تحتوي على 850 نانوغرام من الحمض النووي لكل أنبوب لما مجموعه 43 تفاعلا. تجميع منتجات PCR وتنقيتها.قم بالتخلص من المنتجات في مخزن مؤقت سعة 50 ميكرولتر وقم بتحديدها كميا ، وأخيرا قم بتخزينها عند 20 ميكرولتر. بالنسبة للجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم الاشعال للفهرس العكسي ويتم جدولة الكواشف في الجدول 4. قم بإعداد أربعة تفاعلات مع 500 نانوغرام من منتج PCR الأساسي في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل عينة إلى جانب التحكم السلبي.قم بتحميل المنتج بالكامل للرحلان الكهربائي باستخدام 2٪ TBE agarose gel وتأكد من حجم النطاق باستخدام سلم جزيء KB واحد. تصور منتجات PCR على نظام توثيق الهلام. قم بقص الشريط المحدد وتنقيته باستخدام مجموعة تنقية الهلام.وترد في الجدول 3 حسابات للتنقية باستخدام المجموعة. Elute في حجم نهائي من 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت elution مع التركيز التقريبي لكل eluent حوالي 80 إلى 90 نانوجرام لكل ميكرولتر. تسلسل الجيل التالي وتحليل البيانات.تخضع المنتجات المنقاة بالهلام لتسلسل الجيل التالي للحصول على عدد القراءة لاحتياجات shRNA المستنفدة. قم بقص تسلسلات المحول ، ومحاذاة القراءات المصفاة مع التسلسلات المرجعية ، وتحميل الملفات باستخدام SAMtools للحصول على ملخص المحاذاة. قم بتحميل ملفات fastQ المقتطعة في CRISPRCloud2 وقم بإجراء التحليل وفقا للتعليمات.انقر على الرابط المتوفر لجهاز CRISPRCloud2. حدد نوع الشاشة كشاشتي البقاء على قيد الحياة والتسرب. قم بتعيين عدد المجموعات واكتب اسم كل مجموعة.قم بتحميل المكتبة المرجعية بتنسيق ملف FASTA. تتم معالجة البيانات التي تم تحميلها وتتوفر النتائج في عنوان URL المحدد. البيانات التمثيلية.يوضح هذا الشكل MV4-11 الخلايا الأبوية والمقاومة المعالجة بزيادة تركيز السيتارابين ، و 0.1 ميكرومولار إلى 1000 ميكرومولار ، وتقييم الجدوى بواسطة فحص MTT. يوضح هذا الشكل مخططات التدفق التمثيلية ل GFP التي تم تحديدها كميا بواسطة قياس التدفق الخلوي في نهاية 72 ساعة لمروجي EF-1 alpha البشري و CMV البشري و SFFV. يظهر CMV البشري ذروتنا غير المتجانسة بينما يظهر EF-1 alpha و SFFV البشري ذروة واحدة متجانسة.يوضح هذا الشكل الرسم البياني الشريطي لكفاءات المروج الثلاثة المختلفة في MV4-11. أظهر GFP الذي يحركه SFFV إسكات GFP في الثقافة الطويلة. أظهرت خلايا GFP المدفوعة بألفا hEF-1 تعبيرا مستداما بعد فرز هذه الخلايا.تظهر اللوحة اليسرى كفاءة النقل لمكتبة shRNA المجمعة التي تم نقلها في 293T في نهاية 48 ساعة تحت المجهر الفلوري. تظهر اللوحة اليمنى كفاءة نقل فيروس المسبح في الخلايا التائية 293T مع أحجام فيروسات مختلفة ، 2 و 4 و 8 ميكرولتر. يمثل هذا الرقم كفاءة النقل في خط الخلايا المقاومة MV4-11 مع أحجام مختلفة من الفيروسات ، مثل 1 و 1.5 و 2 و 2.5 ميكرولتر لتحقيق كفاءة نقل 30٪.يوضح هذا الشكل فرز الخلايا الإيجابية GFP بكفاءة نقل 30٪ مع إعداد فرز عالي النقاء ومنخفض الغلة. يوضح الشكل توضيحا تخطيطيا للعلاج الدوائي للخلايا المصنفة إيجابية GFP للتعرض المطول للسيتارابين لمدة 9 أيام ، يليه التحقق من الجدوى وجمع الخلايا بحثا عن الحمض النووي. يوضح هذا الشكل مناطق ربط التمهيدي المستخدمة في الجولة الأولى والثانية من PCR.يوضح هذا الشكل حجم النطاق لمنتج PCR في نهاية الجولة الأولى من PCR ، وزوج قاعدة 397 ، وزوج قاعدة منتج PCR 399 في الجولة الثانية ، والذي تم التخلص منه وتنقيته وإعطاؤه ل NGS. يوضح هذا الشكل تمثيل الحمض النووي الريبوزي المرسال المخصب أو المستنفد الذي يستهدف العوامل اللاجينية التي يمكن أن تتوسط في مقاومة السيتارابين في AML. استنتاج. يسلط هذا البروتوكول الضوء على أهمية الفحص المستهدف بالضربة القاضية لاستجواب كل من الجينات الأساسية وغير الأساسية بشكل منهجي ويوضح استخدام هذا النهج كمنصة وظيفية ، مما يسمح بتحديد الأهداف المسؤولة عن مقاومة الأدوية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

باستخدام الحمض النووي الريبي لكشف التسلسل رواية لصق المتغيرات ذات الصلة لمقاومة المخدرات في<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج السرطان

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

الفرز على نطاق الجينوم [رني] تحديد العوامل المضيفة التي تعدل علاج فيروس أونكوليتيك

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لتحديد الجينات المستهدفة NFAT2 الرواية في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

سير عمل تكامل البيانات لتحديد مجموعات الأدوية التي تستهدف التفاعلات القاتلة الاصطناعية

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...