Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Diese Studie wird zum Teil durch einen Zuschuss des Department of Biotechnology BT/PR8742/AGR/36/773/2013 an SRV finanziert; und Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 und Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 bis P.B. RVS und P.B. werden von Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 bzw. IA/S/15/1/501842 unterstützt. S.D. wird durch das CSIR-UGC-Stipendium unterstützt, und S.I. wird durch ein ICMR-Senior-Forschungsstipendium unterstützt. Wir danken Abhirup Bagchi, Sandya Rani und den Mitarbeitern der CSCR Flow Cytometry Core Facility für ihre Hilfe. Wir danken MedGenome Inc. auch für die Unterstützung bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung und Datenanalyse.

Befolgen Sie die Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBSC) und nutzen Sie die richtige Einrichtung, um mit Lentivirus (BSL-2) umzugehen. Das Personal sollte in angemessener Weise im Umgang mit und der Entsorgung von Lentiviren geschult werden. Dieses Protokoll folgt den Biosicherheitsrichtlinien des Christian Medical College, Vellore.
1. Auswahl des potentesten Promotors, um eine persistente und verlängerte Expression der shRNAs zu erhalten
<p class="jove_con...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA-Interferenz (RNAi) wird in großem Umfang für funktionelle Genomik-Studien verwendet, die siRNA- und shRNA-Screening umfassen. Der Vorteil von shRNA besteht darin, dass sie in Plasmidvektoren eingebaut und in genomische DNA integriert werden können, was zu einer stabilen Expression und damit zu einem längeren Knockdown der Ziel-mRNA führt. Ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening ist im Vergleich zu den herkömmlichen Array-Screens (siRNA) robust und kostengünstig. Die Identifizierung der Wesentlichkeit einer be...

Die therapeutischen Optionen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) sind in den letzten fünf Jahrzehnten unverändert geblieben, wobei Cytarabin (AraC) und Anthrazykline die Eckpfeiler für die Behandlung der Krankheit sind. Eine der Herausforderungen für den Erfolg der AML-Therapie ist die Resistenz von leukämischen Stammzellen gegen Chemotherapie, was zu einem Krankheitsrückfall führt 1,2. Die epigenetische Regulation spielt eine entscheidende Rolle bei der Krebspathogenese und Arzneimittelresistenz, und mehrere epigenetische Faktoren haben sich als vielversprechende therapeutische Zieleherauskristallisiert 3,4,5. Epigenetische Regulationsmechanismen beeinflussen die Proliferation und das Überleben unter kontinuierlicher Exposition gegenüber Chemotherapeutika. Studien zu nicht-hämatologischen Malignomen haben berichtet, dass ein kleiner Teil der Zellen, die die Arzneimittelwirkung überwinden, verschiedene epigenetische Modifikationen erfahren, was zum Überleben dieser Zellen führt 6,7. Die Rolle epigenetischer Faktoren bei der Vermittlung erworbener Resistenzen gegen Cytarabin bei AML wurde jedoch nicht untersucht.
Hochdurchsatz-Screening ist ein Ansatz zur Wirkstoffforschung, der im Laufe der Zeit an globaler Bedeutung gewonnen hat und in verschiedenen Aspekten zu einer Standardmethode geworden ist, um potenzielle Ziele in zellulären Mechanismen, für die Signalwegprofilierung und auf molekularer Ebenezu identifizieren 8,9. Das Konzept der synthetischen Letalität beinhaltet die Interaktion zwischen zwei Genen, bei denen die Störung eines der beiden Gene allein lebensfähig ist, aber von beiden Genen gleichzeitig zum Verlust der Lebensfähigkeitführt 10. Die Nutzung der synthetischen Letalität in der Krebsbehandlung könnte dazu beitragen, robuste synthetische letale genetische Interaktionen zu identifizieren und mechanistisch zu charakterisieren11. Wir haben einen kombinatorischen Ansatz des Hochdurchsatz-shRNA-Screenings mit synthetischer Letalität gewählt, um die epigenetischen Faktoren zu identifizieren, die für die erworbene Cytarabinresistenz bei AML verantwortlich sind.
Es ist bekannt, dass akute Leukämien, die durch chromosomale Translokation des Mixed-Lineage-Leukämiegens (MLL oder KMT2A) verursacht werden, bei Patienten mit einem schlechten Überleben verbunden sind. Die resultierenden chimären Produkte von MLL-Genumlagerungen, d.h. MLL-Fusionsproteine (MLL-FPs), können hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) unter Beteiligung mehrerer epigenetischer Faktoren in leukämische Blasten umwandeln. Diese epigenetischen Regulatoren bilden ein kompliziertes Netzwerk, das die Aufrechterhaltung des Leukämieprogramms diktiert und daher potenzielle therapeutische Ziele bilden könnte. In diesem Zusammenhang verwendeten wir die MV4-11-Zelllinie (die das MLL-Fusionsgen MLL-AF4 mit der FLT3-ITD-Mutation beherbergt; als MV4-11 P bezeichnet), um die erworbene Cytarabin-resistente Zelllinie zu entwickeln, die als MV4-11 AraC R bezeichnet wird. Die Zelllinie wurde steigenden Dosen von Cytarabin mit intermittierender Erholung von der medikamentösen Behandlung, bekannt als Drogenurlaub, ausgesetzt. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) wurde mittels In-vitro-Zytotoxizitätstest bewertet.
Wir verwendeten die gepoolte epigenetische shRNA-Bibliothek (siehe Materialverzeichnis), die vom hEF1a-Promotor mit einem lentiviralen pZIP-Backbone gesteuert wurde. Diese Bibliothek umfasst shRNAs, die auf 407 epigenetische Faktoren abzielen. Jeder Faktor hat 5-24 shRNAs, mit insgesamt 5.485 shRNAs, einschließlich fünf Nicht-Targeting-Kontroll-shRNAs. Das modifizierte miR-30-Gerüst "UltrmiR" wurde für eine effiziente primäre shRNA-Biogenese und -Expressionoptimiert 12,13.
Der Umriss dieses Experiments ist in Abbildung 1A dargestellt. Das aktuelle Protokoll konzentriert sich auf das RNAi-Screening unter Verwendung der epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek in der MV4-11 AraC R-Zelllinie (Abbildung 1B), einer Suspensionszelllinie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um jede Zielbibliothek in jeder arzneimittelresistenten Zelllinie der eigenen Wahl zu überprüfen. Es sollte beachtet werden, dass das Transduktionsprotokoll für adhärente Zellen unterschiedlich sein wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Das Verständnis klinisch relevanter Treibermechanismen der erworbenen Chemoresistenz ist entscheidend für die Aufklärung von Möglichkeiten zur Umgehung von Resistenzen und zur Verbesserung des Überlebens bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML). Ein kleiner Teil der leukämischen Zellen, die eine Chemotherapie überleben, haben einen ausgeglichenen epigenetischen Zustand, um chemotherapeutische Beleidigungen zu tolerieren. Eine weitere Exposition gegenüber einer Chemotherapie ermöglicht es diesen Wirkstoffpersisterzellen, einen festen epigenetischen Zustand zu erreichen, der zu einer veränderten Genexpression führt, was zur Proliferation dieser arzneimittelresistenten Populationen und schließlich zu einem Rückfall oder einer refraktären Erkrankung führt. Daher ist die Identifizierung epigenetischer Modulationen, die das Überleben arzneimittelresistenter leukämischer Zellen erfordern, von entscheidender Bedeutung. Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung epigenetischer Modulatoren, die die Resistenz gegen das Nukleosidanalog-Cytarabin (AraC) vermitteln, indem wir ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening in einer erworbenen Cytarabin-resistenten AML-Zelllinie verwenden. Die Bibliothek besteht aus 5.485 shRNA-Konstrukten, die auf 407 humane epigenetische Faktoren abzielen, was ein epigenetisches Faktor-Screening mit hohem Durchsatz ermöglicht.

Der gesamte Screening-Workflow ist in Abbildung 1A dargestellt. Die In-vitro-Zytotoxizität des MV4-11 AraC R (48 h) zeigte, dass der IC50 zu Cytarabin im MV4-11 AraC R höher war als der MV4-11 P (Abbildung 1B). Diese Zelllinie wurde in der Studie als Modell für das Screening der epigenetischen Faktoren verwendet, die für die Cytarabinresistenz verantwortlich sind.
Abbildung 2A</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos ist es, die Verwendung der gepoolten epigenetischen shRNA-Bibliothek zur Durchführung eines negativen Selektionsscreenings zu demonstrieren. Dieses Screening ermöglicht es, spezifische epigenetische Ziele durch Sequenzierung zu identifizieren. Dieses Verfahren könnte helfen, die epigenetischen Faktoren zu identifizieren, die für die Vermittlung der erworbenen Cytarabin-Resistenz bei AML verantwortlich sind Die Schritte sind wie folgt.Auswahl des potentesten Promotors, um eine persistente und verlängerte Expression der shRNAs zu erhalten. Das aktuelle Protokoll konzentriert sich auf das RNAi-Screening unter Verwendung der epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek in der Cytarabin-resistenten MV4-11-Zelllinie. Die zu diesem Zweck verwendeten Promotoren sind humanes EF-1 alpha, humanes CMV und SFFV, Promotoren, die grünes Fluoreszenzprotein exprimieren.Nehmen Sie die Zellzahl mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode an. Suspendieren Sie die Zellen in 10% RPMI-Medium, das 8 Mikrogramm pro ml Polybren enthält. Samen Sie 1 Million Zellen in 1,5 ml Medium pro Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen in Verdreifachungen.Fügen Sie verschiedene Volumina konzentrierter Lentiviren hinzu. Zum Beispiel Lentiviren, zum Beispiel 10, 20 und 40 Mikroliter, abhängig vom Titer der Lentiviren zu jedem Well. Schwenken Sie den Teller vorsichtig, um den Inhalt zu mischen.Führen Sie eine Spinfektion durch Zentrifugation bei 920 g bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten durch. Inkubieren Sie die Platten sofort in einem Kohlendioxid-Inkubator. Beobachten Sie das GFP am Ende von 48 Stunden und quantifizieren Sie es am Ende von 72 Stunden.Führen Sie als Nächstes die im Flussdiagramm dargestellten Schritte aus, um den Promotor auszuwählen, der einen konsistenten GFP-Ausdruck in der gesamten Kultur anzeigt. Vorbereitung der gepoolten lentiviralen humanen epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek. Kultur 293T-Zellen mit einer niedrigen Passagezahl mit einer guten Proliferationsrate in drei 10-Zentimeter-Zellkulturschalen mit 8 ml 10% DMFM-Medium in jeder Platte.Sobald die Zellen eine Konfluenz von 60% erreicht haben, ersetzen Sie sie vollständig durch frisches Medium. Bereiten Sie die Transfektionsmischung wie beschrieben vor, die serumfreies Medium, das lentivirale Verpackungsplasmid PAX2 und das Hüllplasmid pMD2 enthält. G, gepoolte Bibliotheksplasmide und schließlich das Transfektionsreagenz.Klopfen Sie auf die Mischung, um sie gut zu mischen, und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den 293T-Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Wirbeln der Platten. Inkubieren Sie die Platten in einem Kohlendioxid-Inkubator.Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden. Überprüfen Sie nach 48 Stunden die GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine hohe Transfektionseffizienz in 293T-Zellen sicherzustellen. Sammeln Sie die Virusüberstände nach 48, 60 und 72 Stunden und lagern Sie sie bei 4 Grad und fügen Sie zu jedem Zeitpunkt nach dem Sammeln des Virus frisches Medium, 8ml, hinzu.Filtern Sie die gepoolten Viren mit einem 0,4-Mikron-Filter. Um einen hohen Titer von Viren zu erhalten, konzentrieren Sie die gepoolten Viren durch Ultrazentrifugation. Die gefilterten Virusüberstände werden auf 70 Ti-Röhrchen übertragen und 2 Stunden lang mit 18.000 g zentrifugiert.Verwenden Sie vorgekühlten Rotor und Zentrifuge bei 4 Grad. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und entfernen Sie den Überstand vollständig. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 400 Mikroliter DMEM ohne FBS und Antibiotika mit einer Mikropipette, inkubieren Sie auf Eis für 1 Stunde.Aliquot die Viren und frieren bei minus 80 Grad ein. Berechnen Sie die Konzentration des Virus wie gezeigt. Abschätzung der Transduktionseffizienz von Lentiviren.Transduzieren Sie 293T-Zellen mit einem konzentrierten Virus in verschiedenen Volumina, 2, 4 und 8, um die erfolgreiche Präparation des Lentivirus zu bestätigen. Bewerten Sie das konzentrierte Virus auf 100X, um ein Titrationsexperiment in der Zielzelllinie durchzuführen. Samen Sie 1 Million Zielzelllinie in 1,5 ml 10% RPMI-Medium, das 8 Mikrogramm pro ml Polybren in einer Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen enthält.Fügen Sie vier verschiedene Volumina hinzu, 1, 1,5, 2, 2,5 Mikroliter 100X-Viren. Führen Sie eine Spinfektion durch Zentrifugation der Platte bei 920 g für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius durch. Messen Sie nach 72 Stunden den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie.Bestimmen Sie das Volumen der Viren, um eine Transduktionseffizienz von 30 % zu erhalten. Diese geringe Transduktionseffizienz soll eine einzelne shRNA-Integration pro Zelle gewährleisten. Transduktion der gepoolten epigenetischen shRNA-Bibliothek in der arzneimittelresistenten Zelllinie.Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für das Experiment genommen werden sollen, wie unten basierend auf der Anzahl der viralen Integrantien. Resuspendieren Sie 11 Millionen Zellen in 16 ML von 10% RPMI-Medium. Fügen Sie Polybren hinzu, acht Mikrogramm pro ml und mischen Sie gut, und fügen Sie dann das erforderliche Volumen an Viren hinzu, um eine Transduktionseffizienz von 30% zu erhalten, wie zuvor berechnet.Samen Sie alle Zellen auf einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 1 Million Zellen pro 1,5 ml pro Well. Zentrifugieren Sie die Platte für 90 Minuten bei 920 g bei 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator.Wechseln Sie nach 24 Stunden das Medium und übertragen Sie die transduzierten Zellen in einen T-75-Kolben. Überprüfen Sie das GFP nach 48 Stunden unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine erfolgreiche Transduktion sicherzustellen. Nach 72 Stunden quantifizieren Sie das GFP durch Durchflusszytometrie.Anreicherung der GFP-positiven Zellen. Erweitern Sie die transduzierten Zellen, indem Sie sie 5 bis 7 Tage lang mit einer Dichte von 0,5 Millionen pro ml kultivieren, und führen Sie eine Flusssortierung mit der als hohe Reinheit und geringe Ausbeute festgelegten Flusssortiereinstellung durch. Kultivieren Sie die sortierten Zellen in einem 10%RPMI-Medium.Führen Sie nach 72 Stunden die Schätzung des Prozentsatzes der GFP-positiven Zellen nach der Sortierung durch, um eine Sortiereffizienz von mehr als 95 % sicherzustellen. Dropout-Screening zur Identifizierung epigenetischer Faktoren, die eine Arzneimittelresistenz vermitteln. Kultivieren Sie die shRNA-Bibliotheks-transduzierten Zellen in 10% RPMI für bis zu 5 Tage.Zentrifugieren Sie 10 Millionen Zellen in Duplikaten. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Pellets bei minus 80 Grad. Diese Proben dienen als Basisreferenz für die epigenetische shRNA-Bibliothek.Kultivieren Sie die verbleibenden transduzierten Zellen als Duplikate, R1 und R2, die jeweils mit einer Zellzahl beibehalten werden, die eine 500-fache Darstellung der Bibliothek bietet. Behandeln Sie eines der Duplikate mit dem Medikament, 10 mikromolares Cytarabin, und das andere ohne die medikamentöse Behandlung. Wechseln Sie das Medium für die Flaschen mit und ohne das Medikament alle 72 Stunden.Wiederholen Sie den Mediumswechsel dreimal für eine kumulative Arzneimittelexposition von 9 Tagen. Überprüfen Sie nach dem 9. Tag der medikamentösen Behandlung die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode. Die verbleibenden lebensfähigen Zellen ausfahren, mit sterilem PBS waschen und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang bei 280 g zentrifugieren.Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Pellets bei minus 80 für die DNA-Extraktion. Amplifikation der integrierten shRNAs durch PCR. Extrahieren Sie DNA aus den transduzierten Baseline-Zellen, behandelten und unbehandelten Zellen, gefolgt von der Überprüfung der Konzentration mittels Fluorometer, berechnen Sie die Menge an DNA, die wie gezeigt benötigt wird, und unterziehen Sie die Proben der ersten Runde der PCR.Das PCR-Reaktionsgemisch ist in Tabelle 2 mit den thermischen Cyclerbedingungen dargestellt. Richten Sie mehrere Reaktionen mit 850 Nanogramm DNA pro Röhrchen für insgesamt 43 Reaktionen ein. Die PCR-Produkte bündeln und reinigen.Elutieren Sie die Produkte in 50 Mikroliter Puffer und quantifizieren Sie sie, und schließlich lagern Sie bei minus 20. Für die PCR der zweiten Runde verwenden Sie Reverse-Index-Primer, und die Reagenzien sind in Tabelle 4 tabellarisch dargestellt. Richten Sie vier Reaktionen mit 500 Nanogramm des primären PCR-Produkts in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 Mikrolitern für jede Probe zusammen mit der Negativkontrolle ein.Laden Sie das gesamte Produkt für die Elektrophorese mit 2% TBE-Agarosegel und bestätigen Sie die Bandengröße mit einer KB-Molekülleiter. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf dem Gel-Dokumentationssystem. Entfernen Sie das spezifische Band und reinigen Sie es mit einem Gelreinigungskit.Berechnungen für die Reinigung mit dem Kit sind in Tabelle 3 enthalten. Elute in einem Endvolumen von 30 Mikrolitern Elutionspuffer mit der ungefähren Konzentration jedes Elutionsmittels um 80 bis 90 Nanogramm pro Mikroliter. Next-Generation-Sequencing und Datenanalyse.Die gelgereinigten Produkte werden einer Next-Generation-Sequenzierung unterzogen, um Lesezahlen für den erschöpften shRNA-Bedarf zu erhalten. Kürzen Sie die Adaptersequenzen, richten Sie die gefilterten Lesevorgänge an den Referenzsequenzen aus, laden Sie die Dateien mit SAMtools, um eine Ausrichtungszusammenfassung zu erhalten. Laden Sie die beschnittenen fastQ-Dateien in CRISPRCloud2 und führen Sie die Analyse gemäß den Anweisungen durch.Klicken Sie auf den Link für den CRISPRCloud2. Wählen Sie den Bildschirmtyp als Überlebens- und Ausstiegsbildschirme aus. Legen Sie die Anzahl der Gruppen fest und geben Sie den Namen für jede Gruppe ein.Laden Sie die Referenzbibliothek im FASTA-Dateiformat hoch. Die hochgeladenen Daten werden verarbeitet und die Ergebnisse sind in der angegebenen URL verfügbar. Repräsentative Daten.Diese Abbildung zeigt MV4-11 elterliche und resistente Zellen, die mit steigender Cytarabinkonzentration, 0,1 Mikromolar bis 1.000 Mikromolar und Viabilitätsbewertung durch MTT-Assay behandelt wurden. Diese Abbildung zeigt repräsentative Flussdiagramme des GFP, quantifiziert durch Durchflusszytometrie am Ende von 72 Stunden für humane EF-1 alpha, humane CMV und SFFV-Promotoren. Humanes CMV zeigt unseren heterogenen Peak, während humanes EF-1 alpha und SFFV einen einzigen homogenen Peak zeigen.Diese Abbildung zeigt das Balkendiagramm für die drei verschiedenen Promotorwirkungsgrade in MV4-11. SFFV-gesteuertes GFP zeigte das Schweigen des GFP in längerer Kultur. hEF-1 alpha-getriebene GFP-Zellen zeigten eine anhaltende Expression nach der Sortierung dieser Zellen.Das linke Feld zeigt die Transfektionseffizienz der gepoolten shRNA-Bibliothek, die am Ende von 48 Stunden unter Fluoreszenzmikroskopie in 293T transfiziert wurde. Das rechte Bild zeigt die Transduktionseffizienz des Poolvirus in 293T-Zellen mit unterschiedlichen Virusvolumina, 2, 4 und 8 Mikrolitern. Diese Zahl stellt die Transduktionseffizienz in MV4-11-resistenten Zelllinien mit unterschiedlichen Volumina von Viren wie 1, 1,5, 2, 2,5 Mikrolitern dar, um eine Transduktionseffizienz von 30% zu erreichen.Diese Abbildung zeigt die Sortierung der GFP-positiven Zellen mit 30% Transduktionseffizienz bei hoher Reinheit und geringer Ausbeute. Die Abbildung zeigt eine schematische Darstellung der medikamentösen Behandlung der GFP-positiv sortierten Zellen für eine längere Cytarabin-Exposition von 9 Tagen, gefolgt von der Überprüfung der Lebensfähigkeit und dem Sammeln der Zellen für DNA. Diese Abbildung zeigt die Bindungsbereiche des Primers, der in der ersten und zweiten Runde der PCR verwendet wird.Diese Abbildung veranschaulicht die Bandgröße des PCR-Produkts am Ende der ersten Runde PCR, 397 Basenpaar, und des zweiten Runde PCR-Produkt 399 Basenpaares, das gel-elutiert, gereinigt und für NGS gegeben wurde. Diese Abbildung veranschaulicht die Darstellung der angereicherten oder erschöpften shRNAs, die auf die epigenetischen Faktoren abzielen, die die Cytarabinresistenz bei AML vermitteln könnten. Schlussfolgerung. Dieses Protokoll unterstreicht die Bedeutung eines gezielten Knockdown-Screenings, um sowohl essentielle als auch nicht-essentielle Gene systematisch zu befragen, und demonstriert die Verwendung dieses Ansatzes als funktionelle Plattform, die die Identifizierung von Zielen ermöglicht, die für die Arzneimittelresistenz verantwortlich sind.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Forschung

Krebsforschung

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Ein Datenintegrations-Workflow zur Identifizierung von Arzneimittelkombinationen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...