Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Denne studien er delvis finansiert av et Institutt for bioteknologistipend BT/PR8742/AGR/36/773/2013 til SRV; og Institutt for bioteknologi India BT/COE/34/SP13432/2015 og Institutt for vitenskap og teknologi, India: EMR/2017/003880 til P.B. RVS og P.B. støttes av Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 og IA/S/15/1/501842. S.D. støttes av CSIR-UGC-stipendet, og S.I. støttes av et ICMR seniorstipendiat. Vi takker Abhirup Bagchi, Sandya Rani og CSCR Flow Cytometry Core Facility ansatte for deres hjelp. Vi takker også MedGenome Inc. for å ha hjulpet til med sekvensering og dataanalyse med høy gjennomstrømning.

Følg retningslinjene fra Institutional Biosafety Committee (IBSC) og bruk riktig anlegg til å håndtere lentivirus (BSL-2). Personell bør være tilstrekkelig opplært i håndtering og avhending av lentivirus. Denne protokollen følger biosikkerhetsretningslinjene til Christian Medical College, Vellore.
1. Valg av den mest potente promotoren for å oppnå vedvarende og langvarig uttrykk for shRNAene
MERK: Det er viktig å utføre et transduksjonseks...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA-interferens (RNAi) brukes mye til funksjonelle genomikkstudier, som inkluderer siRNA- og shRNA-screening. Fordelen med shRNA er at de kan innlemmes i plasmidvektorer og integreres i genomisk DNA, noe som resulterer i stabilt uttrykk og dermed mer langvarig nedslag av målet mRNA. En samlet shRNA-bibliotekscreening er robust og kostnadseffektiv sammenlignet med de konvensjonelle arrayed-skjermene (siRNA). Å identifisere nødvendigheten av en bestemt klasse proteiner i en genom-bred skjerm kan være tungvint. Målrett...

Terapeutiske alternativer i akutt myeloid leukemi (AML) har vært uendret i nesten de siste fem tiårene, med cytarabin (AraC) og antracykliner som hjørnestein for behandling av sykdommen. En av utfordringene med suksessen med AML-terapi er motstanden av leukemiske stamceller mot kjemoterapi, noe som fører til tilbakefall av sykdommer 1,2. Epigenetisk regulering spiller en viktig rolle i kreftpatogenese og legemiddelresistens, og flere epigenetiske faktorer har dukket opp som lovende terapeutiske mål 3,4,5. Epigenetiske regulatoriske mekanismer påvirker spredning og overlevelse under kontinuerlig eksponering for kjemoterapeutiske legemidler. Studier på ikke-hematologiske maligniteter har rapportert at en liten brøkdel av cellene som overvinner legemiddeleffekten gjennomgår ulike epigenetiske modifikasjoner, noe som resulterer i disse cellenes overlevelse 6,7. Imidlertid har rollen som epigenetiske faktorer i mediering oppnådd motstand mot cytarabin i AML ikke blitt utforsket.
Screening med høy gjennomstrømning er en tilnærming til narkotikaoppdagelse som har fått global betydning over tid og har blitt en standardmetode i ulike aspekter for å identifisere potensielle mål i cellulære mekanismer, for veiprofilering og på molekylært nivå 8,9. Det syntetiske dødelighetskonseptet innebærer samspillet mellom to gener der perturbasjonen av et av genene alene er levedyktig, men av begge genene resulterer samtidig i tap av levedyktighet10. Utnyttelse av syntetisk dødelighet i kreftbehandling kan bidra til å identifisere og mekanistisk karakterisere robuste syntetiske dødelige genetiske interaksjoner11. Vi har tatt i bruk en kombinatorisk tilnærming til shRNA-screening med høy gjennomstrømning med syntetisk dødelighet for å identifisere de epigenetiske faktorene som er ansvarlige for ervervet cytarabinresistens i AML.
Akutte leukemier drevet av kromosomal translokasjon av det blandede slekts leukemigenet (MLL eller KMT2A) er kjent for å være forbundet med dårlig overlevelse hos pasienter. De resulterende chimeriske produktene av MLL-genomorganiseringer, det vil si MLL-fusjonsproteiner (MLL-FPs), kan forvandle hematopoietiske stamceller / stamceller (HSPCer) til leukemiske eksplosjoner med involvering av flere epigenetiske faktorer. Disse epigenetiske regulatorene utgjør et komplisert nettverk som dikterer vedlikehold av leukemiprogrammet og derfor kan danne potensielle terapeutiske mål. I denne sammenhengen brukte vi MV4-11-cellelinjen (som huser MLL-fusjonsgenet MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutasjonen; betegnet som MV4-11 P) for å utvikle den oppkjøpte cytarabineresistente cellelinjen, betegnet som MV4-11 AraC R. Cellelinjen ble utsatt for økende doser cytarabin med periodisk utvinning fra medikamentbehandlingen, kjent som en narkotikaferie. Den halvmaksimale hemmende konsentrasjonen (IC50) ble vurdert ved in vitro cytotoksisitetsanalyse.
Vi brukte det samlede epigenetiske shRNA-biblioteket (se Materialtabell) drevet av hEF1a-promotoren med en pZIP lentiviral ryggrad. Dette biblioteket består av shRNAer rettet mot 407 epigenetiske faktorer. Hver faktor har 5-24 shRNAer, med totalt 5485 shRNAer, inkludert fem ikke-målrettede kontroll shRNAer. Det modifiserte "UltrmiR" miR-30 stillaset er optimalisert for effektiv primær shRNA biogenese og uttrykk12,13.
Omrisset av dette eksperimentet er illustrert i figur 1A. Den nåværende protokollen fokuserer på RNAi-screening ved hjelp av det epigenetiske faktor shRNA-biblioteket i cellelinjen MV4-11 AraC R (figur 1B), en fjæringscellelinje. Denne protokollen kan brukes til å screene ethvert målrettet bibliotek i en hvilken som helst stoffresistent cellelinje etter eget valg. Det skal bemerkes at transduksjonsprotokollen vil være forskjellig for tilhengerceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Å forstå klinisk relevante førermekanismer for ervervet kjemoresistens er avgjørende for å belyse måter å omgå resistens og forbedre overlevelsen hos pasienter med akutt myeloid leukemi (AML). En liten brøkdel av leukemiske celler som overlever kjemoterapi har en klar epigenetisk tilstand for å tolerere kjemoterapeutisk fornærmelse. Ytterligere eksponering for kjemoterapi gjør at disse stoffets utholdenhetsceller oppnår en fast epigenetisk tilstand, noe som fører til endret genuttrykk, noe som resulterer i spredning av disse legemiddelresistente populasjonene og til slutt tilbakefall eller refraktær sykdom. Derfor er det viktig å identifisere epigenetiske moduler som nødvendiggjør overlevelsen av legemiddelresistente leukemiske celler. Vi beskriver en protokoll for å identifisere epigenetiske modulatorer som formidler motstand mot nukleoside analog cytarabin (AraC) ved hjelp av samlet shRNA-bibliotekscreening i en ervervet cytarabinresistent AML-cellelinje. Biblioteket består av 5485 shRNA-konstruksjoner rettet mot 407 humane epigenetiske faktorer, noe som muliggjør epigenetisk faktorscreening med høy gjennomstrømning.

Den totale screeningarbeidsflyten er avbildet i figur 1A. In vitro cytotoksisitet av MV4-11 AraC R (48 h) avslørte at IC50 til cytarabin i MV4-11 AraC R var høyere enn MV4-11 P (figur 1B). Denne cellelinjen ble brukt i studien som modell for screening av de epigenetiske faktorene som er ansvarlige for cytarabinresistens.
Figur 2A viser de lineariserte pZIP-vektorkartene med tre...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

RNAi-screening (High-throughput RNA interference) ved hjelp av et basseng med lentivirale shRNAer kan være et verktøy for å oppdage terapeutisk relevante syntetiske dødelige mål i maligniteter. Vi tilbyr en samlet shRNA screening tilnærming for å undersøke epigenetiske effektorer i akutt myeloid leukemi (AML).

Samlet shRNA-bibliotekscreening for å identifisere faktorer som modulerer en legemiddelresistensfenotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Det overordnede målet med følgende video er å demonstrere bruken av det samlede shRNA epigenetiske biblioteket for å gjennomføre en negativ utvelgelsesscreening. Denne screeningen gjør det mulig å identifisere spesifikke epigenetiske mål gjennom sekvensering. Denne prosedyren kan bidra til å identifisere de epigenetiske faktorene som er ansvarlige for å formidle ervervet cytarabinmotstand i AML Trinnene er som følger.Valg av den mest potente promotoren for å oppnå vedvarende og langvarig uttrykk for shRNAene. Den nåværende protokollen fokuserer på RNAi-screening ved hjelp av epigenetisk faktor shRNA-bibliotek i cytarabinresistent MV4-11 cellelinje. Arrangørene som brukes til dette formålet er humant EF-1 alfa, menneskelig CMV og SFFV, promotører som uttrykker grønt fluorescensprotein.Ta celleantallet ved hjelp av trypan blue exclusion -metoden. Suspender cellene i 10% RPMI medium som inneholder 8 mikrogram per ml polybren. Frø 1 million celler i 1,5 ml medium per brønn av en seks-brønns plate i triplikater.Tilsett forskjellige mengder konsentrerte lentivirus. For eksempel lentivirus, for eksempel 10, 20 og 40 mikroliter, avhengig av titeret av lentivirusene til hver brønn. Virvle platen forsiktig for å blande innholdet.Utfør spinfeksjon ved sentrifugering ved 920 g ved 37 grader celsius i 90 minutter. Inkuber straks platene i en karbondioksidinkubator. Vær oppmerksom på GFP på slutten av 48 timer og kvantifisere det samme på slutten av 72 timer.Følg deretter trinnene som er avbildet i flytskjemaet for å velge promotoren som viser konsekvent GFP-uttrykk gjennom hele kulturen. Forberedelse av det samlede lentivirale humane epigenetiske faktor shRNA-biblioteket. Kultur 293T celler med lavt passasjenummer med god spredningshastighet i tre 10-centimeter cellekulturretter med 8 ml 10% DMFM medium i hver tallerken.Når cellene oppnår 60% samløp, erstatt med friskt medium helt. Forbered transfeksjonsblandingen som skissert som inneholder serumfritt medium, lentiviral emballasje plasmid PAX2, konvolutt plasmid pMD2. G, samlet bibliotek plasmider, og til slutt transfection reagens.Trykk på blandingen for å blande den godt og inkubere ved romtemperatur i 15 minutter. Tilsett transfeksjonsblandingen i 293T-cellene og bland forsiktig ved å virvle platene. Inkuber platene i en karbondioksidinkubator.Bytt medium etter 24 timer. Etter 48 timer, se etter GFP-uttrykk under et fluorescensmikroskop for å sikre høy transfeksjonseffektivitet i 293T-celler. Samle viruset supernatanter etter 48, 60 og 72 timer og lagret dem på 4 grader, og legg til friskt medium, 8ml, på hvert tidspunkt etter å ha samlet viruset.Filtrer de samlede virusene med 0,4 mikron filter. For å få et høyt titer av virus, konsentrer de samlede virusene ved ultracentrifugation. Overfør de filtrerte virus supernatantene til 70 Ti rør, og sentrifuge ved 18.000 g i 2 timer.Bruk forhåndskjølt rotor og sentrifuge ved 4 grader. Ta ut rørene fra sentrifugen forsiktig og fjern supernatanten helt. Resuspend pellet forsiktig i 400 mikroliter DMEM uten FBS og antibiotika ved hjelp av en mikropipette, inkubere på is i 1 time.Aliquot virusene og fryse på minus 80 grader. Beregn konsentrasjonen av viruset som vist. Estimering av transduksjonseffektiviteten til lentivirus.Transduser 293T celler med et konsentrert virus i forskjellige volumer, 2, 4 og 8, for å bekrefte vellykket forberedelse av lentiviruset. Verdi til konsentrert virus til 100X for å utføre et titreringseksperiment i målcellelinjen. Frø 1 million målcellelinje i 1,5 ml 10% RPMI medium som inneholder 8 mikrogram per ml polybren i en brønn av en seks-brønns plate.Legg til fire forskjellige volumer, 1, 1,5, 2, 2,5 mikroliter med 100X virus. Utfør spinfeksjon ved sentrifugering av platen ved 920 g i 90 minutter ved 37 grader celsius. Etter 72 timer måler du prosentandelen av GFP-positive celler ved strømningscytometri.Bestem volumet på virusene for å oppnå 30 % transduksjonseffektivitet. Denne lave transduksjonseffektiviteten er å sikre enkel shRNA-integrasjon per celle. Transduksjon av det samlede epigenetiske shRNA-biblioteket i den legemiddelresistente cellelinjen.Beregn antall celler som skal tas for eksperimentet som nedenfor, basert på antall virale integranter. Resuspend 11 millioner celler i 16 ML av 10% RPMI medium. Tilsett polybrene, åtte mikrogram per ml og bland godt, og legg deretter til det nødvendige volumet av virus for å oppnå 30% transduksjonseffektivitet som beregnet før.Frø alle cellene på en seksbrønnsplate med en tetthet på 1 million celler per 1,5 ml per brønn. Sentrifuger platen i 90 minutter ved 920 g ved 37 grader celsius. Inkuber platen over natten i en karbondioksidinkubator.Etter 24 timer, bytt medium og overfør de transinduserte cellene til en T-75 kolbe. Etter 48 timer, sjekk GFP under et fluorescensmikroskop for å sikre vellykket transduksjon. Etter 72 timer kvantetter du GFP ved strømningscytometri.Berikelse av GFP positive celler. Utvid de transinduserte cellene ved å dyrke dem med en tetthet på 0,5 millioner per ml i 5 til 7 dager, og utfør strømningssortering med strømningssorteringsinnstillingen angitt som høy renhet og lavt utbytte. Kultur de sorterte cellene i et 10% RPMI-medium.Etter 72 timer utfører du ettersorteringsestimeringen av prosentandelen av GFP-positive celler for å sikre mer enn 95 % sorteringseffektivitet. Frafallsscreening for å identifisere epigenetiske faktorer som formidler narkotikaresistens. Kultur shRNA bibliotek-transduced celler i 10%RPMI i opptil 5 dager.Sentrifuger 10 millioner celler i duplikater. Kast supernatanten og oppbevar pelletsene på minus 80 grader. Disse eksemplene vil fungere som basisreferanse for det epigenetiske shRNA-biblioteket.Kultur De gjenværende transinduserte cellene som duplikater, R1 og R2, hver opprettholdt ved et celleantall som gir en 500X representasjon av biblioteket. Behandle en av duplikatene med stoffet, 10 mikromolar cytarabin og den andre uten legemiddelbehandling. Bytt medium for kolber med, og uten stoffet, hver 72 timer.Gjenta middels endring tre ganger for en kumulativ legemiddeleksponering på 9 dager. Etter 9. dag med medikamentell behandling, sjekk levedyktigheten til cellene ved trypan blå eksklusjonsmetoden. Snurr ned de resterende levedyktige cellene, vask med steril PBS og sentrifuge ved 280 g i 5 minutter ved romtemperatur.Kast supernatanten og oppbevar pelletsene på minus 80 for DNA-ekstraksjon. Forsterkning av de integrerte shRNAene av PCR. Trekk ut DNA fra de transinduserte basislinjecellene, behandlede og ubehandlede celler, etterfulgt av å sjekke konsentrasjonen ved hjelp av fluorometer, beregne mengden DNA som kreves som vist og utsette prøvene til første runde av PCR.PCR-reaksjonsblandingen er avbildet i tabell 2 med de termiske syklusforholdene. Sett opp flere reaksjoner som inneholder 850 nanogram DNA per rør for totalt 43 reaksjoner. Samle PCR-produktene og rens dem.Elute produktene i 50 mikroliter buffer og kvantifisere dem, og til slutt, lagre på minus 20. For andre runde PCR, bruk revers indeksprimere og reagensene er tabulert i tabell 4. Sett opp fire reaksjoner med 500 nanogram av det primære PCR-produktet i et totalt reaksjonsvolum på 50 mikroliter for hver prøve sammen med den negative kontrollen.Last hele produktet for elektroforese ved hjelp av 2% TBE agarose gel og bekreft båndstørrelsen med en KB molekyl stige. Visualiser PCR-produktene på geldokumentasjonssystemet. Excise det spesifikke båndet og rense ved hjelp av en gel rensing kit.Beregninger for rensing med settet er gitt i tabell 3. Elute i et sluttvolum på 30 mikroliter elutionbuffer med omtrentlig konsentrasjon av hver eluent rundt 80 til 90 nanogram per mikroliter. Neste generasjons sekvensering og dataanalyse.De gelrensede produktene blir utsatt for neste generasjons sekvensering for å oppnå lesetall for de utarmede shRNA-behovene. Trim adaptersekvensene, juster de filtrerte lesningene etter referansesekvensene, last inn filene ved hjelp av SAMtools for å få justeringssammendrag. Last inn de trimmede fastQ-filene i CRISPRCloud2 og utfør analysen i henhold til instruksjonene.Klikk på lenken som er gitt for CRISPRCloud2. Velg skjermtype som Overlevelses- og frafallsskjermbilder. Angi antall grupper, og skriv inn navnet på hver gruppe.Last opp referansebiblioteket som FASTA-filformat. Data som lastes opp, behandles, og resultatene er tilgjengelige i den angitte nettadressen. Representative data.Denne figuren viser MV4-11 foreldre og resistente celler behandlet med økende cytarabinkonsentrasjon, 0,1 mikromolar til 1000 mikromolar og levedyktighetsvurdering av MTT-analyse. Denne figuren viser representative strømningsplott av GFP kvantifisert av strømningscytometri på slutten av 72 timer for menneskelige EF-1 alfa-, humane CMV- og SFFV-promotører. Human CMV viser vår heterogene topp mens menneskelig EF-1 alfa og SFFV viser en enkelt homogen topp.Denne figuren viser bargrafen for de tre forskjellige promotoreffektivitetene i MV4-11. SFFV-drevet GFP viste silencing av GFP i langvarig kultur. hEF-1 alfadrevne GFP-celler viste vedvarende uttrykk etter sortering av disse cellene.Det venstre panelet viser transfeksjonseffektiviteten til det samlede shRNA-biblioteket som ble transfisert i 293T på slutten av 48 timer under fluorescensmikroskopi. Det høyre panelet viser transduksjonseffektiviteten til bassengviruset i 293T-celler med varierende virusvolum, 2, 4 og 8 mikroliter. Denne figuren representerer transduksjonseffektiviteten i MV4-11-motstandsdyktig cellelinje med varierende mengder virus, som 1, 1,5, 2, 2,5 mikroliter for å oppnå 30% transduksjonseffektivitet.Denne figuren viser sorteringen av GFP-positive celler med 30 % transduksjonseffektivitet med høy renhet og sorteringsinnstilling med lav avkastning. Figuren viser skjematisk illustrasjon av legemiddelbehandling for GFP-positive sorterte celler for en langvarig cytarabineksponering på 9 dager, etterfulgt av å sjekke levedyktigheten og samle cellene for DNA. Denne figuren viser bindingsområdene til primeren som brukes i første og andre runde av PCR.Denne figuren illustrerer båndstørrelsen på PCR-produktet på slutten av første runde PCR, 397 basispar og andre runde PCR-produkt 399 basepar, som ble gel-eluted, renset og gitt for NGS. Denne figuren illustrerer representasjonen av de berikede eller utarmede shRNAene rettet mot de epigenetiske faktorene som kan formidle cytarabinresistens i AML. Konklusjon. Denne protokollen fremhever viktigheten av målrettet nedslagsscreening for å forhøre både essensielle og ikke-essensielle gener systematisk og demonstrerer bruken av denne tilnærmingen som en funksjonell plattform, slik at identifisering av mål som er ansvarlige for narkotikaresistens.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Ved hjelp av RNA-sekvensering for å oppdage Novel Splice Varianter Relatert til Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Kreft Modeller

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utnytte Funksjonell genom Screening for å identifisere potensielt Novel narkotika mål i Cancer Cell spheroid kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow cytometri-baserte narkotika Screening System for identifisering av små molekyler som fremmer differensiering av glioblastom stilk celler

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Leter Driver veier av ervervet motstand mot målrettet terapi: resistente Subclone generasjon og følsomhet gjenoppretting av Gene sammenleggbare

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genomet hele RNAi Screening å identifisere vert faktorer som modulerer kan viruset terapi

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En Chromatin Immunoprecipitation analysen identifisere romanen NFAT2 målet gener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

En arbeidsflyt for dataintegrering for å identifisere stoffkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...