Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
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इस अध्ययन को जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा भाग में वित्त पोषित किया जाता है, जो एसआरवी को बीटी / पीआर 8742 / एजीआर / 36 / 773 / 2013 अनुदान देता है; और जैव प्रौद्योगिकी विभाग भारत बीटी / सीओई / 34 / एसपी 13432 / 2015 और विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग, भारत: ईएमआर / 2017 / 003880 से पी.B आरवीएस और पी.B क्रमशः वेलकम डीबीटी इंडिया एलायंस आईए / एस / 17 / 1 / 503118 और आईए / एस / 15 / 1 / 501842 द्वारा समर्थित हैं। एसडी सीएसआईआर-यूजीसी फैलोशिप द्वारा समर्थित है, और एसआई को आईसीएमआर वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। हम अभिरूप बागची, सांद्या रानी और सीएससीआर फ्लो साइटोमेट्री कोर फैसिलिटी स्टाफ को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। हम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण में मदद करने के लिए मेडजीनोम इंक को भी धन्यवाद देते हैं।

संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (IBSC) के दिशानिर्देशों का पालन करें और लेंटीवायरस (BSL-2) को संभालने के लिए उचित सुविधा का उपयोग करें। कार्मिकों को लेंटीवायरस के हैंडलिंग और निपटान में उचित रूप से प्रशिक्षित कि?...

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	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. 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आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) का बड़े पैमाने पर कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें एसआईआरएनए और एसआरएनए स्क्रीनिंग शामिल हैं। SHRNA का लाभ यह है कि उन्हें प्लास्मिड वैक्टर में शाम?...

तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में चिकित्सीय विकल्प लगभग पिछले पांच दशकों से अपरिवर्तित रहे हैं, जिसमें साइटाराबिन (एआरसी) और एंथ्रासाइक्लिन बीमारी के इलाज के लिए आधारशिला के रूप में हैं। एएमएल थेरेपी की सफलता के लिए चुनौतियों में से एक कीमोथेरेपी के लिए ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं का प्रतिरोध है, जिससे रोगरिलैप्स 1,2 हो सकता है। एपिजेनेटिक विनियमन कैंसर रोगजनन और दवा प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और कई एपिजेनेटिक कारक आशाजनक चिकित्सीयलक्ष्यों 3,4,5 के रूप में उभरे हैं। एपिजेनेटिक नियामक तंत्र कीमोथेरेपी दवाओं के निरंतर संपर्क में प्रसार और अस्तित्व को प्रभावित करते हैं। गैर-हेमेटोलॉजिकल दुर्दमताओं में अध्ययन से पता चला है कि दवा के प्रभाव को दूर करने वाली कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश विभिन्न एपिजेनेटिक्स संशोधनों से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप उन कोशिकाओं का अस्तित्व 6,7 होता है। हालांकि, एएमएल में साइटाराबिन के लिए अधिग्रहित प्रतिरोध की मध्यस्थता में एपिजेनेटिक कारकों की भूमिका का पता नहीं लगाया गया है।
उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दवा की खोज के लिए एक दृष्टिकोण है जिसने समय के साथ वैश्विक महत्व प्राप्त किया है और सेलुलर तंत्र में संभावित लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विभिन्न पहलुओं में एक मानक विधि बन गई है, मार्ग प्रोफाइलिंग के लिए, और आणविक स्तर पर 8,9। सिंथेटिक घातकता अवधारणा में दो जीनों के बीच बातचीत शामिल है जहां अकेले जीन की गड़बड़ी व्यवहार्य है, लेकिन दोनों जीनों के परिणामस्वरूप एक साथ व्यवहार्यता10 का नुकसान होता है। कैंसर के उपचार में सिंथेटिक घातकता का शोषण करने से मजबूत सिंथेटिक घातक आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान करने और यांत्रिक रूप से चिह्नित करने में मदद मिल सकतीहै। हमने एएमएल में अधिग्रहित साइटाराबिन प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार एपिजेनेटिक कारकों की पहचान करने के लिए सिंथेटिक घातकता के साथ उच्च-थ्रूपुट shRNA स्क्रीनिंग का एक संयुक्त दृष्टिकोण अपनाया है।
मिश्रित-वंश ल्यूकेमिया जीन (एमएलएल या केएमटी 2 ए) के क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन द्वारा संचालित तीव्र ल्यूकेमिया को रोगियों में खराब अस्तित्व से जुड़ा होने के लिए जाना जाता है। एमएलएल जीन पुनर्व्यवस्था के परिणामी चिमेरिक उत्पाद, यानी, एमएलएल संलयन प्रोटीन (एमएलएल-एफपी), हेमटोपोइएटिक स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) को कई एपिजेनेटिक कारकों की भागीदारी के साथ ल्यूकेमिया विस्फोटों में बदल सकते हैं। ये एपिजेनेटिक नियामक एक जटिल नेटवर्क का गठन करते हैं जो ल्यूकेमिया कार्यक्रम के रखरखाव को निर्देशित करता है और इसलिए, संभावित चिकित्सीय लक्ष्य बना सकता है। इस संदर्भ में, हमने अधिग्रहित साइटाराबिन प्रतिरोधी सेल लाइन को विकसित करने के लिए एमवी 4-11 सेल लाइन (एमएलएल संलयन जीन एमएलएल-एएफ 4 को एफएलटी 3-आईटीडी उत्परिवर्तन के साथ हार्बरिंग; एमवी 4-11 पी के रूप में जाना जाता है; जिसे एमवी 4-11 एआरसी आर के रूप में जाना जाता है) का उपयोग किया। सेल लाइन को दवा के उपचार से आंतरायिक वसूली के साथ साइटाराबिन की बढ़ती खुराक के संपर्क में लाया गया था, जिसे दवा की छुट्टी के रूप में जाना जाता है। आधा अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) इन विट्रो cytotoxicity परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था.
हम एक pZIP lentiviral रीढ़ के साथ hEF1a प्रमोटर द्वारा संचालित pooled epigenetic shRNA पुस्तकालय (सामग्री की तालिका देखें) का इस्तेमाल किया. इस पुस्तकालय में 407 एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करने वाले एसएचआरएनए शामिल हैं। प्रत्येक कारक में 5-24 shrnas हैं, जिसमें कुल 5,485 shrnas हैं, जिसमें पांच गैर-लक्षित नियंत्रण shrnAs शामिल हैं। संशोधित "UltrmiR" miR-30 पाड़ कुशल प्राथमिक shRNA biogenesis और अभिव्यक्ति12,13 के लिए अनुकूलित किया गया है।
इस प्रयोग की रूपरेखा को चित्र 1A में दर्शाया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल MV4-11 AraC R सेल लाइन (चित्रा 1B), एक निलंबन सेल लाइन में epigenetic कारक shRNA पुस्तकालय का उपयोग करके RNAI स्क्रीनिंग पर केंद्रित है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी की पसंद के किसी भी दवा-प्रतिरोधी सेल लाइन में किसी भी लक्षित पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल अनुयायी कोशिकाओं के लिए अलग होगा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

अधिग्रहित कीमो-प्रतिरोध के नैदानिक रूप से प्रासंगिक चालक तंत्र को समझना प्रतिरोध को दरकिनार करने और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) वाले रोगियों में अस्तित्व में सुधार करने के तरीकों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। ल्यूकेमिया कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश जो कीमोथेरेपी से बचजाता है, में कीमोथेरेपी अपमान को सहन करने के लिए एक तैयार एपिजेनेटिक स्थिति होती है। कीमोथेरेपी के लिए आगे के संपर्क में इन दवा persister कोशिकाओं को एक निश्चित epigenetic राज्य प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन दवा प्रतिरोधी आबादी का प्रसार होता है और अंततः पुनरावृत्ति या दुर्दम्य रोग होता है। इसलिए, एपिजेनेटिक मॉड्यूलेशन की पहचान करना जो दवा प्रतिरोधी ल्यूकेमिया कोशिकाओं के अस्तित्व की आवश्यकता होती है, महत्वपूर्ण है। हम एपिजेनेटिक मॉड्यूलेटर की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं जो एक अधिग्रहित साइटाराबिन-प्रतिरोधी एएमएल सेल लाइन में पूल किए गए shRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग का उपयोग करके न्यूक्लियोसाइड एनालॉग साइटाराबिन (AraC) के प्रतिरोध की मध्यस्थता करते हैं। पुस्तकालय में 5,485 shRNA निर्माण शामिल हैं जो 407 मानव एपिजेनेटिक कारकों को लक्षित करते हैं, जो उच्च-थ्रूपुट एपिजेनेटिक कारक स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।

समग्र स्क्रीनिंग वर्कफ़्लो को चित्र 1A में दर्शाया गया है. MV4-11 AraC R (48 h) की इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी ने MV4-11 AraC R में CYTARABINE के लिए IC50 को MV4-11 P (चित्रा 1B) से अधिक होने का खुलासा किया। इस ?...

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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

उच्च-थ्रूपुट आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्क्रीनिंग लेंटिवायरल shrnas के एक पूल का उपयोग करके दुर्दमताओं में चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक सिंथेटिक घातक लक्ष्यों का पता लगाने के लिए एक उपकरण हो सकता है। हम तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में एपिजेनेटिक प्रभावकों की जांच करने के लिए एक पूल किए गए shRNA स्क्रीनिंग दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

पूल shRNA लाइब्रेरी स्क्रीनिंग कारकों की पहचान करने के लिए जो एक दवा प्रतिरोध फेनोटाइप को संशोधित करते हैं

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

उपन्यास ब्याह वेरिएंट में दवा प्रतिरोध करने के लिए संबंधित का पता लगाने के लिए शाही सेना अनुक्रमण का उपयोग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; कैंसर मॉडल

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

उपयोग कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीनिंग कैंसर सेल उपगोल संस्कृतियों में संभावित उपन्यास ड्रग लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

लक्षित थेरेपी के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के चालक रास्ते के लिए खोज: दवा प्रतिरोधी उपक्लोन पीढ़ी और संवेदनशीलता जीन दस्तक नीचे से बहाल

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

जीनोम चौड़ा RNAi स्क्रीनिंग मेजबान कारकों है कि Oncolytic वायरस थेरेपी मिलाना की पहचान करने के लिए

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

दवा स्क्रीनिंग के लिए उच्च प्रवाह तीन आयामी ट्यूमर Spheroids की पीढ़ी

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

एक क्रोमेटिन Immunoprecipitation परख पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में उपंयास NFAT2 लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

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कैंसर स्टेम सेल को लक्षित करने के लिए एंटी-नोप्लास्टिक दवा स्क्रीनिंग के लिए फिजियोलॉजी रोगी व्युत्पन्न 3 डी स्फिरॉइड्स

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

सिंथेटिक घातक इंटरैक्शन को लक्षित करने वाले ड्रग कॉम्बिनेशन की पहचान करने के लिए एक डेटा इंटीग्रेशन वर्कफ़्लो

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

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जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट की दवा जांच

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...