Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
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Questo studio è finanziato in parte da una sovvenzione del Dipartimento di Biotecnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; e Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 e Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS e P.B. sono supportati rispettivamente da Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842. S.D. è supportato dalla borsa di studio CSIR-UGC e S.I. è supportato da una borsa di ricerca senior ICMR. Ringraziamo Abhirup Bagchi, Sandya Rani e lo staff del CSCR Flow Cytometry Core Facility per il loro aiuto. Ringraziamo anche MedGenome Inc. per l'aiuto con il sequenziamento ad alto throughput e l'analisi dei dati.

Seguire le linee guida dell'Institutional Biosafety Committee (IBSC) e utilizzare la struttura appropriata per gestire il lentivirus (BSL-2). Il personale deve essere adeguatamente addestrato alla manipolazione e allo smaltimento del lentivirus. Questo protocollo segue le linee guida sulla biosicurezza del Christian Medical College, Vellore.
1. Selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione persistente e prolungata degli shRNA
NOTA: ...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è ampiamente utilizzata per gli studi di genomica funzionale, che includono lo screening di siRNA e shRNA. Il vantaggio dello shRNA è che possono essere incorporati in vettori plasmidici e integrati nel DNA genomico, con conseguente espressione stabile e, quindi, abbattimento più prolungato dell'mRNA bersaglio. Uno screening della libreria shRNA in pool è robusto ed economico rispetto agli schermi arrayed convenzionali (siRNA). Identificare l'essenzialità di una specifica classe di pro...

Le opzioni terapeutiche nella leucemia mieloide acuta (LMA) sono rimaste invariate per quasi gli ultimi cinque decenni, con citarabina (AraC) e antracicline come pietra angolare per il trattamento della malattia. Una delle sfide per il successo della terapia AML è la resistenza delle cellule staminali leucemiche alla chemioterapia, che porta alla recidivadella malattia 1,2. La regolazione epigenetica svolge un ruolo vitale nella patogenesi del cancro e nella resistenza ai farmaci, e diversi fattori epigenetici sono emersi come promettenti bersagli terapeutici 3,4,5. I meccanismi di regolazione epigenetica influenzano la proliferazione e la sopravvivenza in caso di esposizione continua a farmaci chemioterapici. Studi su tumori maligni non ematologici hanno riportato che una piccola frazione di cellule che superano l'effetto del farmaco subisce varie modificazioni epigenetiche, con conseguente sopravvivenza di quelle cellule 6,7. Tuttavia, il ruolo dei fattori epigenetici nel mediare la resistenza acquisita alla citarabina nella LMA non è stato esplorato.
Lo screening ad alto rendimento è un approccio alla scoperta di farmaci che ha acquisito importanza globale nel tempo ed è diventato un metodo standard in diversi aspetti per identificare potenziali bersagli nei meccanismi cellulari, per la profilazione dei percorsi e a livello molecolare 8,9. Il concetto di letalità sintetica coinvolge l'interazione tra due geni in cui la perturbazione di uno dei due geni da solo è praticabile ma di entrambi i geni provoca contemporaneamente la perdita di vitalità10. Sfruttare la letalità sintetica nel trattamento del cancro potrebbe aiutare a identificare e caratterizzare meccanicamente robuste interazioni genetiche sintetiche letali11. Abbiamo adottato un approccio combinatorio di screening shRNA ad alto rendimento con letalità sintetica per identificare i fattori epigenetici responsabili della resistenza acquisita alla citarabina nella LMA.
Le leucemie acute guidate dalla traslocazione cromosomica del gene della leucemia a lignaggio misto (MLL o KMT2A) sono note per essere associate a scarsa sopravvivenza nei pazienti. I prodotti chimerici risultanti dei riarrangiamenti genici MLL , cioè le proteine di fusione MLL (MLL-FP), possono trasformare le cellule staminali / progenitrici ematopoietiche (HSPC) in blasti leucemici con il coinvolgimento di più fattori epigenetici. Questi regolatori epigenetici costituiscono una rete complicata che detta il mantenimento del programma di leucemia e, quindi, potrebbero formare potenziali bersagli terapeutici. In questo contesto, abbiamo utilizzato la linea cellulare MV4-11 (che ospita il gene di fusione MLL MLL-AF4 con la mutazione FLT3-ITD; definita come MV4-11 P) per sviluppare la linea cellulare resistente alla citarabina acquisita, definita come MV4-11 AraC R. La linea cellulare è stata esposta a dosi crescenti di citarabina con recupero intermittente dal trattamento farmacologico, noto come vacanza farmacologica. La concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) è stata valutata mediante test di citotossicità in vitro .
Abbiamo utilizzato la libreria di shRNA epigenetica aggregata (vedi Tabella dei materiali) guidata dal promotore hEF1a con una spina dorsale lentivirale pZIP. Questa libreria comprende shRNA mirati a 407 fattori epigenetici. Ogni fattore ha 5-24 shRNA, con un totale di 5.485 shRNA, tra cui cinque shRNA di controllo non mirati. L'impalcatura miR-30 "UltrmiR" modificata è stata ottimizzata per un'efficiente biogenesi ed espressionedello shRNA primario 12,13.
Lo schema di questo esperimento è illustrato nella Figura 1A. L'attuale protocollo si concentra sullo screening RNAi utilizzando la libreria shRNA del fattore epigenetico nella linea cellulare MV4-11 AraC R (Figura 1B), una linea cellulare in sospensione. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di qualsiasi libreria mirata in qualsiasi linea cellulare resistente ai farmaci di propria scelta. Va notato che il protocollo di trasduzione sarà diverso per le cellule aderenti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Comprendere i meccanismi driver clinicamente rilevanti della chemio-resistenza acquisita è fondamentale per chiarire i modi per aggirare la resistenza e migliorare la sopravvivenza nei pazienti con leucemia mieloide acuta (LMA). Una piccola frazione di cellule leucemiche che sopravvivono alla chemioterapia hanno uno stato epigenetico pronto a tollerare l'insulto chemioterapico. Un'ulteriore esposizione alla chemioterapia consente a queste cellule persistenti di raggiungere uno stato epigenetico fisso, che porta a un'alterata espressione genica, con conseguente proliferazione di queste popolazioni resistenti ai farmaci e infine malattia recidivante o refrattaria. Pertanto, identificare le modulazioni epigenetiche che richiedono la sopravvivenza delle cellule leucemiche resistenti ai farmaci è fondamentale. Descriviamo in dettaglio un protocollo per identificare i modulatori epigenetici che mediano la resistenza all'analogo nucleosidico citarabina (AraC) utilizzando lo screening della libreria di shRNA aggregato in una linea cellulare AML resistente alla citarabina acquisita. La libreria è composta da 5.485 costrutti shRNA mirati a 407 fattori epigenetici umani, che consentono lo screening dei fattori epigenetici ad alto rendimento.

Il flusso di lavoro di screening complessivo è illustrato nella Figura 1A. La citotossicità in vitro dell'AraC R MV4-11 (48 h) ha rivelato che l'IC50 alla citarabina nell'MV4-11 AraC R è superiore all'MV4-11 P (Figura 1B). Questa linea cellulare è stata utilizzata nello studio come modello per lo screening dei fattori epigenetici responsabili della resistenza alla citarabina.
La Figur...

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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

L'obiettivo generale del seguente video è dimostrare l'uso della libreria epigenetica di shRNA aggregata per condurre uno screening di selezione negativa. Questo screening consente di identificare specifici bersagli epigenetici attraverso il sequenziamento. Questa procedura potrebbe aiutare a identificare i fattori epigenetici responsabili della mediazione della resistenza acquisita alla citarabina nella LMA I passaggi sono i seguenti.Selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione persistente e prolungata degli shRNA. L'attuale protocollo si concentra sullo screening RNAi utilizzando la libreria di shRNA del fattore epigenetico nella linea cellulare MV4-11 resistente alla citarabina. I promotori utilizzati per questo scopo sono EF-1 alfa umano, CMV umano e SFFV, promotori che esprimono proteine di fluorescenza verde.Prendi il conteggio delle celle usando il metodo di esclusione blu trypan. Sospendere le celle in un mezzo 10%RPMI contenente 8 microgrammi per mL di polibrene. Semina 1 milione di cellule in 1,5 ml di mezzo per pozzetto di una piastra a sei pozzetti in triplicati.Aggiungi diversi volumi di lentivirus concentrati. Ad esempio, i lentivirus, ad esempio, 10, 20 e 40 microlitro, a seconda del titolo dei lentivirus per ciascun pozzo. Ruotare delicatamente il piatto per mescolare il contenuto.Eseguire spinfection per centrifugazione a 920 g a 37 gradi centigradi per 90 minuti. Incubare immediatamente le piastre in un incubatore di anidride carbonica. Osservare la GFP alla fine di 48 ore e quantificare la stessa alla fine di 72 ore.Quindi, segui i passaggi come illustrato nel diagramma di flusso per scegliere il promotore che mostra un'espressione GFP coerente in tutta la cultura. Preparazione della libreria di shRNA del fattore epigenetico umano lentivirale aggregato. Coltura di cellule 293T a un basso numero di passaggio con un buon tasso di proliferazione in tre piatti di coltura cellulare da 10 centimetri con 8 ml di mezzo DMFM al 10% in ogni piastra.Una volta che le cellule raggiungono il 60% di confluenza, sostituire completamente con un mezzo fresco. Preparare la miscela di trasfezione come delineato che contiene mezzo privo di siero, plasmide di imballaggio lentivirale PAX2, plasmide di involucro pMD2. G, plasmidi di libreria in pool e infine il reagente di trasfezione.Toccare la miscela per mescolarla bene e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle 293T e mescolare delicatamente facendo roteare le piastre. Incubare le piastre in un incubatore di anidride carbonica.Cambiare il mezzo dopo 24 ore. Dopo 48 ore, controllare l'espressione della GFP al microscopio a fluorescenza per garantire un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule 293T. Raccogliere i supernatanti virali dopo 48, 60 e 72 ore e conservarli a 4 gradi e aggiungere un mezzo fresco, 8 ml, in ogni punto temporale dopo aver raccolto il virus.Filtrare i virus raggruppati con un filtro da 0,4 micron. Per ottenere un titolo elevato di virus, concentrare i virus raggruppati mediante ultracentrifugazione. Trasferire i supernatanti virali filtrati in tubi da 70 Ti e centrifugare a 18.000 g per 2 ore.Utilizzare rotore preraffreddato e centrifuga a 4 gradi. Estrarre accuratamente i tubi dalla centrifuga e rimuovere completamente il surnatante. Sospendere delicatamente il pellet in 400 microlitri di DMEM senza FBS e antibiotici usando una micropipetta, incubare sul ghiaccio per 1 ora.Aliquota i virus e congelamento a meno 80 gradi. Calcola la concentrazione del virus come mostrato. Stima dell'efficienza di trasduzione dei lentivirus.Trasdurre cellule 293T con un virus concentrato in diversi volumi, 2, 4 e 8, per confermare il successo della preparazione del lentivirus. Valore del virus concentrato a 100X per eseguire un esperimento di titolazione nella linea cellulare target. Semina 1 milione di linee cellulari bersaglio in 1,5 ml di mezzo 10% RPMI contenente 8 microgrammi per ml di polibrene in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Aggiungi quattro diversi volumi, 1, 1.5, 2, 2.5 microlitro di virus 100X. Eseguire la spinfection mediante centrifugazione della piastra a 920 g per 90 minuti a 37 gradi centigradi. Dopo 72 ore, misurare la percentuale di cellule GFP positive mediante citometria a flusso.Determinare il volume dei virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30%. Questa bassa efficienza di trasduzione serve a garantire l'integrazione di un singolo shRNA per cella. Trasduzione della libreria di shRNA epigenetici raggruppati nella linea cellulare resistente ai farmaci.Calcola il numero di cellule da prelevare per l'esperimento come di seguito in base al numero di integranti virali. Risospesa 11 milioni di celle in 16 ML di supporto RPMI al 10%. Aggiungere il polibrene, otto microgrammi per ml e mescolare bene, quindi aggiungere il volume richiesto di virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30% come calcolato in precedenza.Semina tutte le cellule su una piastra a sei pozzetti ad una densità di 1 milione di cellule per 1,5 ml per pozzetto. Centrifugare la piastra per 90 minuti a 920 g a 37 gradi centigradi. Incubare la piastra durante la notte in un incubatore di anidride carbonica.Dopo 24 ore, cambiare il mezzo e trasferire le cellule trasdotte in un pallone T-75. Dopo 48 ore, controllare la GFP al microscopio a fluorescenza per garantire una trasduzione di successo. Dopo 72 ore, quantificare la GFP mediante citometria a flusso.Arricchimento delle cellule GFP positive. Espandere le cellule trasdotte coltivandole a una densità di 0,5 milioni per ml per 5-7 giorni ed eseguire lo smistamento del flusso con l'impostazione di selezione del flusso impostata come elevata purezza e bassa resa. Coltivare le cellule ordinate in un mezzo RPMI al 10%.Dopo 72 ore, eseguire la stima post-ordinamento della percentuale di celle GFP positive per garantire un'efficienza di smistamento superiore al 95%. Screening dell'abbandono per identificare i fattori epigenetici che mediano la resistenza ai farmaci. Coltiva le cellule trasdotte dalla libreria shRNA in RPMI al 10% per un massimo di 5 giorni.Centrifuga 10 milioni di celle in duplicati. Scartare il surnatante e conservare i pellet a meno 80 gradi. Questi campioni serviranno come riferimento di base per la libreria di shRNA epigenetici.Coltiva le cellule trasdotte rimanenti come duplicati, R1 e R2, ciascuna mantenuta a un conteggio delle cellule che fornisce una rappresentazione 500X della libreria. Trattare uno dei duplicati con il farmaco, 10 citarabina micromolare e l'altro senza il trattamento farmacologico. Cambia il mezzo per i palloni con e senza il farmaco ogni 72 ore.Ripetere il cambiamento medio tre volte per un'esposizione cumulativa al farmaco di 9 giorni. Dopo il 9 ° giorno di trattamento farmacologico, controllare la vitalità delle cellule con il metodo di esclusione del tripano blu. Girare verso il basso le cellule vitali rimanenti, lavare con PBS sterile e centrifugare a 280 g per 5 minuti a temperatura ambiente.Scartare il surnatante e conservare i pellet a meno 80 per l'estrazione del DNA. Amplificazione degli shRNA integrati mediante PCR. Estrarre il DNA dalle cellule basali trasdotte, cellule trattate e non trattate, seguito dal controllo della concentrazione utilizzando il fluorometro, calcolare la quantità di DNA richiesta come mostrato e sottoporre i campioni al primo ciclo di PCR.La miscela di reazione PCR è rappresentata nella tabella 2 con le condizioni del ciclo termico. Impostare reazioni multiple contenenti 850 nanogrammi di DNA per tubo per un totale di 43 reazioni. Raggruppare i prodotti PCR e purificarli.Eluire i prodotti in un tampone da 50 microlitri e quantificarli e, infine, conservare a meno 20. Per la PCR del secondo round, utilizzare primer a indice inverso e i reagenti sono tabulati nella tabella 4. Impostare quattro reazioni con 500 nanogrammi del prodotto PCR primario in un volume totale di reazione di 50 microlitro per ciascun campione insieme al controllo negativo.Caricare l'intero prodotto per l'elettroforesi utilizzando gel di agarosio 2%TBE e confermare la dimensione della banda con una scala molecolare KB. Visualizza i prodotti PCR sul sistema di documentazione del gel. Asportare la fascia specifica e purificare utilizzando un kit di purificazione in gel.I calcoli per la purificazione con il kit sono forniti nella tabella 3. Eluire in un volume finale di 30 microlitri di tampone di eluizione con la concentrazione approssimativa di ciascun eluente intorno a 80-90 nanogrammi per microlitro. Sequenziamento e analisi dei dati di nuova generazione.I prodotti purificati in gel sono sottoposti a sequenziamento di nuova generazione per ottenere conteggi di lettura per le esigenze di shRNA impoverito. Tagliare le sequenze dell'adattatore, allineare le letture filtrate alle sequenze di riferimento, caricare i file utilizzando SAMtools per ottenere il riepilogo dell'allineamento. Carica i file fastQ tagliati in CRISPRCloud2 ed esegui l'analisi secondo le istruzioni.Fare clic sul collegamento fornito per CRISPRCloud2. Seleziona il tipo di schermo come schermate Sopravvivenza e Dropout. Impostare il numero di gruppi e digitare il nome di ciascun gruppo.Caricare la libreria di riferimento come formato di file FASTA. I dati caricati vengono elaborati e i risultati sono disponibili nell'URL specificato. Dati rappresentativi.Questa figura mostra le cellule parentali e resistenti MV4-11 trattate con concentrazione crescente di citarabina, da 0,1 micromolare a 1.000 micromolari e la valutazione della vitalità mediante test MTT. Questa figura mostra i grafici di flusso rappresentativi della GFP quantificati mediante citometria a flusso alla fine di 72 ore per i promotori umani EF-1 alfa, CMV umano e SFFV. Il CMV umano mostra il nostro picco eterogeneo mentre l'EF-1 alfa e l'SFFV umani mostrano un singolo picco omogeneo.Questa figura mostra il grafico a barre per le tre diverse efficienze del promotore in MV4-11. La GFP guidata da SFFV ha mostrato il silenziamento della GFP in una coltura prolungata. Le cellule GFP hEF-1 alfa-driven hanno mostrato un'espressione sostenuta dopo l'ordinamento di queste cellule.Il pannello di sinistra mostra l'efficienza di trasfezione della libreria di shRNA raggruppata trasfetta in 293T alla fine di 48 ore al microscopio a fluorescenza. Il pannello di destra mostra l'efficienza di trasduzione del virus della piscina in 293T cellule con volumi di virus variabili, 2, 4 e 8 microlitri. Questa cifra rappresenta l'efficienza di trasduzione nella linea cellulare resistente a MV4-11 con volumi variabili di virus, come 1, 1,5, 2, 2,5 microliti per raggiungere un'efficienza di trasduzione del 30%.Questa figura mostra lo smistamento delle celle GFP positive con efficienza di trasduzione del 30% con elevata purezza e impostazione di selezione a bassa resa. La figura mostra un'illustrazione schematica del trattamento farmacologico per le cellule selezionate GFP positive per un'esposizione prolungata alla citarabina di 9 giorni, seguita dal controllo della vitalità e dalla raccolta delle cellule per il DNA. Questa figura mostra le regioni di legame del primer utilizzate nel primo e nel secondo ciclo di PCR.Questa figura illustra la dimensione della banda del prodotto PCR alla fine della PCR del primo round, 397 coppie di basi, e la seconda coppia di basi del prodotto PCR 399, che è stata eluita in gel, purificata e somministrata per NGS. Questa figura illustra la rappresentazione degli shRNA arricchiti o impoveriti che prendono di mira i fattori epigenetici che potrebbero mediare la resistenza alla citarabina nella LMA. Conclusione. Questo protocollo evidenzia l'importanza di uno screening mirato per interrogare sistematicamente geni essenziali e non essenziali e dimostra l'uso di questo approccio come piattaforma funzionale, consentendo l'identificazione di bersagli responsabili della resistenza ai farmaci.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

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Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Un flusso di lavoro di integrazione dei dati per identificare le combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche

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Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...