Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Cette étude est financée en partie par une subvention du Département de biotechnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; et Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 et Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS et P.B. sont soutenus par Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 et IA/S/15/1/501842, respectivement. S.D. est soutenu par la bourse CSIR-UGC, et S.I. est soutenu par une bourse de recherche senior ICMR. Nous remercions Abhirup Bagchi, Sandya Rani et le personnel de l’installation centrale de cytométrie en flux du CSCR pour leur aide. Nous remercions également MedGenome Inc. pour son aide dans le séquençage à haut débit et l’analyse des données.

Suivez les directives du Comité institutionnel de biosécurité (IBSC) et utilisez l’installation appropriée pour traiter le lentivirus (BSL-2). Le personnel devrait recevoir une formation appropriée à la manipulation et à l’élimination du lentivirus. Ce protocole suit les directives de biosécurité du Christian Medical College, Vellore.
1. Sélection du promoteur le plus puissant pour obtenir une expression persistante et prolongée des shRNA
<p class="jove_conte...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

L’interférence ARN (ARNi) est largement utilisée pour les études de génomique fonctionnelle, qui comprennent le criblage du siRNA et du shRNA. L’avantage des shRNA est qu’ils peuvent être incorporés dans des vecteurs plasmidiques et intégrés dans l’ADN génomique, ce qui entraîne une expression stable et, par conséquent, une destruction plus prolongée de l’ARNm cible. Un criblage de bibliothèque d’ARNh groupé est robuste et rentable par rapport aux écrans en réseau conventionnels (siRNA). Ident...

Les options thérapeutiques dans la leucémie myéloïde aiguë (LAM) sont restées inchangées au cours des cinq dernières décennies, avec la cytarabine (AraC) et les anthracyclines comme pierre angulaire du traitement de la maladie. L’un des défis au succès du traitement de la LAM est la résistance des cellules souches leucémiques à la chimiothérapie, entraînant une rechute de la maladie 1,2. La régulation épigénétique joue un rôle vital dans la pathogenèse du cancer et la résistance aux médicaments, et plusieurs facteurs épigénétiques sont apparus comme des cibles thérapeutiques prometteuses 3,4,5. Les mécanismes de régulation épigénétique affectent la prolifération et la survie en cas d’exposition continue à des médicaments chimiothérapeutiques. Des études sur les tumeurs malignes non hématologiques ont rapporté qu’une petite fraction des cellules qui surmontent l’effet du médicament subissent diverses modifications épigénétiques, ce qui entraîne la survie de ces cellules 6,7. Cependant, le rôle des facteurs épigénétiques dans la médiation de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM n’a pas été exploré.
Le criblage à haut débit est une approche de la découverte de médicaments qui a acquis une importance mondiale au fil du temps et est devenue une méthode standard dans différents aspects pour identifier des cibles potentielles dans les mécanismes cellulaires, pour le profilage des voies et au niveau moléculaire 8,9. Le concept de létalité synthétique implique l’interaction entre deux gènes où la perturbation de l’un ou l’autre gène seul est viable mais des deux gènes entraîne simultanément la perte de viabilité10. L’exploitation de la létalité synthétique dans le traitement du cancer pourrait aider à identifier et à caractériser mécaniquement des interactions génétiques létales synthétiques robustes11. Nous avons adopté une approche combinatoire de criblage d’ARNh à haut débit avec létalité synthétique pour identifier les facteurs épigénétiques responsables de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM.
Les leucémies aiguës provoquées par la translocation chromosomique du gène de la leucémie mixte (MLL ou KMT2A) sont connues pour être associées à une faible survie chez les patients. Les produits chimériques résultants des réarrangements du gène MLL , c’est-à-dire les protéines de fusion MLL (MLL-FP), peuvent transformer les cellules souches /progénitrices hématopoïétiques (HSPC) en blastes leucémiques avec l’implication de multiples facteurs épigénétiques. Ces régulateurs épigénétiques constituent un réseau complexe qui dicte le maintien du programme de leucémie et, par conséquent, pourrait former des cibles thérapeutiques potentielles. Dans ce contexte, nous avons utilisé la lignée cellulaire MV4-11 (hébergeant le gène de fusion MLL MLL-AF4 avec la mutation FLT3-ITD; appelée MV4-11 P) pour développer la lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine, appelée MV4-11 AraC R. La lignée cellulaire a été exposée à des doses croissantes de cytarabine avec une récupération intermittente du traitement médicamenteux, connue sous le nom de vacances médicamenteuses. La concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) a été évaluée par un test de cytotoxicité in vitro .
Nous avons utilisé la bibliothèque d’ARNh épigénétique groupée (voir Tableau des matériaux) pilotée par le promoteur hEF1a avec une colonne vertébrale lentivirale pZIP. Cette bibliothèque comprend des shRNA ciblant 407 facteurs épigénétiques. Chaque facteur a 5 à 24 shRNA, avec un total de 5 485 shRNA, dont cinq shRNA de contrôle non ciblés. L’échafaudage miR-30 modifié « UltrmiR » a été optimisé pour une biogenèse et une expression efficaces de l’ARNh primaire12,13.
Les grandes lignes de cette expérience sont illustrées à la figure 1A. Le protocole actuel se concentre sur le dépistage de l’ARNi à l’aide de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R (Figure 1B), une lignée cellulaire en suspension. Ce protocole peut être utilisé pour dépister n’importe quelle bibliothèque ciblée dans n’importe quelle lignée cellulaire résistante aux médicaments de son choix. Il convient de noter que le protocole de transduction sera différent pour les cellules adhérentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Comprendre les mécanismes pilotes cliniquement pertinents de la chimio-résistance acquise est crucial pour élucider les moyens de contourner la résistance et d’améliorer la survie chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM). Une petite fraction des cellules leucémiques qui survivent à la chimiothérapie ont un état épigénétique posé pour tolérer l’insulte chimiothérapeutique. Une exposition supplémentaire à la chimiothérapie permet à ces cellules persistantes d’atteindre un état épigénétique fixe, ce qui entraîne une altération de l’expression des gènes, entraînant la prolifération de ces populations résistantes aux médicaments et éventuellement une rechute ou une maladie réfractaire. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les modulations épigénétiques qui nécessitent la survie des cellules leucémiques résistantes aux médicaments. Nous détaillons un protocole pour identifier les modulateurs épigénétiques qui médient la résistance à la cytarabine analogue nucléosidique (AraC) en utilisant le criblage de la bibliothèque shRNA regroupée dans une lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine. La bibliothèque se compose de 5 485 constructions d’ARNh ciblant 407 facteurs épigénétiques humains, ce qui permet un criblage de facteurs épigénétiques à haut débit.

Le flux de travail global de sélection est illustré à la figure 1A. La cytotoxicité in vitro du MV4-11 AraC R (48 h) a révélé que la CI50 à la cytarabine dans le MV4-11 AraC R était supérieure à celle du MV4-11 P (Figure 1B). Cette lignée cellulaire a été utilisée dans l’étude comme modèle pour le dépistage des facteurs épigénétiques responsables de la résistance à la cytarabine.
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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).

Dépistage en pool de la bibliothèque d’ARNH pour identifier les facteurs qui modulent un phénotype de résistance aux médicaments

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

L’objectif global de la vidéo suivante est de démontrer l’utilisation de la bibliothèque épigénétique d’ARNh regroupée pour effectuer un dépistage par sélection négative. Ce dépistage permet d’identifier des cibles épigénétiques spécifiques par séquençage. Cette procédure pourrait aider à identifier les facteurs épigénétiques responsables de la médiation de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM Les étapes sont les suivantes.Sélection du promoteur le plus puissant pour obtenir une expression persistante et prolongée des shRNA. Le protocole actuel se concentre sur le dépistage de l’ARNi à l’aide de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique dans la lignée cellulaire MV4-11 résistante à la cytarabine. Les promoteurs utilisés à cette fin sont l’EF-1 alpha humain, le CMV humain et le SFFV, promoteurs qui expriment la protéine de fluorescence verte.Prenez le nombre de cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan. Suspendre les cellules dans un milieu à 10 % RPMI contenant 8 microgrammes par mL de polybrene. Ensemencez 1 million de cellules dans 1,5 ml de milieu par puits d’une plaque de six puits en triples.Ajouter différents volumes de lentivirus concentrés. Par exemple, les lentivirus, par exemple, 10, 20 et 40 microlitres, en fonction du titre des lentivirus à chaque puits. Faites tourbillonner doucement la plaque pour mélanger le contenu.Effectuer une spinfection par centrifugation à 920 g à 37 degrés centigrades pendant 90 minutes. Incuber immédiatement les plaques dans un incubateur à dioxyde de carbone. Observez le GFP au bout de 48 heures et quantifiez-le au bout de 72 heures.Ensuite, suivez les étapes décrites dans l’organigramme pour choisir le promoteur affichant une expression GFP cohérente dans toute la culture. Préparation de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique humain lentiviral regroupé. Cultiver des cellules 293T à un faible nombre de passage avec un bon taux de prolifération dans trois boîtes de culture cellulaire de 10 centimètres avec 8 ml de milieu DMFM à 10% dans chaque plaque.Une fois que les cellules atteignent 60% de confluence, remplacez-les complètement par un milieu frais. Préparer le mélange de transfection tel que décrit qui contient un milieu sans sérum, un plasmide PAX2 d’emballage lentiviral, un plasmide d’enveloppe pMD2. G, les plasmides de bibliothèque regroupés, et enfin le réactif de transfection.Tapotez le mélange pour bien le mélanger et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter le mélange de transfection aux cellules 293T et mélanger doucement en faisant tourbillonner les plaques. Incuber les plaques dans un incubateur à dioxyde de carbone.Changez le support après 24 heures. Après 48 heures, vérifiez l’expression de GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une efficacité de transfection élevée dans les cellules 293T. Recueillir les surnageants du virus après 48, 60 et 72 heures et les stocker à 4 degrés, et ajouter un milieu frais, 8 ml, à chaque point temporel après la collecte du virus.Filtrez les virus regroupés avec un filtre de 0,4 micron. Pour obtenir un titre élevé de virus, concentrez les virus regroupés par ultracentrifugation. Transférer les surnageants du virus filtrés dans des tubes de 70 Ti et centrifuger à 18 000 g pendant 2 heures.Utilisez un rotor prérefroidi et une centrifugeuse à 4 degrés. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse et retirez complètement le surnageant. Remettre en suspension la pastille doucement dans 400 microlitres de DMEM sans FBS et antibiotiques à l’aide d’une micropipette, incuber sur de la glace pendant 1 heure.Aliquote les virus et congeler à moins 80 degrés. Calculez la concentration du virus comme indiqué. Estimation de l’efficacité de transduction des lentivirus.Transduire les cellules 293T avec un virus concentré dans différents volumes, 2, 4 et 8, pour confirmer la préparation réussie du lentivirus. Valeur du virus concentré à 100X pour effectuer une expérience de titrage dans la lignée cellulaire cible. Ensemencez 1 million de lignées cellulaires cibles dans 1,5 ml de milieu à 10 % RPMI contenant 8 microgrammes par ml de polybrene dans un puits d’une plaque de six puits.Ajoutez quatre volumes différents, 1, 1.5, 2, 2.5 microlitres de virus 100X. Effectuer une spinfection par centrifugation de la plaque à 920 g pendant 90 minutes à 37 degrés centigrades. Après 72 heures, mesurez le pourcentage de cellules GFP positives par cytométrie en flux.Déterminez le volume des virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30 %. Cette faible efficacité de transduction permet d’assurer une intégration unique de shRNA par cellule. Transduction de la bibliothèque d’ARNh épigénétique regroupée dans la lignée cellulaire résistante aux médicaments.Calculez le nombre de cellules à prélever pour l’expérience comme ci-dessous en fonction du nombre d’intégrants viraux. Remettre en service 11 millions de cellules dans 16 ML de milieu 10% RPMI. Ajouter le polybrene, huit microgrammes par ml et bien mélanger, puis ajouter le volume requis de virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30% calculée précédemment.Ensemencez toutes les cellules sur une plaque de six puits à une densité de 1 million de cellules par 1,5 ml par puits. Centrifuger la plaque pendant 90 minutes à 920 g à 37 degrés centigrades. Incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur à dioxyde de carbone.Après 24 heures, changez le milieu et transférez les cellules transduites dans une fiole T-75. Après 48 heures, vérifiez le GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une transduction réussie. Après 72 heures, quantifier la GFP par cytométrie en flux.Enrichissement des cellules GFP positives. Développez les cellules transduites en les cultivant à une densité de 0,5 million par ml pendant 5 à 7 jours, et effectuez un tri de flux avec le réglage de tri de flux défini comme haute pureté et faible rendement. Cultivez les cellules triées dans un milieu à 10 % RPMI.Après 72 heures, effectuez l’estimation post-tri du pourcentage de cellules GFP positives pour assurer une efficacité de tri de plus de 95%. Dépistage de l’abandon pour identifier les facteurs épigénétiques médiant la résistance aux médicaments. Cultivez les cellules transduites par la bibliothèque shRNA dans 10% RPMI pendant 5 jours.Centrifuger 10 millions de cellules en doublons. Jetez le surnageant et conservez les granulés à moins 80 degrés. Ces échantillons serviront de référence pour la bibliothèque épigénétique d’ARNh.Cultivez les cellules transduites restantes sous forme de doublons, R1 et R2, chacune maintenue à un nombre de cellules qui fournit une représentation 500X de la bibliothèque. Traitez l’un des doublons avec le médicament, 10 cytarabine micromolaires, et l’autre sans le traitement médicamenteux. Changez le milieu des flacons avec et sans le médicament toutes les 72 heures.Répétez le changement de milieu trois fois pour une exposition cumulative au médicament de 9 jours. Après le 9ème jour de traitement médicamenteux, vérifiez la viabilité des cellules par la méthode d’exclusion du bleu de trypan. Faites tourner les cellules viables restantes, lavez-les avec du PBS stérile et centrifugez à 280 g pendant 5 minutes à température ambiante.Jetez le surnageant et stockez les granulés à moins 80 pour l’extraction de l’ADN. Amplification des shRNA intégrés par PCR. Extraire l’ADN des cellules de base transduites, des cellules traitées et non traitées, puis vérifier la concentration à l’aide d’un fluoromètre, calculer la quantité d’ADN requise comme indiqué et soumettre les échantillons à la première série de PCR.Le mélange réactionnel PCR est représenté dans le tableau 2 avec les conditions du cycleur thermique. Mettre en place plusieurs réactions contenant 850 nanogrammes d’ADN par tube pour un total de 43 réactions. Mettez en commun les produits PCR et purifiez-les.Éluez les produits dans un tampon de 50 microlitres et quantifiez-les, et enfin, stockez-les à moins 20. Pour la PCR de deuxième tour, utilisez des amorces d’index inverse et les réactifs sont présentés dans le tableau 4. Mettre en place quatre réactions avec 500 nanogrammes du produit PCR primaire dans un volume de réaction total de 50 microlitres pour chaque échantillon avec le contrôle négatif.Chargez l’ensemble du produit pour l’électrophorèse à l’aide d’un gel d’agarose à 2% TBE et confirmez la taille de la bande avec une échelle de molécule KB. Visualisez les produits PCR sur le système de documentation du gel. Retirez la bande spécifique et purifiez-la à l’aide d’un kit de purification en gel.Les calculs pour la purification avec le kit sont fournis dans le tableau 3. Éluter dans un volume final de 30 microlitres de tampon d’élution avec la concentration approximative de chaque éluant autour de 80 à 90 nanogrammes par microlitre. Séquençage et analyse de données de nouvelle génération.Les produits purifiés en gel sont soumis à un séquençage de nouvelle génération pour obtenir des comptes de lecture pour les besoins en shRNA épuisés. Découpez les séquences d’adaptateurs, alignez les lectures filtrées sur les séquences de référence, chargez les fichiers à l’aide de SAMtools pour obtenir un résumé de l’alignement. Chargez les fichiers fastQ découpés dans CRISPRCloud2 et effectuez l’analyse conformément aux instructions.Cliquez sur le lien fourni pour le CRISPRCloud2. Sélectionnez le type d’écran comme écrans Survie et Abandon. Définissez le nombre de groupes et tapez le nom de chaque groupe.Téléchargez la bibliothèque de référence au format de fichier FASTA. Les données téléchargées sont traitées et les résultats sont disponibles dans l’URL donnée. Données représentatives.Cette figure montre les cellules parentales et résistantes MV4-11 traitées avec une concentration croissante de cytarabine, de 0,1 micromolaire à 1 000 micromolaires, et une évaluation de la viabilité par test MTT. Cette figure montre des diagrammes de flux représentatifs de la GFP quantifiés par cytométrie en flux au bout de 72 heures pour les promoteurs humains EF-1 alpha, CMV humain et SFFV. Le CMV humain montre notre pic hétérogène tandis que l’EF-1 alpha humain et le SFFV montrent un seul pic homogène.Cette figure montre le graphique à barres pour les trois différentes efficacités des promoteurs dans MV4-11. La GFP pilotée par le SFFV a montré un silence du GFP dans une culture prolongée. Les cellules GFP à entraînement alpha hEF-1 ont montré une expression soutenue après le tri de ces cellules.Le panneau de gauche montre l’efficacité de transfection de la bibliothèque d’ARNh regroupée transfectée en 293T au bout de 48 heures en microscopie à fluorescence. Le panneau de droite montre l’efficacité de transduction du virus du pool dans des cellules 293T avec des volumes de virus variables, 2, 4 et 8 microlitres. Cette figure représente l’efficacité de transduction dans la lignée cellulaire résistante MV4-11 avec des volumes variables de virus, comme 1, 1,5, 2, 2,5 microlitres pour atteindre une efficacité de transduction de 30%.Cette figure montre le tri des cellules GFP positives avec une efficacité de transduction de 30% avec une pureté élevée et un réglage de tri à faible rendement. La figure montre une illustration schématique du traitement médicamenteux des cellules triées GFP positives pour une exposition prolongée à la cytarabine de 9 jours, suivie d’une vérification de la viabilité et de la collecte des cellules pour l’ADN. Cette figure montre les régions de liaison de l’amorce utilisée dans la première et la deuxième série de PCR.Cette figure illustre la taille de bande du produit PCR à la fin de la première paire de bases de la PCR ronde, 397, et de la paire de bases de la deuxième paire de bases de produits pcR ronde 399, qui a été éluée au gel, purifiée et administrée pour le NGS. Cette figure illustre la représentation des ARNS enrichis ou épuisés ciblant les facteurs épigénétiques qui pourraient servir de médiateur à la résistance à la cytarabine dans la LAM. Conclusion. Ce protocole souligne l’importance du dépistage ciblé pour interroger systématiquement les gènes essentiels et non essentiels et démontre l’utilisation de cette approche en tant que plate-forme fonctionnelle, permettant d’identifier les cibles responsables de la résistance aux médicaments.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

En utilisant l&#39;ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d&#39;épissage associés à la résistance aux médicaments dans<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles de cancer

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Un flux de travail d’intégration de données pour identifier les combinaisons de médicaments ciblant les interactions létales synthétiques

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...