Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
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这项研究部分由生物技术部BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013向SRV拨款资助;和印度生物技术部BT /COE/34/SP13432/2015和印度科学技术部：EMR/2017/003880至P.B. RVS和P.B分别得到惠康DBT印度联盟IA/S/17/1/503118和IA/S/15/1/501842的支持。S.D.由CSIR-UGC奖学金支持，S.I.由ICMR高级研究奖学金支持。我们感谢Abhirup Bagchi，Sandya Rani和CSCR流式细胞术核心设施工作人员的帮助。我们还感谢MedGenome Inc.在高通量测序和数据分析方面的帮助。

遵循机构生物安全委员会（IBSC）指南，并使用适当的设施处理慢病毒（BSL-2）。应对人员进行慢病毒处理和处置方面的适当培训。该协议遵循韦洛尔基督教医学院的生物安全指南。
1. 选择最有效的启动子以获得shRNA的持久和长期表达
注意：必须使用具有表达荧光蛋白的不同启动子的慢病毒载体进行转导实验，以鉴定在为实验选择的细胞系中提?...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA干扰（RNAi）广泛用于功能基因组学研究，包括siRNA和shRNA筛选。shRNA的好处是它们可以掺入质粒载体中并整合到基因组DNA中，从而实现稳定的表达，从而延长靶mRNA的敲低时间。与传统的阵列筛选（siRNA）相比，合并的shRNA文库筛选具有稳健性和成本效益。在全基因组筛选中鉴定特定类别蛋白质的本质可能很麻烦。靶向筛选方法可以揭示单个蛋白质对特定类别中癌细胞存活或耐药性的重要性，同时?...

急性髓系白血病（AML）的治疗选择在过去近五十年中一直保持不变，阿糖胞苷（AraC）和蒽环类药物是治疗该疾病的基石。AML治疗成功的挑战之一是白血病干细胞对化疗的抵抗力，导致疾病复发1，2。表观遗传调控在癌症发病机制和耐药性中起着至关重要的作用，几种表观遗传因素已成为有希望的治疗靶点3，4，5。表观遗传调控机制影响持续暴露于化疗药物下的增殖和存活。非血液恶性肿瘤的研究表明，克服药物效应的一小部分细胞经历各种表观遗传学修饰，导致这些细胞的存活率6，7。然而，表观遗传因素在介导AML中对阿糖胞苷的获得性耐药性中的作用尚未得到探索。
高通量筛选是一种药物发现方法，随着时间的推移，它已经获得了全球的重要性，并已成为不同方面的标准方法，用于鉴定细胞机制中的潜在靶标，用于途径分析以及分子水平8，9。合成致死性概念涉及两个基因之间的相互作用，其中任何一个基因的扰动单独是可行的，但两个基因同时导致生存能力的丧失10。在癌症治疗中利用合成致死性可以帮助识别和机械地表征强大的合成致死遗传相互作用11。我们采用了具有合成致死性的高通量shRNA筛选的组合方法，以确定AML中导致获得性阿糖胞苷耐药性的表观遗传因素。
已知由混系白血病基因（MLL 或 KMT2A）染色体易位引起的急性白血病与患者生存率低有关。由此产生的 MLL 基因重排的嵌合产物，即MLL融合蛋白（MLL-FPs），可以在多种表观遗传因素的参与下将造血干细胞/祖细胞（HSPC）转化为白血病原始细胞。这些表观遗传调节剂构成了一个复杂的网络，决定了白血病计划的维持，因此可能形成潜在的治疗靶点。在这种情况下，我们使用MV4-11细胞系（含有MLL融合基因MLL-AF4和FLT3-ITD突变;称为MV4-11 P）来开发获得性阿糖胞苷抗性细胞系，称为MV4-11 AraC R。细胞系暴露于增加剂量的阿糖胞苷，从药物治疗中间歇性恢复，称为药物假期。通过 体外 细胞毒性测定评估半最大抑制浓度（IC50）。
我们使用由具有pZIP慢病毒主链的hEF1a启动子驱动的合并表观遗传shRNA文库（参见 材料表）。该文库包含靶向407个表观遗传因子的shRNA。每个因子有5-24个shRNA，总共有5，485个shRNA，包括5个非靶向对照shRNA。修饰的“UltrmiR”miR-30支架已针对高效的初级shRNA生物发生和表达12，13进行了优化。
该实验的轮廓如图 1A所示。目前的方案侧重于使用MV4-11 AraC R细胞系（图1B）中的表观遗传因子shRNA文库进行RNAi筛选，这是一种悬浮细胞系。该方案可用于筛选自己选择的任何耐药细胞系中的任何靶向文库。应该注意的是，贴壁细胞的转导方案将有所不同。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

了解获得性化疗耐药的临床相关驱动因素机制对于阐明规避急性髓系白血病 （AML） 患者耐药性和提高生存率的方法至关重要。一小部分在化疗后存活的白血病细胞具有稳定的表观遗传状态，可以耐受化疗损伤。进一步暴露于化疗使这些药物持久性细胞达到固定的表观遗传状态，这导致基因表达改变，导致这些耐药人群的增殖，并最终复发或难治性疾病。因此，确定需要耐药性白血病细胞存活的表观遗传调节至关重要。我们详细介绍了一种方案，用于鉴定表观遗传调节剂，该方案使用在获得性抗阿糖胞苷的AML细胞系中进行池化shRNA文库筛选来介导对核苷类似物阿糖胞苷（AraC）的抗性。该文库由5，485个shRNA构建体组成，靶向407个人类表观遗传因子，允许高通量表观遗传因子筛选。

整体筛选工作流程如图1A所示。MV4-11 AraC R的体外细胞毒性（48小时）显示MV4-11 AraC R中CYTARABINE的IC50高于MV4-11 P（图1B）。该细胞系在研究中被用作筛选导致阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子的模型。
图2A 显示了具有三种不同启动子的线性化pZIP载体图谱：hEF1α（人伸长因子1α），hCMV（人巨细胞?...

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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

使用慢病毒 shRNA 池的高通量 RNA 干扰 （RNAi） 筛选可以成为检测恶性肿瘤中治疗相关合成致死靶标的工具。我们提供一种合并的shRNA筛选方法来研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传效应子。

合并的shRNA文库筛选，以确定调节耐药性表型的因素

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

以下视频的总体目标是演示使用合并的shRNA表观遗传文库进行阴性选择筛选。该筛选能够通过测序鉴定特定的表观遗传靶标。该程序可以帮助确定负责介导AML中获得性阿糖胞苷耐药性的表观遗传因素步骤如下。选择最有效的启动子以获得shRNA的持久和长期表达。目前的方案侧重于在阿糖胞苷耐药MV4-11细胞系中使用表观遗传因子shRNA文库进行RNAi筛选。用于此目的的启动子是人EF-1 α，人CMV和SFFV，它们表达绿色荧光蛋白的启动子。使用台盼蓝排除法进行细胞计数。将细胞悬浮在含有每mL聚苯乙烯8微克的10%RPMI培养基中。将100万个细胞接种在六孔板的每孔1.5ml培养基中，一式三份。加入不同体积的浓缩慢病毒。例如，慢病毒，例如10，20和40微升，取决于慢病毒对每个孔的滴度。轻轻旋转盘子以混合内容物。通过在37摄氏度下以920g离心90分钟进行旋转干燥。立即在二氧化碳培养箱中孵育板。在48小时结束时观察GFP，并在72小时结束时量化GFP。接下来，按照流程图中描述的步骤选择在整个培养物中表现出一致的GFP表达的启动子。制备合并的慢病毒人表观遗传因子shRNA文库。在三个10厘米的细胞培养皿中以低传代数培养293T细胞，具有良好的增殖率，每个板中含有8ml 10%DMFM培养基。一旦细胞达到60%汇合度，请完全用新鲜培养基替换。按照概述制备转染混合物，其中包含无血清培养基，慢病毒包装质粒PAX2，包膜质粒pMD2。G、合并文库质粒，最后转染试剂。点击混合物充分混合，并在室温下孵育15分钟。将转染混合物加入293T细胞中，并通过旋转板轻轻混合。在二氧化碳培养箱中孵育板。24 小时后更换培养基。48小时后，在荧光显微镜下检查GFP表达，以确保高转染效率进入293T细胞。收集病毒48，60和72小时后收集病毒上清液，并在收集病毒后的每个时间点加入新鲜培养基8ml。用0.4微米过滤器过滤合并的病毒。为了获得高滴度的病毒，通过超速离心浓缩合并的病毒。将过滤的病毒上清液转移到70 Ti管中，并在18， 000g下离心2小时。使用预冷转子和4度离心机。小心地从离心机中取出管子并完全除去上清液。使用微量移液管将沉淀轻轻地重悬于400微升DMEM中，不含FBS和抗生素，在冰上孵育1小时。等分病毒，并在零下80度冷冻。如图所示计算病毒的浓度。慢病毒转导效率的估计。用不同体积（2、4和8）的浓缩病毒转导293T细胞，以确认慢病毒的成功制备。将浓缩病毒的值提高到100X以在靶细胞系中进行滴定实验。将100万靶细胞系在1.5ml含有每ml8微克聚苯乙烯的10%RPMI培养基中，在一孔六孔板中。添加四个不同的体积，1，1.5，2，2.5微升的100X病毒。通过在37摄氏度下将板在920g下离心90分钟进行旋转干燥。72小时后，通过流式细胞术测量GFP阳性细胞的百分比。确定病毒的体积，以获得30%的转导效率。这种低转导效率是为了确保每个细胞的单个shRNA整合。耐药细胞系中合并的表观遗传shRNA文库的转导。根据病毒整合物的数量计算实验的细胞数量，如下所示。将1100万个细胞重悬于16 ML的10%RPMI培养基中。加入聚丁二烯，每毫升8微克，搅拌均匀，然后加入所需体积的病毒，得到前计算的30%转导效率。将所有细胞以每孔1.5ml每孔100万个细胞的密度接种在六孔板上。将板在37摄氏度下以920g离心90分钟。将板在二氧化碳培养箱中孵育过夜。24小时后，更换培养基并将转导细胞转移到T-75烧瓶中。48小时后，在荧光显微镜下检查GFP以确保转导成功。72小时后，通过流式细胞术定量GFP。富集GFP阳性细胞。通过将转导细胞以每毫升50万的密度培养5至7天来扩增转导细胞，并在流动分选设置为高纯度和低产量的情况下进行流动分选。在10%RPMI培养基中培养分选的细胞。72小时后，对GFP阳性细胞的百分比进行分选后估计，保证95%以上的分选效率。辍学筛查，以确定介导耐药性的表观遗传因素。在10%RPMI中培养shRNA文库转导的细胞长达5天。一式两份离心1000万个细胞。弃去上清液并将沉淀储存在零下80度。这些样品将作为表观遗传shRNA文库的基线参考。将剩余的转导细胞培养为重复的R1和R2，每个都保持在细胞计数，提供库的500X表示。用药物治疗其中一种重复物，10微摩尔阿糖胞苷，另一种不使用药物治疗。每72小时更换一次有药瓶和不带药物的培养基。重复更换培养基三次，累积药物暴露9天。药物治疗第9天后，用台盼蓝排除法检查细胞的活力。旋转剩余的活细胞，用无菌PBS洗涤，并在室温下以280g离心5分钟。弃去上清液并将沉淀储存在零下80度以进行DNA提取。通过PCR扩增整合的shRNA。从转导的基线细胞，处理和未处理的细胞中提取DNA，然后使用荧光计检查浓度，计算所需的DNA量，如图所示，并对样品进行第一轮PCR。PCR反应混合物在表2中描述了具有热循环仪的条件。建立每个管含有850纳克DNA的多个反应，总共43个反应。合并PCR产物并纯化它们。在50微升缓冲液中洗脱产品并对其进行定量，最后以零下20微升的速度储存。对于第二轮PCR，使用反向索引引物，试剂在表4中制成表格。每个样品的总反应体积为50微升，用500纳克的初级PCR产物建立四个反应以及阴性对照。使用2%TBE琼脂糖凝胶加载整个产品进行电泳，并用一个KB分子分子量标准品确认条带尺寸。在凝胶文档系统上可视化PCR产物。切除特定条带并使用凝胶纯化试剂盒纯化。使用该试剂盒进行纯化的计算结果见表3。在最终体积为30微升的洗脱缓冲液中洗脱，每种洗脱液的近似浓度约为每微升80至90纳克。下一代测序和数据分析。凝胶纯化产物进行下一代测序，以获得耗尽的shRNA需求的读取计数。修剪适配器序列，将过滤后的读取与参考序列对齐，使用 SAMtools 加载文件以获取对齐摘要。在CRISPRCloud2中加载修剪的fastQ文件，并按照说明执行分析。点击为CRISPRCloud2提供的链接。选择屏幕类型作为生存和辍学屏幕。设置组的数量并键入每个组的名称。将参考库作为 FASTA 文件格式上传。上传的数据将被处理，结果在给定的URL中可用。代表性数据。该图显示了用增加阿糖胞苷浓度，0.1微摩尔至1，000微摩尔以及通过MTT测定进行活力评估的MV4-11亲本和耐药细胞。该图显示了在 72 小时结束时通过流式细胞术定量的 GFP 的代表性流图，用于人 EF-1 α、人 CMV 和 SFFV 启动子。人CMV显示我们的异质峰，而人EF-1α和SFFV显示单个均质峰。该图显示了MV4-11中三种不同启动子效率的条形图。SFFV驱动的GFP在长期培养中显示出GFP的沉默。hEF-1 α驱动的GFP细胞在分选后显示出这些细胞的持续表达。左图显示了在荧光显微镜下48小时结束时在293T中转染的混合shRNA文库的转染效率。右图显示了池病毒在具有不同病毒体积（2、4和8微升）的293T细胞中的转导效率。该图代表了MV4-11耐药细胞系中不同体积病毒的转导效率，如1，1.5，2，2.5微升，以实现30%的转导效率。该图显示了GFP阳性细胞的分选，转导效率为30%，具有高纯度和低产率分选设置。该图显示了GFP阳性分选细胞在长期暴露于阿糖胞苷9天的药物治疗示意图，然后检查活力并收集细胞以获取DNA。该图显示了第一轮和第二轮PCR中使用的引物的结合区域。该图说明了第一轮PCR末端的PCR产物，397碱基对和第二轮PCR产物399碱基对的条带大小，该产物被凝胶洗脱，纯化并给予NGS。该图说明了富集或耗尽的shRNA的表示，这些shRNA靶向可能介导AML中阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子。结论。该协议强调了靶向敲低筛选的重要性，以系统地询问必需和非必需基因，并证明将这种方法用作功能平台，允许识别负责耐药性的靶标。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

利用RNA测序来检测新剪接变异体在相关耐药<em&gt;体外</em&gt;癌症模型

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

科研

癌症研究

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

利用功能基因组筛选识别在肿瘤细胞球体培养潜在的新药物靶标

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

流动 Cytometry-based 药物筛选系统对促进细胞分化胶质母细胞瘤小分子的鉴定

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

寻找获得性抗靶治疗的驱动途径: 耐药亚克隆生成与基因击倒敏感性恢复

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

全基因组的 rna 干扰筛查以确定调节溶瘤病毒治疗的宿主因素

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

高通量三维肿瘤球体药物筛选的生成

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

一种检测慢性淋巴细胞白血病新 nfat2 靶基因的染色质免疫沉淀法

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

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In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

数据集成工作流，以识别针对合成致命相互作用的药物组合

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Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

斑马鱼原发性患者衍生肿瘤异种移植物的药物筛选

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...