Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Deze studie wordt gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van het Department of Biotechnology BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 aan SRV; en Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 en Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS en P.B. worden ondersteund door respectievelijk Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 en IA/S/15/1/501842. S.D. wordt ondersteund door de CSIR-UGC fellowship, en S.I. wordt ondersteund door een ICMR senior research fellowship. We bedanken Abhirup Bagchi, Sandya Rani en het personeel van de CSCR Flow Cytometry Core Facility voor hun hulp. We bedanken ook MedGenome Inc. voor het helpen met de high-throughput sequencing en data-analyse.

Volg de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee (IBSC) en gebruik de juiste faciliteit om lentivirus (BSL-2) te behandelen. Het personeel moet naar behoren worden opgeleid in de behandeling en verwijdering van lentivirus. Dit protocol volgt de bioveiligheidsrichtlijnen van Christian Medical College, Vellore.
1. Selectie van de krachtigste promotor om persistente en langdurige expressie van de shRNA's te verkrijgen
OPMERKING: Het is essen...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA-interferentie (RNAi) wordt veel gebruikt voor functionele genomicastudies, waaronder siRNA- en shRNA-screening. Het voordeel van shRNA is dat ze kunnen worden opgenomen in plasmidevectoren en kunnen worden geïntegreerd in genomisch DNA, wat resulteert in stabiele expressie en dus langdurigere knockdown van het doelmRNA. Een gepoolde shRNA-bibliotheekscreening is robuust en kosteneffectief in vergelijking met de conventionele arrayed screens (siRNA). Het identificeren van de essentialiteit van een specifieke klasse e...

Therapeutische opties bij acute myeloïde leukemie (AML) zijn de afgelopen vijf decennia onveranderd gebleven, met cytarabine (AraC) en anthracyclines als hoeksteen voor de behandeling van de ziekte. Een van de uitdagingen voor het succes van AML-therapie is de resistentie van leukemische stamcellen tegen chemotherapie, wat leidt tot terugval van de ziekte 1,2. Epigenetische regulatie speelt een vitale rol in de pathogenese van kanker en resistentie tegen geneesmiddelen, en verschillende epigenetische factoren zijn naar voren gekomen als veelbelovende therapeutische doelen 3,4,5. Epigenetische regulerende mechanismen beïnvloeden proliferatie en overleving bij continue blootstelling aan chemotherapeutische geneesmiddelen. Studies in niet-hematologische maligniteiten hebben gemeld dat een klein deel van de cellen die het geneesmiddeleffect overwinnen verschillende epigenetische modificaties ondergaan, wat resulteert in de overleving van die cellen 6,7. De rol van epigenetische factoren bij het bemiddelen van verworven resistentie tegen cytarabine in AML is echter niet onderzocht.
High-throughput screening is een benadering van geneesmiddelenontdekking die in de loop van de tijd wereldwijd aan belang heeft gewonnen en in verschillende aspecten een standaardmethode is geworden om potentiële doelen in cellulaire mechanismen, voor routeprofilering en op moleculair niveaute identificeren 8,9. Het concept van synthetische letaliteit omvat de interactie tussen twee genen waarbij de verstoring van een van beide genen alleen levensvatbaar is, maar van beide genen tegelijkertijd resulteert in het verlies van levensvatbaarheid10. Het benutten van synthetische letaliteit bij de behandeling van kanker kan helpen bij het identificeren en mechanistisch karakteriseren van robuuste synthetische dodelijke genetische interacties11. We hebben een combinatorische benadering van high-throughput shRNA-screening met synthetische letaliteit aangenomen om de epigenetische factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor verworven cytarabineresistentie in AML.
Van acute leukemieën gedreven door chromosomale translocatie van het gemengde-afstammingsleukemiegen (MLL of KMT2A) is bekend dat ze geassocieerd zijn met een slechte overleving bij patiënten. De resulterende chimere producten van MLL-genherschikkingen, d.w.z. MLL-fusie-eiwitten (MLL-FPs), kunnen hematopoëtische stam- / voorlopercellen (HSPC's) transformeren in leukemische blasten met de betrokkenheid van meerdere epigenetische factoren. Deze epigenetische regulatoren vormen een ingewikkeld netwerk dat het onderhoud van het leukemieprogramma dicteert en daarom potentiële therapeutische doelen kan vormen. In deze context gebruikten we de MV4-11 cellijn (met het MLL-fusiegen MLL-AF4 met de FLT3-ITD-mutatie; aangeduid als MV4-11 P) om de verworven cytarabine-resistente cellijn te ontwikkelen, aangeduid als MV4-11 AraC R. De cellijn werd blootgesteld aan toenemende doses cytarabine met intermitterend herstel van de medicamenteuze behandeling, bekend als een drugsvakantie. De half-maximale remmende concentratie (IC50) werd beoordeeld met behulp van een in vitro cytotoxiciteitstest.
We gebruikten de gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek (zie Tabel met materialen) aangedreven door de hEF1a-promotor met een pZIP lentiviral backbone. Deze bibliotheek bestaat uit shRNA's die zich richten op 407 epigenetische factoren. Elke factor heeft 5-24 shRNA's, met een totaal van 5.485 shRNA's, waaronder vijf niet-gerichte controle-shRNA's. De gemodificeerde "UltrmiR" miR-30 scaffold is geoptimaliseerd voor efficiënte primaire shRNA biogenese en expressie12,13.
De contouren van dit experiment zijn geïllustreerd in figuur 1A. Het huidige protocol richt zich op RNAi-screening met behulp van de epigenetische factor shRNA-bibliotheek in de MV4-11 AraC R-cellijn (figuur 1B), een suspensiecellijn. Dit protocol kan worden gebruikt om elke gerichte bibliotheek in elke medicijnresistente cellijn naar keuze te screenen. Opgemerkt moet worden dat het transductieprotocol anders zal zijn voor adherente cellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Het begrijpen van klinisch relevante drivermechanismen van verworven chemoresistentie is cruciaal voor het ophelderen van manieren om resistentie te omzeilen en de overleving te verbeteren bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML). Een klein deel van de leukemische cellen die chemotherapie overleven, hebben een geschikte epigenetische toestand om chemotherapeutische belediging te tolereren. Verdere blootstelling aan chemotherapie stelt deze medicijn persistercellen in staat om een vaste epigenetische toestand te bereiken, wat leidt tot veranderde genexpressie, wat resulteert in de proliferatie van deze medicijnresistente populaties en uiteindelijk terugval of refractaire ziekte. Daarom is het identificeren van epigenetische modulaties die de overleving van medicijnresistente leukemische cellen noodzakelijk maken, van cruciaal belang. We beschrijven een protocol om epigenetische modulatoren te identificeren die resistentie tegen het nucleoside analoge cytarabine (AraC) bemiddelen met behulp van gepoolde shRNA-bibliotheekscreening in een verworven cytarabine-resistente AML-cellijn. De bibliotheek bestaat uit 5.485 shRNA-constructies gericht op 407 menselijke epigenetische factoren, die epigenetische factorscreening met hoge doorvoer mogelijk maken.

De algemene screeningsworkflow is weergegeven in figuur 1A. In vitro cytotoxiciteit van de MV4-11 AraC R (48 h) onthulde dat de IC50 tot cytarabine in de MV4-11 AraC R hoger was dan de MV4-11 P (figuur 1B). Deze cellijn werd in de studie gebruikt als model voor het screenen van de epigenetische factoren die verantwoordelijk zijn voor cytarabineresistentie.
Figuur 2A toont de geli...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Het algemene doel van de volgende video is om het gebruik van de gepoolde shRNA epigenetische bibliotheek aan te tonen om een negatieve selectiescreening uit te voeren. Deze screening maakt het mogelijk om specifieke epigenetische doelen te identificeren door middel van sequencing. Deze procedure kan helpen bij het identificeren van de epigenetische factoren die verantwoordelijk zijn voor het bemiddelen van verworven cytarabineresistentie in AML De stappen zijn als volgt.Selectie van de krachtigste promotor om persistente en langdurige expressie van de shRNA's te verkrijgen. Het huidige protocol richt zich op RNAi-screening met behulp van epigenetische factor shRNA-bibliotheek in cytarabine-resistente MV4-11-cellijn. De promotors die voor dit doel worden gebruikt, zijn menselijke EF-1 alfa, menselijke CMV en SFFV, promotors die groene fluorescentie-eiwitten tot expressie brengen.Neem het celgetal met de trypan blue-uitsluitingsmethode. Suspensie van de cellen in een 10%RPMI-medium met 8 microgram per ml polybreen. Zaai 1 miljoen cellen in 1,5 ml medium per put van een zes-well plaat in drievoud.Voeg verschillende volumes geconcentreerde lentivirussen toe. Bijvoorbeeld lentivirussen, bijvoorbeeld 10, 20 en 40 microliter, afhankelijk van de titer van de lentivirussen naar elke put. Draai de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.Voer spinfectie uit door centrifugeren bij 920 g bij 37 graden Celsius gedurende 90 minuten. Incubeer de platen onmiddellijk in een kooldioxide-incubator. Observeer de GFP aan het einde van 48 uur en kwantificeer hetzelfde aan het einde van 72 uur.Volg vervolgens de stappen zoals weergegeven in het stroomdiagram om de promotor te kiezen die een consistente GFP-expressie in de hele cultuur weergeeft. Voorbereiding van de gepoolde lentivirale menselijke epigenetische factor shRNA-bibliotheek. Kweek 293T-cellen bij een laag passagegetal met een goede proliferatiesnelheid in drie celkweekschalen van 10 centimeter met 8 ml 10% DMFM-medium in elke plaat.Zodra de cellen 60% confluentie bereiken, vervangt u volledig door vers medium. Bereid de transfectiemix zoals beschreven die serumvrij medium bevat, lentivirale verpakkingsplasmide PAX2, envelopplasmide pMD2. G, gepoolde bibliotheekplasmiden en ten slotte het transfectiereagens.Tik op het mengsel om het goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Voeg het transfectiemengsel toe aan de 293T-cellen en meng voorzichtig door de platen te draaien. Incubeer de platen in een kooldioxide-incubator.Vervang het medium na 24 uur. Controleer na 48 uur op GFP-expressie onder een fluorescentiemicroscoop om een hoge transfectie-efficiëntie in 293T-cellen te garanderen. Verzamel de virussupernatanten na 48, 60 en 72 uur en bewaar ze op 4 graden en voeg vers medium, 8 ml, toe op elk tijdstip na het verzamelen van het virus.Filter de gepoolde virussen met een filter van 0,4 micron. Voor het verkrijgen van een hoge titer van virussen, concentreer de gepoolde virussen door ultracentrifugatie. Breng de gefilterde virussupernatanten over in 70 Ti-buizen en centrifugeer gedurende 2 uur bij 18.000 g.Gebruik voorgekoelde rotor en centrifuge op 4 graden. Haal de buisjes voorzichtig uit de centrifuge en verwijder het bovennatuurmiddel volledig. Resuspend de pellet voorzichtig in 400 microliter DMEM zonder FBS en antibiotica met behulp van een micropipette, incubeer gedurende 1 uur op ijs.Aliquot de virussen en bevriezen bij min 80 graden. Bereken de concentratie van het virus zoals getoond. Schatting van de transductie-efficiëntie van lentivirussen.Transduceer 293T-cellen met een geconcentreerd virus in verschillende volumes, 2, 4 en 8, om de succesvolle bereiding van het lentivirus te bevestigen. Waarde voor geconcentreerd virus tot 100X om een titratie-experiment uit te voeren in de doelcellijn. Zaad 1 miljoen doelcellijn in 1,5 ml 10% RPMI medium met 8 microgram per ml polybreen in één put van een zes-well plaat.Voeg vier verschillende volumes toe, 1, 1,5, 2, 2,5 microliter van 100X virussen. Voer spinfectie uit door centrifugering van de plaat bij 920 g gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius. Meet na 72 uur het percentage GFP-positieve cellen door middel van flowcytometrie.Bepaal het volume van de virussen om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen. Deze lage transductie-efficiëntie moet zorgen voor één shRNA-integratie per cel. Transductie van de gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek in de medicijnresistente cellijn.Bereken het aantal cellen dat voor het experiment moet worden genomen, zoals hieronder op basis van het aantal virale integranten. Resuspend 11 miljoen cellen in 16 ML van 10% RPMI medium. Voeg polybreen toe, acht microgram per ml en meng goed, en voeg vervolgens het vereiste volume virussen toe om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen zoals eerder berekend.Zaai alle cellen op een plaat met zes putten met een dichtheid van 1 miljoen cellen per 1,5 ml per put. Centrifugeer de plaat gedurende 90 minuten bij 920 g bij 37 graden Celsius. Incubeer de plaat een nacht in een kooldioxide-incubator.Vervang na 24 uur het medium en breng de getransduceerde cellen over in een T-75-kolf. Controleer na 48 uur de GFP onder een fluorescentiemicroscoop om een succesvolle transductie te garanderen. Kwantificeer na 72 uur de GFP door middel van flowcytometrie.Verrijking van de GFP-positieve cellen. Breid de getransduceerde cellen uit door ze te kweken met een dichtheid van 0,5 miljoen per ml gedurende 5 tot 7 dagen en voer stroomsortering uit met de stroomsorteerinstelling ingesteld als hoge zuiverheid en lage opbrengst. Kweek de gesorteerde cellen in een 10%RPMI medium.Voer na 72 uur de schatting na het sorteren uit van het percentage van de GFP-positieve cellen om meer dan 95% sorteerefficiëntie te garanderen. Dropout screening om epigenetische factoren te identificeren die resistentie tegen geneesmiddelen bemiddelen. Kweek de shRNA-bibliotheek-getransduceerde cellen in 10% RPMI gedurende maximaal 5 dagen.Centrifugeer 10 miljoen cellen in duplicaten. Gooi het bovennatuurlijk middel weg en bewaar de pellets bij min 80 graden. Deze monsters zullen dienen als de referentie voor de epigenetische shRNA-bibliotheek.Kweek de resterende getransduceerde cellen als duplicaten, R1 en R2, elk onderhouden op een celtelling die een 500X-weergave van de bibliotheek biedt. Behandel een van de duplicaten met het medicijn, 10 micromolair cytarabine, en de andere zonder de medicamenteuze behandeling. Vervang het medium voor de kolven met en zonder het medicijn om de 72 uur.Herhaal de mediumverandering drie keer voor een cumulatieve blootstelling aan geneesmiddelen van 9 dagen. Controleer na de 9e dag van de medicamenteuze behandeling de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de trypan blue exclusion-methode. Draai de resterende levensvatbare cellen af, was met steriel PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 280 g.Gooi het supernatant weg en bewaar de pellets op min 80 voor DNA-extractie. Versterking van de geïntegreerde shRNA's door PCR. Extract DNA uit de getransduceerde basislijncellen, behandelde en onbehandelde cellen, gevolgd door het controleren van de concentratie met behulp van fluorometer, bereken de hoeveelheid DNA die nodig is zoals getoond en onderwerp de monsters aan de eerste ronde PCR.Het PCR-reactiemengsel is weergegeven in tabel 2 met de omstandigheden van de thermische cycler. Stel meerdere reacties in met 850 nanogram DNA per buis voor een totaal van 43 reacties. Bundel de PCR-producten en zuiver ze.Eluteer de producten in een buffer van 50 microliter en kwantificeer ze en bewaar ze ten slotte bij min 20. Gebruik voor de tweede ronde PCR reverse index primers en de reagentia zijn in tabel 4 in tabel 4 weergegeven. Stel vier reacties in met 500 nanogram van het primaire PCR-product in een totaal reactievolume van 50 microliter voor elk monster, samen met de negatieve controle.Laad het hele product voor elektroforese met 2% TBE agarose gel en bevestig de bandgrootte met één KB molecuulladder. Visualiseer de PCR-producten op het geldocumentatiesysteem. Snijd de specifieke band weg en zuiver met behulp van een gelzuiveringskit.Berekeningen voor de zuivering met de kit zijn opgenomen in tabel 3. Elulaat in een eindvolume van 30 microliter elutiebuffer met de geschatte concentratie van elk eluent ongeveer 80 tot 90 nanogram per microliter. Next generation sequencing en data-analyse.De gelgezuiverde producten worden onderworpen aan next-generation sequencing om afgelezen tellingen te verkrijgen voor de uitgeputte shRNA-behoeften. Trim de adaptersequenties, lijn de gefilterde leesbewerkingen uit op de referentiesequenties, laad de bestanden met SAMtools om een uitlijningssamenvatting te verkrijgen. Laad de bijgesneden fastQ-bestanden in CRISPRCloud2 en voer de analyse uit volgens de instructies.Klik op de link voor crisprcloud2. Selecteer het schermtype als Overlevings- en uitvalschermen. Stel het aantal groepen in en typ de naam voor elke groep.Upload de referentiebibliotheek als fasta-bestandsindeling. De geüploade gegevens worden verwerkt en de resultaten zijn beschikbaar in de opgegeven URL. Representatieve gegevens.Deze figuur toont MV4-11 ouderlijke en resistente cellen behandeld met toenemende cytarabineconcentratie, 0,1 micromolair tot 1.000 micromolair en levensvatbaarheidsbeoordeling door MTT-assay. Deze figuur toont representatieve stroomplots van de GFP gekwantificeerd door flowcytometrie aan het einde van 72 uur voor menselijke EF-1 alfa, menselijke CMV en SFFV promotors. Menselijke CMV toont onze heterogene piek, terwijl menselijke EF-1 alfa en SFFV een enkele homogene piek laten zien.Deze figuur toont het staafdiagram voor de drie verschillende promotorefficiënties in MV4-11. SFFV-gestuurde GFP toonde het zwijgen van de GFP in langdurige cultuur. hEF-1 alfa-gestuurde GFP-cellen vertoonden aanhoudende expressie na het sorteren van deze cellen.Het linkerpaneel toont de transfectie-efficiëntie van de gepoolde shRNA-bibliotheek getransfecteerd in 293T aan het einde van 48 uur onder fluorescentiemicroscopie. Het rechterpaneel toont de transductie-efficiëntie van het zwembadvirus in 293T-cellen met verschillende virusvolumes, 2, 4 en 8 microliter. Dit cijfer vertegenwoordigt de transductie-efficiëntie in MV4-11 resistente cellijn met verschillende volumes virussen, zoals 1, 1,5, 2, 2,5 microliter om 30% transductie-efficiëntie te bereiken.Deze figuur toont de sortering van de GFP-positieve cellen met een transductie-efficiëntie van 30% met een hoge zuiverheid en een sorteerinstelling met lage opbrengst. De figuur toont een schematische illustratie van medicamenteuze behandeling voor de GFP-positief gesorteerde cellen voor een langdurige blootstelling aan cytarabine van 9 dagen, gevolgd door het controleren van de levensvatbaarheid en het verzamelen van de cellen voor DNA. Deze figuur toont de bindingsgebieden van de primer die wordt gebruikt in de eerste en tweede ronde van PCR.Deze figuur illustreert de bandgrootte van het PCR-product aan het einde van de eerste ronde PCR, 397 base paar, en het tweede ronde PCR product 399 base pair, dat gel-eluted, gezuiverd en gegeven voor NGS. Deze figuur illustreert de weergave van de verrijkte of uitgeputte shRNA's gericht op de epigenetische factoren die cytarabineresistentie in AML kunnen bemiddelen. Conclusie. Dit protocol benadrukt het belang van gerichte knockdown-screening om zowel essentiële als niet-essentiële genen systematisch te ondervragen en toont het gebruik van deze aanpak als een functioneel platform, waardoor doelen kunnen worden geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor resistentie tegen geneesmiddelen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Een workflow voor gegevensintegratie om medicijncombinaties te identificeren die gericht zijn op synthetische dodelijke interacties

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...