Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
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この研究は、バイオテクノロジー省の助成金BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013からSRVへの資金提供を受けています。インドバイオテクノロジー省BT/COE/34/SP13432/2015およびインド科学技術省:EMR/2017/003880からP.B. RVSおよびP.B.は、それぞれWellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118およびIA/S/15/1/501842によってサポートされています。S.D.はCSIR-UGCフェローシップによって支援され、S.I.はICMRシニアリサーチフェローシップによってサポートされています。Abhirup Bagchi、Sandya Rani、CSCR Flow Cytometry Core Facilityのスタッフの協力に感謝します。また、ハイスループットシーケンシングとデータ解析を支援してくれたMedGenome Inc.にも感謝します。

インスティテューショナルバイオセーフティ委員会(IBSC)のガイドラインに従い、レンチウイルス(BSL-2)を処理するために適切な施設を使用してください。担当者は、レンチウイルスの取り扱いと処分について適切な訓練を受けるべきです。このプロトコルは、クリスチャン医科大学、ヴェローレのバイオセーフティガイドラインに従います。
1. shRNAの持続的かつ長期?...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA干渉(RNAi)は、siRNAおよびshRNAスクリーニングを含む機能ゲノミクス研究に広く使用されている。shRNAの利点は、それらをプラスミドベクターに組み込んでゲノムDNAに組み込むことができ、安定した発現をもたらし、したがって標的mRNAのより長期のノックダウンをもたらすことである。プールされたshRNAライブラリースクリーニングは、従来のアレイスクリーニング(siRNA)と比較して堅牢で費用...

急性骨髄性白血病(AML)の治療選択肢は、シタラビン(AraC)とアントラサイクリンをこの疾患を治療するための礎石として、過去50年近く変わっていません。AML療法の成功に対する課題の1つは、化学療法に対する白血病幹細胞の耐性であり、疾患の再発につながる1,2。エピジェネティックな調節は、がんの病因および薬剤耐性において重要な役割を果たしており、いくつかのエピジェネティックな因子が有望な治療標的として浮上している3,4,5。エピジェネティックな調節機構は、化学療法薬への継続的な曝露下での増殖および生存に影響を及ぼす。非血液学的悪性腫瘍における研究は、薬物効果を克服する細胞のごく一部が様々なエピジェネティクス修飾を受け、それらの細胞の生存をもたらすことを報告している6,7。しかしながら、AMLにおけるシタラビンに対する後天性耐性を媒介するエピジェネティック因子の役割は、探求されていない。
ハイスループットスクリーニングは、時間の経過とともに世界的に重要性を増してきた創薬へのアプローチであり、細胞メカニズム、経路プロファイリング、および分子レベルで潜在的な標的を同定するためのさまざまな側面で標準的な方法となっています8,9。合成致死性の概念は、どちらかの遺伝子のみの摂動が実行可能であるが、両方の遺伝子の同時実行可能性の喪失をもたらす2つの遺伝子間の相互作用を含む10。がん治療における合成致死性を利用することは、堅牢な合成致死的遺伝的相互作用を特定し、機械的に特徴付けるのに役立つ可能性がある11。我々は、AMLにおける後天性シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子を同定するために、合成致死性を有するハイスループットshRNAスクリーニングのコンビナトリアルアプローチを採用した。
混合系統白血病遺伝子(MLL または KMT2A)の染色体転座によって引き起こされる急性白血病は、患者の生存率の低下と関連していることが知られている。得られたMLL遺伝子再構成のキメラ産物、すなわちMLL融合タンパク質( MLL-FP )は、造血幹/前駆細胞(HSPC)を複数のエピジェネティック因子の関与により白血病芽細胞に変換することができる。これらのエピジェネティックな調節因子は、白血病プログラムの維持を指示する複雑なネットワークを構成し、したがって、潜在的な治療標的を形成する可能性がある。この文脈で、我々はMV4-11細胞株(FLT3-ITD変異を有するMLL融合遺伝子MLL-AF4を保有し、MV4-11Pと称される)を用いて、MV4-11 AraC Rとして知られる後天性シタラビン耐性細胞株を開発した。細胞株は、薬物の休日として知られている薬物治療からの断続的な回復を伴うシタラビンの用量の増加に曝露された。半最大阻害濃度(IC50)を インビトロ 細胞傷害性アッセイにより評価した。
我々は、pZIPレンチウイルス骨格を有するhEF1aプロモーターによって駆動されるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリー( 材料表を参照)を使用した。このライブラリーは、407のエピジェネティック因子を標的とするshRNAを含む。各因子には5~24個のshRNAがあり、5個の非標的対照shRNAを含む合計5,485個のshRNAがあります。修飾された「UltrmiR」miR−30スキャフォールドは、効率的な一次shRNA生合成および発現12、13のために最適化されている。
この実験の概要を 図1Aに示します。現在のプロトコルは、浮遊細胞株であるMV4-11 AraC R細胞株(図1B)におけるエピジェネティック因子shRNAライブラリーを用いたRNAiスクリーニングに焦点を当てています。このプロトコルは、任意の薬剤耐性細胞株中の任意の標的ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。形質導入プロトコルは、接着細胞について異なるであろうことに留意されたい。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

急性骨髄性白血病(AML)患者の耐性を回避し、生存率を改善する方法を解明するためには、後天性化学抵抗性の臨床的に関連するドライバーメカニズムを理解することが不可欠です。化学療法を生き延びた白血病細胞のごく一部は、化学療法的侮辱に耐えうるエピジェネティックな状態にある。化学療法へのさらなる曝露は、これらの薬物持続細胞が固定エピジェネティック状態を達成することを可能にし、これは遺伝子発現の変化をもたらし、これらの薬物耐性集団の増殖をもたらし、最終的には再発または難治性疾患をもたらす。したがって、薬剤耐性白血病細胞の生存を必要とするエピジェネティックな変調を同定することは極めて重要である。我々は、ヌクレオシド類似体シタラビン(AraC)に対する耐性を媒介するエピジェネティックモジュレーターを同定するためのプロトコルを、獲得シタラビン耐性AML細胞株におけるプールされたshRNAライブラリースクリーニングを用いて詳述する。このライブラリーは、407のヒトエピジェネティック因子を標的とする5,485のshRNAコンストラクトで構成されており、ハイスループットのエピジェネティック因子スクリーニングを可能にします。

スクリーニングワークフロー全体を図1Aに示します。MV4−11 AraC Rのインビトロ細胞傷害性(48時間)は、MV4−11 AraC R中のシタラビンに対するIC50がMV4−11 Pよりも高いことを明らかにした(図1B)。この細胞株を、シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子をスクリーニングするためのモデルとして研究に使用した。
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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

以下のビデオの全体的な目標は、ネガティブセレクションスクリーニングを実施するためにプールされたshRNAエピジェネティックライブラリーの使用を実証することである。このスクリーニングにより、シーケンシングを通じて特定のエピジェネティックな標的を同定することができます。この手順は、AMLにおける後天性シタラビン耐性を媒介する原因となるエピジェネティック因子を同定するのに役立ち得るステップは以下の通りである。shRNAsの持続的かつ長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択。現在のプロトコールは、シタラビン耐性MV4-11細胞株におけるエピジェネティック因子shRNAライブラリーを用いたRNAiスクリーニングに焦点を当てている。この目的に使用されるプロモーターは、ヒトEF−1アルファ、ヒトCMV、およびSFFVであり、緑色蛍光タンパク質を発現するプロモーターである。トリパンブルー排除法を用いて細胞数をとる。細胞を1mLあたり8マイクログラムのポリブレンを含む10%RPMI培地に懸濁する。6ウェルプレートのウェルあたり1.5mlの培地に100万個の細胞を3連で播種する。濃縮レンチウイルスの異なるボリュームを追加します。例えば、レンチウイルスは、例えば、10、20、および40マイクロリットルを、各ウェルに対するレンチウイルスの力価に依存する。プレートを静かに回転させて内容物を混ぜます。920g、摂氏37度で90分間遠心分離による製菌を行う。直ちにプレートを二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートする。48時間の終わりにGFPを観察し、72時間の終わりに同じものを定量化します。次に、フローチャートに示されている手順に従って、培養物全体で一貫したGFP発現を示すプロモーターを選択します。プールされたレンチウイルスヒトエピジェネティック因子shRNAライブラリーの調製。各プレートに8mlの10%DMFM培地を用いた3つの10センチメートル細胞培養皿において良好な増殖速度を有する低い継代数で293T細胞を培養した。細胞が60%のコンフルエントに達したら、新鮮な培地と完全に交換する。無血清培地、レンチウイルスパッケージングプラスミドPAX2、エンベローププラスミドpMD2を含む概説どおりにトランスフェクションミックスを準備します。G、ライブラリープラスミドをプールし、最後にトランスフェクション試薬とした。混合物をタップしてよく混合し、室温で15分間インキュベートする。トランスフェクション混合物を293T細胞に加え、プレートを旋回させて穏やかに混合する。プレートを二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートする。24時間後に培地を交換してください。48時間後、蛍光顕微鏡でGFP発現をチェックし、293T細胞への高いトランスフェクション効率を確保しました。48、60、72時間後にウイルス上清を回収し、4度で保存し、ウイルスを回収した後の各時点で新鮮な培地8mlを加えます。プールされたウイルスを 0.4 ミクロンのフィルターでフィルター処理します。ウイルスの高力価を得るためには、プールされたウイルスを超遠心分離により濃縮する。濾過したウイルス上清を70本のTiチューブに移し、18,000gで2時間遠心分離した。予冷ローターを使用し、4度で遠心分離機を使用してください。遠心分離機からチューブを慎重に取り出し、上清を完全に取り除きます。マイクロピペットを用いてFBSおよび抗生物質を含まない400マイクロリットルのDMEMにペレットを穏やかに再懸濁し、氷上で1時間インキュベートする。ウイルスをアリコートし、マイナス80度で凍結する。図に示すように、ウイルスの濃度を計算します。レンチウイルスの形質導入効率の推定293T細胞を異なる体積の濃縮ウイルス(2、4、および8)で形質導入し、レンチウイルスの調製が成功したことを確認した。ウイルスを100倍に濃縮した値を標的細胞株で滴定実験を行った。1mlあたり8マイクログラムのポリブレンを含む1.5mlの10%RPMI培地中の100万個の標的細胞株を6ウェルプレートの1ウェルにシードする。4 つの異なるボリューム 1、1.5、2、2.5 マイクロリットルの 100X ウイルスを追加します。プレートを920gで37°Cで90分間遠心分離して製芽を行う。72時間後、GFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する。ウイルスの量を決定し、30%の形質導入効率を得る。この低い形質導入効率は、細胞当たり単一のshRNA組み込みを確実にするためである。薬剤耐性細胞株におけるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリーの形質導入。ウイルス組積物の数に基づいて、以下のように実験のために採取する細胞の数を計算する。16 ML の 10%RPMI 培地に 1,100 万個の細胞を再懸濁します。ポリブレンを1mlあたり8マイクログラム加えてよく混ぜ合わせ、必要な量のウイルスを加えて、前に計算したように30%の形質導入効率を得る。すべての細胞を6ウェルプレート上に、ウェルあたり1.5mlあたり100万個の細胞の密度で播種する。プレートを摂氏37度で920gで90分間遠心分離する。プレートを二酸化炭素インキュベーター内で一晩インキュベートする。24時間後、培地を交換し、形質導入細胞をT-75フラスコに移した。48時間後、蛍光顕微鏡下でGFPをチェックし、形質導入が成功したことを確認します。72時間後、フローサイトメトリーによりGFPを定量する。GFP陽性細胞の富化。形質導入細胞を1mlあたり50万の密度で5~7日間培養して増殖させ、高純度・低収率に設定したフローソーティング設定でフローソーティングを行う。選別した細胞を10%RPMI培地で培養する。72時間後、GFP陽性細胞の割合の選別後推定を行い、95%以上の選別効率を確保した。薬物耐性を媒介するエピジェネティック因子を同定するためのドロップアウトスクリーニング。shRNAライブラリー形質導入細胞を10%RPMIで最大5日間培養する。1000万個の細胞を二重に遠心分離する。上清を捨て、ペレットをマイナス80度で保管する。これらのサンプルは、エピジェネティックなshRNAライブラリーのベースラインリファレンスとして役立つでしょう。残りの形質導入細胞を複製として培養し、R1およびR2を、それぞれライブラリーの500X表現を提供する細胞数で維持する。重複の1つを薬物、10マイクロモルのシタラビンで治療し、もう1つを薬物治療なしで治療する。フラスコの培地を薬物の有無にかかわらず、72時間ごとに交換する。9日間の累積薬物曝露について培地交換を3回繰り返す。薬物治療の9日目以降、トリパンブルー排除法により細胞の生存率を確認する。残りの生細胞をスピンダウンし、滅菌PBSで洗浄し、室温で5分間280gで遠心分離する。上清を捨て、DNA抽出のためにペレットをマイナス80で保存する。PCRによる集積shRNAの増幅。形質導入されたベースライン細胞からDNAを抽出し、処理細胞および未処理細胞、続いて蛍光光度計を用いて濃度を確認し、図示のように必要なDNA量を計算し、サンプルを第1ラウンドのPCRに供した。PCR反応混合物をサーマルサイクラー条件とともに表2に示します。チューブあたり850ナノグラムのDNAを含む複数の反応をセットアップし、合計43の反応を行います。PCR産物をプールし、精製する。製品を50マイクロリットルの緩衝液で溶かして定量し、最後にマイナス20で保存します。第2ラウンドPCRの場合、リバースインデックスプライマーを使用し、試薬を表4に表します。ネガティブコントロールとともに、各サンプルの総反応容量50マイクロリットルで500ナノグラムの一次PCR産物を用いて4つの反応をセットアップする。2%TBEアガロースゲルを用いて電気泳動のために製品全体をロードし、1KB分子ラダーでバンドサイズを確認します。ゲル文書化システム上のPCR産物を視覚化します。特定のバンドを切除し、ゲル精製キットを用いて精製する。キットを用いた精製の計算を表3に提供する。各溶離液のおおよその濃度をマイクロリットルあたり約80〜90ナノグラムの溶出緩衝液の最終容量30マイクロリットルで溶出する。次世代シーケンシングとデータ分析。ゲル精製産物は、枯渇したshRNAニーズに対する読み取りカウントを得るために、次世代シーケンシングに供されます。アダプター・シーケンスをトリミングし、フィルターで取り込んだ読み取り値を参照シーケンスにアラインメントし、SAMtools を使用してファイルをロードしてアラインメント・サマリーを取得します。トリミングされた fastQ ファイルを CRISPRCloud2 にロードし、指示に従って分析を実行します。CRISPRCloud2 に用意されているリンクをクリックします。画面タイプを「サバイバル画面」画面および「ドロップアウト画面」として選択します。グループ数を設定し、各グループの名前を入力します。参照ライブラリを FASTA ファイル形式でアップロードします。アップロードされたデータは処理され、結果は指定されたURLで利用できます。代表的なデータ。この図は、シタラビン濃度の増加で処理されたMV4−11親および耐性細胞、0.1マイクロモル〜1,000マイクロモル、およびMTTアッセイによる生存率評価を示す。この図は、ヒトEF−1アルファ、ヒトCMV、およびSFFVプロモーターについて72時間の終わりにフローサイトメトリーによって定量されたGFPの代表的なフロープロットを示す。ヒトCMVは不均一なピークを示し、ヒトEF-1アルファおよびSFFVは単一の均質なピークを示す。この図は、MV4−11における3つの異なるプロモーター効率についての棒グラフを示す。SFFV駆動GFPは、長期培養においてGFPのサイレンシングを示した。hEF−1α駆動GFP細胞は、これらの細胞の選別後に持続的な発現を示した。左パネルは、蛍光顕微鏡下での48時間の終わりに293TでトランスフェクトされたプールされたshRNAライブラリーのトランスフェクション効率を示す。右側のパネルは、さまざまなウイルス体積(2、4、および8マイクロリットル)を有する293T細胞におけるプールウイルスの形質導入効率を示す。この図は、30%の形質導入効率を達成するために1、1.5、2、2.5マイクロリットルのような様々な体積のウイルスを有するMV4-11耐性細胞株における形質導入効率を表す。この図は、高純度かつ低収率の選別設定で30%の形質導入効率を有するGFP陽性細胞の選別を示す。図は、9日間の長期シタラビン曝露に対するGFP陽性選別細胞に対する薬物処理の概略図を示し、続いて生存率をチェックし、DNAについて細胞を採取する。この図は、PCRの第1および第2ラウンドで用いたプライマーの結合領域を示す。この図は、第1ラウンドPCRの終了時のPCR産物のバンドサイズ、397塩基対、および第2ラウンドPCR産物399塩基対を、ゲル溶出、精製し、NGSについて与えたものである。この図は、AMLにおけるシタラビン耐性を媒介する可能性のあるエピジェネティック因子を標的とする濃縮または枯渇shRNAの表現を示す。結論。このプロトコルは、必須遺伝子と非必須遺伝子の両方を体系的に調査するための標的ノックダウンスクリーニングの重要性を強調し、このアプローチを機能的プラットフォームとして使用し、薬剤耐性の原因となる標的の同定を可能にすることを実証する。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

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