Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

이 연구는 SRV에 BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013 생명 공학부 보조금에 의해 부분적으로 자금을 지원합니다. 인도 BT/COE/34/SP13432/2015 및 인도 과학기술부: EMR/2017/003880 ~ P.B. RVS 및 P.B.는 Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 및 IA/S/15/1/501842에서 각각 지원합니다. S.D.는 CSIR-UGC 펠로우십의 지원을 받으며, S.I.는 ICMR 선임 연구 펠로우십의 지원을 받습니다. Abhirup Bagchi, Sandya Rani 및 CSCR Flow Cytometry Core Facility 직원에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 또한 고처리량 시퀀싱 및 데이터 분석을 도와준 MedGenome Inc.에게도 감사드립니다.

IBSC(Institutional Biosafety Committee) 지침을 따르고 렌티바이러스(BSL-2)를 처리하기 위해 적절한 시설을 사용하십시오. 직원은 렌티 바이러스의 취급 및 처분에 대해 적절하게 훈련되어야합니다. 이 프로토콜은 Vellore의 Christian Medical College의 생물 안전 지침을 따릅니다.
1. shRNAs의 지속적이고 장기간의 발현을 얻기 위한 가장 강력한 프로모터의 선택
?...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA 간섭 (RNAi)은 siRNA 및 shRNA 스크리닝을 포함하는 기능적 유전체학 연구에 광범위하게 사용됩니다. shRNA의 이점은 이들이 플라스미드 벡터에 혼입되어 게놈 DNA에 통합될 수 있고, 따라서 표적 mRNA의 안정한 발현 및 따라서 보다 연장된 녹다운을 초래할 수 있다는 것이다. 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝은 기존의 어레이 스크린(siRNA)에 비해 견고하고 비용 효율적이다. 게놈 전체 스크린에서 특정 ...

급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료 옵션은 시타라빈 (AraC)과 안트라 사이클린이 질병 치료의 초석으로 삼아 거의 지난 XNUMX 년 동안 변하지 않았습니다. AML 요법의 성공에 대한 도전 중 하나는 백혈병 줄기 세포가 화학 요법에 저항하여 질병 재발 1,2로 이어지는 것입니다. 후성유전학적 조절은 암 발병기전과 약물 내성에 중요한 역할을 하며, 몇 가지 후성유전학적 요인들이 유망한 치료 표적으로 부상했다 3,4,5. 후성유전학적 조절 기전은 화학요법 약물에 대한 지속적인 노출하에서 증식 및 생존에 영향을 미친다. 비 혈액 학적 악성 종양에 대한 연구에 따르면 약물 효과를 극복 한 세포의 작은 부분이 다양한 후성 유전학 변형을 거쳐 그 세포의 생존 6,7을 초래한다고보고했습니다. 그러나, AML에서 시타라빈에 대한 후천적 내성을 매개하는 후성유전학적 요인의 역할은 탐구되지 않았다.
고처리량 스크리닝은 시간이 지남에 따라 전 세계적으로 중요해진 약물 발견에 대한 접근 방식이며 세포 메커니즘, 경로 프로파일 링 및 분자 수준 8,9에서 잠재적 인 표적을 식별하기위한 다양한 측면에서 표준 방법이되었습니다. 합성 치사율 개념은 두 유전자 사이의 상호작용을 포함하며, 여기서 두 유전자 중 어느 하나의 교란만이 실행 가능하지만 두 유전자의 섭동은 동시에 생존력의 상실을 초래한다(10). 암 치료에서 합성 치사율을 이용하는 것은 강력한 합성 치명적인 유전 적 상호 작용을 식별하고 기계적으로 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다11. 우리는 AML에서 획득 된 시타라빈 내성을 담당하는 후성 유전 적 요인을 확인하기 위해 합성 치사율로 고 처리량 shRNA 스크리닝의 조합 적 접근법을 채택했습니다.
혼합 혈통 백혈병 유전자(MLL 또는 KMT2A)의 염색체 전좌에 의해 구동되는 급성 백혈병은 환자에서 불량한 생존과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. MLL 유전자 재배열의 결과 키메라 산물, 즉 MLL 융합 단백질 (MLL-FPs)은 조혈 줄기 / 전구 세포 (HSPC)를 여러 후성 유전 적 요인의 개입으로 백혈병 폭발로 변형시킬 수 있습니다. 이러한 후성 유전 적 조절자는 백혈병 프로그램의 유지를 지시하는 복잡한 네트워크를 구성하므로 잠재적 인 치료 목표를 형성 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 MV4-11 세포주 (FLT3-ITD 돌연변이를 가진 MLL 융합 유전자 MLL-AF4를 보유하고; MV4-11 P로 불림)를 사용하여 MV4-11 AraC R로 불리는 획득된 시타라빈 내성 세포주를 개발하였다. 세포주는 약물 휴일로 알려진 약물 치료로부터의 간헐적 인 회복과 함께 시타라빈의 증가 된 복용량에 노출되었다. 반-최대 억제 농도(IC50)를 시험관내 세포독성 검정에 의해 평가하였다.
우리는 pZIP 렌티바이러스 백본을 갖는 hEF1a 프로모터에 의해 구동되는 풀링된 후성유전학적 shRNA 라이브러리(표 문헌 참조)를 사용하였다. 이 라이브러리는 407개의 후성유전학적 인자를 표적화하는 shRNA를 포함한다. 각 인자에는 5-24개의 shRNA가 있으며, 5개의 비표적화 대조군 shRNA를 포함하여 총 5,485개의 shRNA가 있다. 변형된 "UltrmiR" miR-30 스캐폴드는 효율적인 일차 shRNA 생물발생 및발현 12,13을 위해 최적화되었다.
이 실험의 개요는 그림 1A에 설명되어 있습니다. 현재의 프로토콜은 현탁 세포주인 MV4-11 AraC R 세포주(도 1B)에서 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리를 이용한 RNAi 스크리닝에 초점을 맞추고 있다. 이 프로토콜은 자신이 선택한 임의의 약물 내성 세포주에서 임의의 표적화된 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 형질도입 프로토콜은 부착성 세포에 대해 상이할 것이라는 점에 유의해야 한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

후천성 화학저항성의 임상적으로 관련된 동인 메커니즘을 이해하는 것은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 저항성을 우회하고 생존을 향상시키는 방법을 밝히는 데 매우 중요합니다. 화학 요법에서 살아남은 백혈병 세포의 작은 부분은 화학 요법 모욕을 용인 할 수있는 후성 유전 학적 상태를 가지고 있습니다. 화학 요법에 대한 추가 노출은 이러한 약물 지속성 세포가 고정 된 후성 유전 적 상태에 도달 할 수있게하여 유전자 발현을 변경시켜 이러한 약물 내성 집단의 증식을 초래하고 결국 재발 또는 불응성 질환을 초래합니다. 따라서 약물 내성 백혈병 세포의 생존을 필요로하는 후성 유전 적 조절을 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 획득된 시타라빈 내성 AML 세포주에서 스크리닝된 풀링된 shRNA 라이브러리를 사용하여 뉴클레오시드 유사체 시타라빈(AraC)에 대한 내성을 매개하는 후성유전학적 조절제를 확인하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. 이 라이브러리는 407개의 인간 후성유전학적 인자를 표적으로 하는 5,485개의 shRNA 구축물로 구성되며, 이는 고처리량 후성유전학적 인자 스크리닝을 가능하게 한다.

전체 스크리닝 워크플로우는 도 1A에 묘사되어 있다. MV4-11의 시험관내 세포독성은 AraC R(48h)이 MV4-11 AraCR에서 시타라빈에 대한 IC50이 MV4-11P보다 높은 것으로 나타났다(도 1B). 이 세포주는 시타라빈 내성을 담당하는 후성유전학적 인자를 스크리닝하기 위한 모델로서 연구에 사용되었다.
도 2A는</stron...

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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

다음 비디오의 전반적인 목표는 음성 선택 스크리닝을 수행하기 위해 풀링된 shRNA 후성유전학적 라이브러리의 사용을 입증하는 것이다. 이 스크리닝은 시퀀싱을 통해 특정 후성유전학적 표적을 식별할 수 있게 한다. 이 절차는 AML에서 획득된 시타라빈 내성을 매개하는 역할을 하는 후성유전학적 인자를 동정하는 데 도움이 될 수 있으며, 그 단계는 다음과 같다.shRNAs의 지속적이고 장기간의 발현을 얻기 위한 가장 강력한 프로모터의 선택. 현재의 프로토콜은 시타라빈 내성 MV4-11 세포주에서 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리를 이용한 RNAi 스크리닝에 초점을 맞추고 있다. 이러한 목적을 위해 사용되는 프로모터는 인간 EF-1 알파, 인간 CMV, 및 SFFV, 녹색 형광 단백질을 발현하는 프로모터이다.트리판 블루 제외 방법을 사용하여 셀 수를 가져옵니다. 세포를 mL 폴리브렌 당 8 마이크로그램을 함유하는 10%RPMI 배지에 현탁시킨다. 6-웰 플레이트의 웰 당 배지 1.5ml에 1백만 개의 세포를 삼중으로 시드한다.다양한 양의 농축 렌티 바이러스를 추가하십시오. 예를 들어, 렌티바이러스는 예를 들어, 각 웰에 대한 렌티바이러스의 역가에 따라 10, 20, 및 40 마이크로리터이다. 접시를 부드럽게 소용돌이 치며 내용물을 섞는다.섭씨 37도에서 920g에서 90분 동안 원심분리하여 스파이싱을 수행합니다. 플레이트를 즉시 이산화탄소 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 48 시간의 끝에서 GFP를 관찰하고 72 시간의 끝에서 동일하게 정량화한다.다음으로, 흐름도에 묘사된 바와 같은 단계를 따라 배양 전반에 걸쳐 일관된 GFP 발현을 나타내는 프로모터를 선택한다. 풀링된 렌티바이러스 인간 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리의 제조. 각 플레이트에 10%DMFM 배지 8ml를 갖는 세 개의 10센티미터 세포 배양 접시에서 양호한 증식률을 갖는 낮은 계대 수로 293T 세포를 배양한다.세포가 60 % 합류율에 도달하면 완전히 신선한 배지로 교체하십시오. 무혈청 배지, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 PAX2, 엔벨로프 플라스미드 pMD2를 함유하는 약술된 바와 같이 형질감염 믹스를 준비한다. G, 풀링된 라이브러리 플라스미드, 및 최종적으로 형질감염 시약.혼합물을 탭하여 잘 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 형질감염 혼합물을 293T 세포에 첨가하고, 플레이트를 소용돌이치면서 부드럽게 혼합한다. 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 인큐베이션한다.24 시간 후에 배지를 변경하십시오. 48시간 후, 293T 세포 내로의 높은 형질감염 효율을 보장하기 위해 형광 현미경으로 GFP 발현을 확인하였다. 48, 60 및 72시간 후에 바이러스 상층액을 수집하여 4도에 보관하고, 바이러스를 채취한 후 각 시점마다 신선한 배지 8ml를 첨가한다.풀링된 바이러스를 0.4미크론 필터로 필터링합니다. 바이러스의 높은 역가를 얻기 위해, 초원심분리에 의해 풀링된 바이러스를 농축시킨다. 여과된 바이러스 상청액을 70개의 Ti 튜브로 옮기고, 18, 000 g에서 2시간 동안 원심분리한다.4도에서 미리 냉각 된 로터와 원심 분리기를 사용하십시오. 원심 분리기에서 튜브를 조심스럽게 꺼내어 상층액을 완전히 제거하십시오. 펠렛을 마이크로피펫을 사용하여 FBS 및 항생제 없이 400 마이크로리터의 DMEM에 부드럽게 재현탁시키고, 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.바이러스를 분취하여 영하 80도에서 동결하십시오. 표시된 바와 같이 바이러스의 농도를 계산하십시오. 렌티바이러스의 형질도입 효율의 추정.293T 세포를 상이한 부피, 2, 4 및 8의 농축된 바이러스로 형질도입하여, 렌티바이러스의 성공적인 제조를 확인한다. 바이러스를 100X로 농축하여 표적 세포주에서 적정 실험을 수행하였다. 시드 1백만 표적 세포주를 6웰 플레이트의 한 웰에 폴리브렌 ml 당 8 마이크로그램을 함유하는 10%RPMI 배지 중 1.5 ml에 시딩한다.네 가지 볼륨, 1, 1.5, 2, 2.5 마이크로 리터의 100X 바이러스를 추가하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 90분 동안 920 g에서 원심분리하여 스파이싱을 수행한다. 72시간 후, 유세포 분석기로 GFP 양성 세포의 백분율을 측정하였다.바이러스의 부피를 결정하여 30 % 형질 도입 효율을 얻으십시오. 이러한 낮은 형질도입 효율은 세포당 단일 shRNA 통합을 보장하기 위한 것이다. 약물 내성 세포주에서 풀링된 후성유전학적 shRNA 라이브러리의 형질도입.바이러스 적분의 수를 기준으로 아래와 같이 실험을 위해 취해질 세포의 수를 계산한다. 11 백만 세포를 10 % RPMI 배지 16 ML에 재현탁하십시오. ml 당 여덟 마이크로 그램의 폴리 브렌을 넣고 잘 섞은 다음 필요한 양의 바이러스를 추가하여 이전에 계산 된 30 % 형질 도입 효율을 얻으십시오.모든 세포를 웰 당 1.5ml 당 1 백만 세포의 밀도로 여섯 웰 플레이트에 시드하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 920 g에서 90분 동안 원심분리한다. 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.24시간 후, 배지를 변경하고 형질도입된 세포를 T-75 플라스크로 옮긴다. 48시간 후, GFP를 형광 현미경으로 확인하여 성공적인 형질도입을 보장한다. 72시간 후, GFP를 유세포 분석기로 정량한다.GFP 양성 세포의 농축. 형질도입된 세포를 5 내지 7일 동안 ml당 0.5백만의 밀도로 배양하여 확장하고, 고순도 및 저수율로 설정된 유동 분류 설정으로 유동 분류를 수행한다. 분류된 세포를 10%RPMI 배지에서 배양한다.72시간 후, 95% 이상의 분류 효율을 보장하기 위해 GFP 양성 세포의 백분율에 대한 사후 분류 추정을 수행한다. 약물 내성을 매개하는 후성유전학적 요인을 확인하기 위한 드롭아웃 스크리닝. shRNA 라이브러리-형질도입된 세포를 10%RPMI에서 최대 5일 동안 배양한다.복제된 1천만 개의 세포를 원심분리한다. 상층액을 버리고 펠렛을 영하 80도에 보관하십시오. 이들 샘플은 후성유전학적 shRNA 라이브러리에 대한 기준선 참조로서 기능할 것이다.나머지 형질도입된 세포를 중복, R1 및 R2로서 배양하고, 각각 라이브러리의 500X 표현을 제공하는 세포 카운트로 유지한다. 중복 된 것 중 하나를 약물, 10 마이크로 몰 시타라빈으로 치료하고 다른 하나는 약물 치료없이 치료하십시오. 플라스크의 배지를 약물과 함께 또는 약물없이 72 시간마다 변경하십시오.9 일의 누적 약물 노출에 대해 배지 변화를 세 번 반복하십시오. 약물 치료 9일째 후, 트리판 블루 배제 방법으로 세포의 생존율을 확인하였다. 나머지 생존 가능한 세포를 스핀다운하고, 멸균 PBS로 세척하고, 실온에서 5분 동안 280 g에서 원심분리한다.상청액을 버리고 DNA 추출을 위해 펠렛을 영하 80으로 보관하십시오. PCR에 의한 통합된 shRNA의 증폭. 형질도입된 기준선 세포, 처리 및 처리되지 않은 세포로부터 DNA를 추출하고, 이어서 형광계를 사용하여 농도를 확인하고, 나타낸 바와 같이 필요한 DNA의 양을 계산하고, 샘플을 PCR의 첫 번째 라운드에 피검한다.PCR 반응 혼합물은 열 사이클러 조건을 갖는 표 2에 묘사되어 있다. 튜브 당 850 나노 그램 DNA를 포함하는 여러 반응을 설정하여 총 43 개의 반응을 일으 킵니다. PCR 산물을 풀링하고 정제하십시오.제품을 50 마이크로 리터 버퍼로 제거하고 정량화하고 마지막으로 마이너스 20으로 보관하십시오. 두 번째 라운드 PCR의 경우, 역방향 인덱스 프라이머를 사용하고 시약은 표 4에 표로 정리되어 있다. 음성 대조군과 함께 각 샘플에 대해 50 마이크로리터의 총 반응 부피에서 일차 PCR 산물 500 나노그램으로 네 개의 반응을 설정한다.2%TBE 아가로스 겔을 사용하여 전기영동을 위해 전체 생성물을 로딩하고 하나의 KB 분자 사다리로 밴드 크기를 확인하십시오. 겔 문서화 시스템에서 PCR 산물을 시각화합니다. 특정 밴드를 절제하고 겔 정제 키트를 사용하여 정제하십시오.키트를 사용한 정제에 대한 계산은 표 3에 제공된다. 용출 완충액의 30 마이크로리터의 최종 부피에서 각 용리액의 대략적인 농도를 마이크로리터 당 약 80 내지 90 나노그램으로 희석한다. 차세대 시퀀싱 및 데이터 분석.겔-정제된 생성물은 고갈된 shRNA 요구에 대한 판독 카운트를 얻기 위해 차세대 시퀀싱을 실시한다. 어댑터 시퀀스를 트리밍하고, 필터링된 읽기를 참조 시퀀스에 정렬하고, SAMtools를 사용하여 파일을 로드하여 정렬 요약을 가져옵니다. 트리밍된 fastQ 파일을 CRISPRCloud2에 로드하고 지침에 따라 분석을 수행합니다.CRISPRCloud2에 제공된 링크를 클릭합니다. 화면 유형을 생존 및 드롭아웃 화면으로 선택합니다. 그룹 수를 설정하고 각 그룹의 이름을 입력합니다.참조 라이브러리를 FASTA 파일 형식으로 업로드합니다. 업로드된 데이터가 처리되고 지정된 URL에서 결과를 사용할 수 있습니다. 대표 데이터.이 그림은 MV4-11 시타라빈 농도 증가, 0.1 마이크로몰 내지 1, 000 마이크로몰로 처리된 MV4-11 모 및 내성 세포 및 MTT 분석에 의한 생존력 평가를 보여준다. 이 도면은 인간 EF-1 알파, 인간 CMV, 및 SFFV 프로모터에 대한 72시간의 말기에 유세포 분석기에 의해 정량화된 GFP의 대표적인 유동 플롯을 보여준다. 인간 CMV는 이질적인 피크를 보여주고, 인간 EF-1 알파와 SFFV는 단일 균질 피크를 나타낸다.이 그림은 MV4-11에서 세 가지 다른 프로모터 효율에 대한 막대 그래프를 보여줍니다. SFFV 구동 GFP는 장기간의 배양에서 GFP의 침묵을 나타냈다. hEF-1 알파-구동 GFP 세포는 이들 세포의 분류 후 지속적인 발현을 나타냈다.왼쪽 패널은 형광 현미경 하에서 48시간의 끝에서 293T로 형질감염된 풀링된 shRNA 라이브러리의 형질감염 효율을 보여준다. 오른쪽 패널은 다양한 바이러스 부피, 2, 4 및 8 마이크로리터를 갖는 293T 세포에서 풀 바이러스의 형질도입 효율을 보여준다. 이 수치는 30% 형질도입 효율을 달성하기 위해 1, 1.5, 2, 2.5 마이크로리터와 같이 다양한 부피의 바이러스를 갖는 MV4-11 내성 세포주에서 형질도입 효율을 나타낸다.이 그림은 고순도 및 낮은 수율 분류 설정으로 30% 형질도입 효율을 갖는 GFP 양성 세포의 분류를 보여준다. 도면은 9일의 장기간의 시타라빈 노출에 대한 GFP 양성 분류된 세포에 대한 약물 처리의 개략적인 예시를 보여주고, 이어서 생존력을 확인하고 DNA에 대한 세포를 수집한다. 이 도면은 PCR의 첫 번째 및 두 번째 라운드에서 사용된 프라이머의 결합 영역을 보여준다.이 도면은 NGS에 대해 겔 용출, 정제 및 주어진 첫 번째 라운드 PCR, 397 염기쌍, 및 두 번째 라운드 PCR 산물 399 염기쌍의 끝에서 PCR 산물의 밴드 크기를 예시한다. 이 도면은 AML에서 시타라빈 내성을 매개할 수 있는 후성유전학적 인자를 표적으로 하는 농축되거나 고갈된 shRNA의 표현을 예시한다. 결론. 이 프로토콜은 필수 유전자와 비필수 유전자를 체계적으로 조사하기 위한 표적 녹다운 스크리닝의 중요성을 강조하고, 이 접근법을 기능적 플랫폼으로 사용하여 약물 내성을 담당하는 표적을 식별할 수 있음을 보여줍니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

연구

암 연구학

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...