Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Denne undersøgelse finansieres delvist af et Institut for Bioteknologi tilskud BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 til SRV; og Institut for Bioteknologi Indien BT/ COE / 34 / SP13432/2015 og Institut for Videnskab og Teknologi, Indien: EMR / 2017 / 003880 til P.B. RVS og P.B. understøttes af henholdsvis Wellcome DBT India Alliance IA / S / 17/ 1 / 503118 og IA / S / 15/1 / 501842. S.D. støttes af CSIR-UGC-stipendiet, og S.I. støttes af et ICMR-seniorforskningsstipendium. Vi takker Abhirup Bagchi, Sandya Rani og CSCR Flow Cytometry Core Facility-personalet for deres hjælp. Vi takker også MedGenome Inc. for at hjælpe med sekventering og dataanalyse med høj kapacitet.

Følg retningslinjerne fra Institutional Biosafety Committee (IBSC), og brug den rette facilitet til at håndtere lentivirus (BSL-2). Personalet bør være behørigt uddannet i håndtering og bortskaffelse af lentivirus. Denne protokol følger retningslinjerne for biosikkerhed fra Christian Medical College, Vellore.
1. Udvælgelse af den mest potente promotor for at opnå vedvarende og langvarig ekspression af shRNA'erne
BEMÆRK: Det er vigtigt at udf...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA-interferens (RNAi) anvendes i vid udstrækning til funktionelle genomiske undersøgelser, som omfatter siRNA- og shRNA-screening. Fordelen ved shRNA er, at de kan inkorporeres i plasmidvektorer og integreres i genomisk DNA, hvilket resulterer i stabil ekspression og dermed mere langvarig knockdown af mål-mRNA'et. En poolet shRNA-biblioteksscreening er robust og omkostningseffektiv sammenlignet med de konventionelle arrayed screens (siRNA). Det kan være besværligt at identificere væsentligheden af en bestemt klass...

Terapeutiske muligheder i akut myeloid leukæmi (AML) har været uændrede i næsten de sidste fem årtier, med cytarabin (AraC) og anthracycliner som hjørnestenen til behandling af sygdommen. En af udfordringerne for succesen med AML-terapi er leukæmiske stamcellers resistens over for kemoterapi, hvilket fører til sygdomstilbagefald 1,2. Epigenetisk regulering spiller en afgørende rolle i kræftpatogenese og lægemiddelresistens, og flere epigenetiske faktorer har vist sig som lovende terapeutiske mål 3,4,5. Epigenetiske reguleringsmekanismer påvirker spredning og overlevelse under kontinuerlig eksponering for kemoterapeutiske lægemidler. Undersøgelser af ikke-hæmatologiske maligniteter har rapporteret, at en lille brøkdel af celler, der overvinder lægemiddeleffekten, gennemgår forskellige epigenetikmodifikationer, hvilket resulterer i disse cellers overlevelse 6,7. Epigenetiske faktorers rolle i formidlende erhvervet resistens over for cytarabin i AML er imidlertid ikke blevet undersøgt.
Screening med høj kapacitet er en tilgang til lægemiddelopdagelse, der har fået global betydning over tid og er blevet en standardmetode i forskellige aspekter til at identificere potentielle mål i cellulære mekanismer, til vejprofilering og på molekylært niveau 8,9. Begrebet syntetisk dødelighed involverer interaktionen mellem to gener, hvor forstyrrelsen af begge gener alene er levedygtig, men af begge gener samtidig resulterer i tab af levedygtighed10. Udnyttelse af syntetisk dødelighed i kræftbehandling kan hjælpe med at identificere og mekanisk karakterisere robuste syntetiske dødelige genetiske interaktioner11. Vi har vedtaget en kombinatorisk tilgang til shRNA-screening med høj gennemstrømning med syntetisk dødelighed for at identificere de epigenetiske faktorer, der er ansvarlige for erhvervet cytarabinresistens i AML.
Akutte leukæmier drevet af kromosomtranslokation af det blandede slægts leukæmigen (MLL eller KMT2A) vides at være forbundet med dårlig overlevelse hos patienter. De resulterende kimære produkter af MLL-genomlejringer, dvs. MLL-fusionsproteiner (MLL-FP'er), kan omdanne hæmatopoietiske stamceller / stamceller (HSPC'er) til leukæmiske blaster med inddragelse af flere epigenetiske faktorer. Disse epigenetiske regulatorer udgør et kompliceret netværk, der dikterer vedligeholdelsen af leukæmiprogrammet og derfor kan danne potentielle terapeutiske mål. I denne sammenhæng brugte vi MV4-11-cellelinjen (der huser MLL-fusionsgenet MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutationen; betegnet som MV4-11 P) til at udvikle den erhvervede cytarabinresistente cellelinje, betegnet som MV4-11 AraC R. Cellelinjen blev udsat for stigende doser cytarabin med intermitterende genopretning fra lægemiddelbehandlingen, kendt som en lægemiddelferie. Den halvmaksimale hæmmende koncentration (IC50) blev vurderet ved in vitro-cytotoksicitetsassay.
Vi brugte det poolede epigenetiske shRNA-bibliotek (se tabel over materialer) drevet af hEF1a-promotoren med en pZIP lentiviral rygrad. Dette bibliotek består af shRNA'er rettet mod 407 epigenetiske faktorer. Hver faktor har 5-24 shRNA'er med i alt 5.485 shRNA'er, herunder fem ikke-målrettede kontrol-shRNA'er. Det modificerede "UltrmiR" miR-30 stillads er optimeret til effektiv primær shRNA-biogenese og ekspression12,13.
Omridset af dette eksperiment er illustreret i figur 1A. Den nuværende protokol fokuserer på RNAi-screening ved hjælp af den epigenetiske faktor shRNA-biblioteket i MV4-11 AraC R-cellelinjen (figur 1B), en suspensionscellelinje. Denne protokol kan bruges til at screene ethvert målrettet bibliotek i enhver lægemiddelresistent cellelinje efter eget valg. Det skal bemærkes, at transduktionsprotokollen vil være forskellig for klæbende celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Forståelse af klinisk relevante drivermekanismer for erhvervet kemoresistens er afgørende for at belyse måder at omgå resistens på og forbedre overlevelsen hos patienter med akut myeloid leukæmi (AML). En lille brøkdel af leukæmiske celler, der overlever kemoterapi, har en klar epigenetisk tilstand til at tolerere kemoterapeutisk fornærmelse. Yderligere eksponering for kemoterapi gør det muligt for disse lægemiddel persisterceller at opnå en fast epigenetisk tilstand, hvilket fører til ændret genekspression, hvilket resulterer i spredning af disse lægemiddelresistente populationer og til sidst tilbagefald eller ildfast sygdom. Derfor er det afgørende at identificere epigenetiske moduleringer, der nødvendiggør overlevelse af lægemiddelresistente leukæmiske celler. Vi beskriver en protokol til identifikation af epigenetiske modulatorer, der medierer resistens over for nukleosidanalog cytarabin (AraC) ved hjælp af poolet shRNA-biblioteksscreening i en erhvervet cytarabinresistent AML-cellelinje. Biblioteket består af 5.485 shRNA-konstruktioner rettet mod 407 humane epigenetiske faktorer, hvilket muliggør epigenetisk faktorscreening med høj gennemstrømning.

Den overordnede screeningsarbejdsgang er afbildet i figur 1A. In vitro-cytotoksiciteten af MV4-11 AraC R (48 timer) afslørede, at IC50 til cytarabin i MV4-11 AraC R var højere end MV4-11 P (figur 1B). Denne cellelinje blev anvendt i undersøgelsen som model til screening af de epigenetiske faktorer, der er ansvarlige for cytarabinresistens.
Figur 2A viser de lineariserede pZIP-...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

RNA-interferens (RNAi) screening med høj gennemstrømning ved hjælp af en pulje af lentivirale shRNA'er kan være et værktøj til at detektere terapeutisk relevante syntetiske dødelige mål i maligniteter. Vi tilbyder en poolet shRNA-screeningsmetode til at undersøge de epigenetiske effektorer ved akut myeloid leukæmi (AML).

Pooled shRNA Library Screening for at identificere faktorer, der modulerer en lægemiddelresistensfænotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Det overordnede mål med den følgende video er at demonstrere brugen af det poolede shRNA epigenetiske bibliotek til at gennemføre en negativ selektionsscreening. Denne screening gør det muligt at identificere specifikke epigenetiske mål gennem sekventering. Denne procedure kan hjælpe med at identificere de epigenetiske faktorer, der er ansvarlige for at formidle erhvervet cytarabinresistens i AML Trinene er som følger.Udvælgelse af den mest potente promotor for at opnå vedvarende og langvarig ekspression af shRNA'erne. Den nuværende protokol fokuserer på RNAi-screening ved hjælp af epigenetisk faktor shRNA-bibliotek i cytarabinresistent MV4-11-cellelinje. De promotorer, der anvendes til dette formål, er human EF-1 alpha, human CMV og SFFV, promotorer, der udtrykker grønt fluorescensprotein.Tag celletællingen ved hjælp af trypan blå eksklusionsmetode. Suspender cellerne i 10% RPMI medium indeholdende 8 mikrogram pr. Ml polybrene. Frø 1 million celler i 1,5 ml medium pr. Brønd af en seks-brønds plade i triplikater.Tilsæt forskellige mængder koncentrerede lentivirus. For eksempel lentivirus, for eksempel 10, 20 og 40 mikroliter, afhængigt af titeren af lentivirus til hver brønd. Hvirvl forsigtigt pladen for at blande indholdet.Udfør spinfektion ved centrifugering ved 920 g ved 37 grader celsius i 90 minutter. Inkuber straks pladerne i en kuldioxidinkubator. Overhold GFP i slutningen af 48 timer og kvantificer det samme i slutningen af 72 timer.Følg derefter trinnene som afbildet i rutediagrammet for at vælge promotoren, der viser ensartet GFP-udtryk i hele kulturen. Forberedelse af det poolede lentivirale humane epigenetiske faktor shRNA-bibliotek. Kultur 293T-celler ved et lavt passagetal med en god spredningshastighed i tre 10 centimeter cellekulturretter med 8 ml 10% DMFM-medium i hver plade.Når cellerne når 60% sammenflydende, skal du erstatte med frisk medium fuldstændigt. Forbered transfektionsblandingen som skitseret, der indeholder serumfrit medium, lentiviral emballageplasmid PAX2, kuvertplasmid pMD2. G, poolede biblioteksplasmider og endelig transfektionsreagenset.Tryk på blandingen for at blande den godt og inkubere ved stuetemperatur i 15 minutter. Tilsæt transfektionsblandingen til 293T-cellerne og bland forsigtigt ved at hvirvle pladerne. Inkuber pladerne i en kuldioxidinkubator.Skift medium efter 24 timer. Efter 48 timer skal du kontrollere for GFP-ekspression under et fluorescensmikroskop for at sikre høj transfektionseffektivitet i 293T-celler. Saml virussupernatanterne efter 48, 60 og 72 timer og opbevare dem ved 4 grader, og tilsæt frisk medium, 8 ml, på hvert tidspunkt efter indsamling af virussen.Filtrer de samlede vira med 0,4 mikron filter. For at opnå en høj titer af vira, koncentrer de poolede vira ved ultracentrifugation. Overfør de filtrerede virussupernatanter til 70 Ti-rør og centrifuge ved 18.000 g i 2 timer.Brug forkølet rotor og centrifuge ved 4 grader. Tag rørene forsigtigt ud af centrifugen, og fjern supernatanten helt. Resuspend pelleten forsigtigt i 400 mikroliter DMEM uden FBS og antibiotika ved hjælp af en mikropipette, inkuber på is i 1 time.Aliquot virus og frys ved minus 80 grader. Beregn koncentrationen af virussen som vist. Estimering af transduktionseffektiviteten af lentivirus.Transducer 293T-celler med en koncentreret virus i forskellige volumener, 2, 4 og 8, for at bekræfte den vellykkede fremstilling af lentivirus. Værdi til koncentreret virus til 100X for at udføre et titreringseksperiment i målcellelinjen. Frø 1 million målcellelinje i 1,5 ml 10% RPMI-medium indeholdende 8 mikrogram pr. ml polybren i en brønd i en seks-brønds plade.Tilføj fire forskellige volumener, 1, 1.5, 2, 2.5 mikroliter af 100X vira. Udfør spinfektion ved centrifugering af pladen ved 920 g i 90 minutter ved 37 grader celsius. Efter 72 timer måles procentdelen af GFP-positive celler ved flowcytometri.Bestem virusets volumen for at opnå 30% transduktionseffektivitet. Denne lave transduktionseffektivitet er at sikre enkelt shRNA-integration pr. Celle. Transduktion af det poolede epigenetiske shRNA-bibliotek i den lægemiddelresistente cellelinje.Beregn antallet af celler, der skal tages til eksperimentet som nedenfor, baseret på antallet af virale integranter. Resuspend 11 millioner celler i 16 ML 10% RPMI medium. Tilsæt polybren, otte mikrogram pr. ml og bland godt, og tilsæt derefter det krævede volumen vira for at opnå 30% transduktionseffektivitet som beregnet før.Frø alle cellerne på en seks-brønds plade med en densitet på 1 million celler pr. 1,5 ml pr. Brønd. Centrifugering af pladen i 90 minutter ved 920 g ved 37 grader celsius. Inkuber pladen natten over i en kuldioxidinkubator.Efter 24 timer skiftes mediet og overføres de transducerede celler til en T-75-kolbe. Efter 48 timer skal du kontrollere GFP under et fluorescensmikroskop for at sikre en vellykket transduktion. Efter 72 timer kvantificeres GFP ved hjælp af flowcytometri.Berigelse af de GFP-positive celler. Udvid de transducerede celler ved at dyrke dem med en densitet på 0,5 millioner pr. ml i 5 til 7 dage, og udfør flowsortering med flowsorteringsindstillingen indstillet som høj renhed og lavt udbytte. Kultur de sorterede celler i et 10% RPMI medium.Efter 72 timer skal du udføre eftersorteringsestimatet af procentdelen af de GFP-positive celler for at sikre mere end 95% sorteringseffektivitet. Dropout screening for at identificere epigenetiske faktorer, der medierer lægemiddelresistens. Kultur shRNA bibliotekstransducerede celler i 10% RPMI i op til 5 dage.Centrifugering af 10 millioner celler i dubletter. Kassér supernatanten og opbevar pellets ved minus 80 grader. Disse prøver vil tjene som baseline reference for det epigenetiske shRNA bibliotek.Kultur de resterende transducerede celler som dubletter, R1 og R2, hver opretholdt ved et celletal, der giver en 500X repræsentation af biblioteket. Behandl en af duplikaterne med lægemidlet, 10 mikromolære cytarabin, og den anden uden lægemiddelbehandling. Skift mediet til kolberne med og uden lægemidlet hver 72. time.Gentag mediumændringen tre gange for en kumulativ lægemiddeleksponering på 9 dage. Efter 9. dag med lægemiddelbehandling skal du kontrollere cellernes levedygtighed ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetoden. Spin ned de resterende levedygtige celler, vask med steril PBS og centrifuge ved 280 g i 5 minutter ved stuetemperatur.Kassér supernatanten og opbevar pellets på minus 80 til DNA-ekstraktion. Forstærkning af de integrerede shRNAs ved hjælp af PCR. Ekstrakt DNA fra de transducerede baselineceller, behandlede og ubehandlede celler, efterfulgt af kontrol af koncentrationen ved hjælp af fluorometer, beregning af den krævede mængde DNA som vist og underfør prøverne til den første runde af PCR.PCR-reaktionsblandingen er afbildet i tabel 2 med de termiske cyklusbetingelser. Opsæt flere reaktioner indeholdende 850 nanogram DNA pr. rør til i alt 43 reaktioner. Pool PCR-produkterne og rens dem.Eluter produkterne i 50 mikroliter buffer og kvantificer dem, og til sidst opbevares på minus 20. Til anden runde PCR skal du bruge omvendte indeksprimere, og reagenserne er tabuleret i tabel 4. Opsæt fire reaktioner med 500 nanogram af det primære PCR-produkt i et samlet reaktionsvolumen på 50 mikroliter for hver prøve sammen med den negative kontrol.Læg hele produktet til elektroforese ved hjælp af 2% TBE agarosegel og bekræft båndstørrelsen med en KB-molekylestige. Visualiser PCR-produkterne på geldokumentationssystemet. Punktafgift det specifikke bånd og rens ved hjælp af et gelrensningssæt.Beregninger for rensning med kittet findes i tabel 3. Elute i et endeligt volumen på 30 mikroliter elueringsbuffer med den omtrentlige koncentration af hver eluent omkring 80 til 90 nanogram pr. Mikroliter. Næste generations sekventering og dataanalyse.De gelrensede produkter udsættes for næste generations sekventering for at opnå læsetællinger for de udtømte shRNA-behov. Trim adaptersekvenserne, juster de filtrerede læsninger til referencesekvenserne, indlæs filerne ved hjælp af SAMtools for at få justeringsoversigt. Indlæs de trimmede fastQ-filer i CRISPRCloud2, og udfør analysen i henhold til instruktionerne.Klik på linket til CRISPRCloud2. Vælg skærmtypen som Skærmbilleder Overlevelse og Frafald. Angiv antallet af grupper, og skriv navnet på hver gruppe.Upload referencebiblioteket som FASTA-filformat. Data, der uploades, behandles, og resultaterne er tilgængelige i den givne URL. Repræsentative data.Denne figur viser MV4-11 forældre- og resistente celler behandlet med stigende cytarabinkoncentration, 0,1 mikromolær til 1.000 mikromolær og levedygtighedsvurdering ved MTT-assay. Denne figur viser repræsentative strømningsplotter af GFP kvantificeret ved flowcytometri i slutningen af 72 timer for humane EF-1 alfa-, humane CMV- og SFFV-promotorer. Human CMV viser vores heterogene top, mens human EF-1 alfa og SFFV viser en enkelt homogen top.Denne figur viser søjlediagrammet for de tre forskellige promotoreffektivitetsgevinster i MV4-11. SFFV-drevet GFP viste dæmpning af GFP i langvarig kultur. hEF-1 alfa-drevne GFP-celler viste vedvarende ekspression efter sortering af disse celler.Det venstre panel viser transfektionseffektiviteten af det poolede shRNA-bibliotek transfekteret i 293T i slutningen af 48 timer under fluorescensmikroskopi. Det højre panel viser transduktionseffektiviteten af poolvirus i 293T-celler med varierende virusvolumener, 2, 4 og 8 mikroliter. Dette tal repræsenterer transduktionseffektiviteten i MV4-11 resistent cellelinje med varierende mængder vira, som 1, 1,5, 2, 2,5 mikroliter for at opnå 30% transduktionseffektivitet.Denne figur viser sorteringen af de GFP-positive celler med 30% transduktionseffektivitet med høj renhed og sortering med lavt udbytte. Figuren viser skematisk illustration af lægemiddelbehandling for de GFP-positive sorterede celler for en langvarig cytarabineksponering på 9 dage efterfulgt af kontrol af levedygtigheden og indsamling af cellerne til DNA. Denne figur viser bindingsområderne for primeren, der anvendes i første og anden runde af PCR.Denne figur illustrerer båndstørrelsen på PCR-produktet i slutningen af første runde PCR, 397 basepar og det andet runde PCR-produkt 399-basepar, som blev gelelueret, renset og givet til NGS. Denne figur illustrerer repræsentationen af de berigede eller udtømte shRA'er rettet mod de epigenetiske faktorer, der kan formidle cytarabinresistens i AML. Konklusion. Denne protokol fremhæver betydningen af målrettet knockdown-screening for systematisk at forhøre både essentielle og ikke-essentielle gener og demonstrerer brugen af denne tilgang som en funktionel platform, der gør det muligt at identificere mål, der er ansvarlige for lægemiddelresistens.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Brug RNA-sekventering til Detect Novel Splice Varianter Relateret til Drug Resistance i<em&gt; In vitro</em&gt; Kræft Modeller

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow flowcytometri-baserede stof Screening System til identifikation af små molekyler, der fremmer Celledifferentiering glioblastom stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Udkig efter Driver veje af erhvervet modstand mod målrettede terapi: resistente Subclone Generation og følsomhed gendannelse af genet Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide RNAi Screening at identificere vært faktorer, at modulerer Oncolytic Virus terapi

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En kromatin Immunoprecipitation analyse til at identificere nye NFAT2 Target gener i kronisk lymfatisk leukæmi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

En dataintegrationsarbejdsgang til identifikation af lægemiddelkombinationer, der er målrettet mod syntetiske dødelige interaktioner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...