Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Este estudo é financiado em parte por uma bolsa do Departamento de Biotecnologia BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; e Departamento de Biotecnologia Índia BT/COE/34/SP13432/2015 e Departamento de Ciência e Tecnologia, Índia: O EMR/2017/003880 para P.B. RVS e P.B. são apoiados pela Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. A S.D. é apoiada pela bolsa CSIR-UGC, e a S.I. é apoiada por uma bolsa de pesquisa sênior do ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani e a equipe do CSCR Flow Cytometry Core Facility por sua ajuda. Agradecemos também à MedGenome Inc. por ajudar com o sequenciamento de alto rendimento e análise de dados.

Siga as diretrizes do Comitê de Biossegurança Institucional (IBSC) e use a facilidade adequada para lidar com lentivírus (BSL-2). O pessoal deve ser devidamente treinado no manuseio e eliminação do lentivírus. Este protocolo segue as diretrizes de biossegurança da Christian Medical College, Vellore.
1. Seleção do promotor mais potente para obter expressão persistente e prolongada dos shRNAs
NOTA: É essencial realizar um experimento de trans...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

A interferência de RNA (RNAi) é amplamente utilizada para estudos de genômica funcional, que incluem a triagem de siRNA e shRNA. O benefício do shRNA é que eles podem ser incorporados em vetores plasmídeos e integrados ao DNA genômico, resultando em expressão estável e, portanto, mais longo knockdown do mRNA alvo. Uma triagem de biblioteca shRNA agrupada é robusta e econômica em comparação com as telas convencionais (siRNA). Identificar a essencialidade de uma classe específica de proteínas em uma tela de ...

As opções terapêuticas na leucemia mielóide aguda (LMA) permaneceram inalteradas por quase cinco décadas, com a cytarabina (AraC) e as anthracycraclines como a pedra angular para o tratamento da doença. Um dos desafios para o sucesso da terapia LMA é a resistência das células-tronco leucêmicas à quimioterapia, levando à recaída da doença 1,2. A regulação epigenética desempenha um papel vital na patogênese do câncer e na resistência a medicamentos, e vários fatores epigenéticos surgiram como alvos terapêuticos promissores 3,4,5. Os mecanismos regulatórios epigenéticos afetam a proliferação e a sobrevivência sob exposição contínua a drogas quimioterápicas. Estudos em malignidades não hematológicas relataram que uma pequena fração de células que superam o efeito da droga sofrem várias modificações epigenéticas, resultando na sobrevivência dessas células 6,7. No entanto, o papel dos fatores epigenéticos na mediação da resistência adquirida à cytarabina na LMA não foi explorado.
A triagem de alto rendimento é uma abordagem para a descoberta de drogas que ganhou importância global ao longo do tempo e tornou-se um método padrão em diferentes aspectos para identificar potenciais alvos em mecanismos celulares, para perfilamento de caminhos e no nível molecular 8,9. O conceito de letalidade sintética envolve a interação entre dois genes onde a perturbação de qualquer gene sozinho é viável, mas de ambos os genes simultaneamente resulta na perda de viabilidade10. Explorar a letalidade sintética no tratamento do câncer pode ajudar a identificar e caracterizar mecanicamente interações genéticas letais sintéticasrobustas 11. Adotamos uma abordagem combinatória de triagem de shRNA de alto rendimento com letalidade sintética para identificar os fatores epigenéticos responsáveis pela aquisição da resistência à cytarabina na LMA.
Leucemias agudas impulsionadas pela translocação cromossômica do gene de leucemia de linhagem mista (MLL ou KMT2A) são conhecidas por estarem associadas à má sobrevivência em pacientes. Os produtos quiméricos resultantes dos rearranjos genéticos de MLL , ou seja, proteínas de fusão de MLL (MLL-FPs), podem transformar células hematopoiéticas de tronco/progenitor (HSPCs) em explosões leucêmicas com o envolvimento de múltiplos fatores epigenéticos. Esses reguladores epigenéticos constituem uma rede complicada que dita a manutenção do programa de leucemia e, portanto, poderia formar potenciais alvos terapêuticos. Neste contexto, utilizamos a linha celular MV4-11 (abrigando o gene de fusão MLL-AF4 com a mutação FLT3-ITD; denominada como MV4-11 P) para desenvolver a linha celular resistente à cytarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. A linha celular foi exposta ao aumento de doses de cytarabina com recuperação intermitente do tratamento medicamentoso, conhecido como feriado medicamentoso. A concentração inibitória semi-máxima (IC50) foi avaliada pelo ensaio de citoxicidade in vitro .
Utilizamos a biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabela de Materiais) impulsionada pelo promotor hEF1a com uma espinha dorsal lentiviral pZIP. Esta biblioteca compreende shRNAs visando 407 fatores epigenéticos. Cada fator tem 5-24 shRNAs, com um total de 5.485 shRNAs, incluindo cinco shRNAs de controle não direcionados. O andaime miR-30 modificado "UltrmiR" foi otimizado para biogênese e expressão primária eficiente12,13.
O esboço deste experimento é ilustrado na Figura 1A. O protocolo atual concentra-se na triagem RNAi usando a biblioteca de fator epigenético shRNA na linha de células R MV4-11 (Figura 1B), uma linha celular de suspensão. Este protocolo pode ser usado para selecionar qualquer biblioteca direcionada em qualquer linha celular resistente a medicamentos de sua escolha. Deve-se notar que o protocolo de transdução será diferente para as células aderentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Compreender mecanismos de condutores clinicamente relevantes da quimio-resistência adquirida é crucial para elucidar formas de contornar a resistência e melhorar a sobrevivência em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA). Uma pequena fração de células leucêmicas que sobrevivem à quimioterapia têm um estado epigenético equilibrado para tolerar insultos quimioterápicos. A exposição adicional à quimioterapia permite que essas células persistoras de medicamentos atinjam um estado epigenético fixo, o que leva à alteração da expressão genética, resultando na proliferação dessas populações resistentes a medicamentos e, eventualmente, recaídas ou doenças refratárias. Portanto, identificar modulações epigenéticas que necessitam da sobrevivência de células leucêmicas resistentes a medicamentos é fundamental. Detalhamos um protocolo para identificar moduladores epigenéticos que mediam a resistência à cytarabina analógica nucleosídea (AraC) usando a triagem da biblioteca shRNA agrupada em uma linha celular AML resistente à cytarabina adquirida. A biblioteca consiste em 5.485 construções de shRNA visando 407 fatores epigenéticos humanos, o que permite a triagem de fatores epigenéticos de alto rendimento.

O fluxo de trabalho de triagem geral é retratado na Figura 1A. A citotoxicidade in vitro do MV4-11 AraC R (48 h) revelou o IC50 para a citarabina no MV4-11 AraC R a ser maior que o MV4-11 P (Figura 1B). Esta linha celular foi utilizada no estudo como modelo para triagem dos fatores epigenéticos responsáveis pela resistência à cytarabina.
A Figura 2A mostra os mapas vetoriais...

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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

A triagem de interferência de RNA de alto rendimento (RNAi) usando um pool de shRNAs lentiviral pode ser uma ferramenta para detectar alvos letais sintéticos terapeuticamente relevantes em malignidades. Fornecemos uma abordagem de triagem de shRNA agrupada para investigar os efeitos epigenéticos na leucemia mielóide aguda (LMA).

Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

O objetivo geral do vídeo a seguir é demonstrar o uso da biblioteca epigenética shRNA agrupada para realizar uma triagem de seleção negativa. Esta triagem permite identificar alvos epigenéticos específicos através do sequenciamento. Este procedimento poderia ajudar a identificar os fatores epigenéticos responsáveis pela mediação da resistência à cytarabina adquirida na LMA As etapas são as seguintes.Seleção do promotor mais potente para obter expressão persistente e prolongada dos shRNAs. O protocolo atual se concentra na triagem RNAi usando a biblioteca de fator epigenético shRNA na linha celular MV4-11 resistente à cytarabina. Os promotores utilizados para este fim são o EF-1 alfa humano, o CMV humano e o SFFV, promotores que expressam proteína de fluorescência verde.Pegue a contagem de células usando o método de exclusão azul trypan. Suspenda as células em meio 10%RPMI contendo 8 microgramas por mL de polibrene. Semente 1 milhão de células em 1,5 ml de médio por poço de uma placa de seis poços em triplicados.Adicione diferentes volumes de lentivírus concentrados. Por exemplo, lentivírus, por exemplo, 10, 20 e 40 microliteres, dependendo do título dos lentivírus para cada poço. Gire suavemente a placa para misturar o conteúdo.Realize a spinfeção por centrifugação a 920 g a 37 graus centígrados por 90 minutos. Incubar imediatamente as placas em uma incubadora de dióxido de carbono. Observe o GFP ao final de 48 horas e quantifique o mesmo ao final de 72 horas.Em seguida, siga os passos descritos no fluxograma para escolher o promotor mostrando uma expressão GFP consistente em toda a cultura. Preparação da biblioteca de fator epigenético humano lentiviral agrupado. Cultura 293T células em um número de passagem baixa com uma boa taxa de proliferação em três pratos de cultura celular de 10 centímetros com 8ml de 10% de meio DMFM em cada placa.Uma vez que as células atinjam 60% de confluência, substitua-se completamente por meio fresco. Prepare a mistura de transfecção conforme delineado que contém meio livre de soro, embalagem lentiviral plasmid PAX2, envelope plasmid pMD2. G, plasmídeos de biblioteca agrupados, e finalmente o reagente de transfecção.Bata na mistura para misturar bem e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione a mistura de transfecção às células 293T e misture suavemente girando as placas. Incubar as placas em uma incubadora de dióxido de carbono.Troque o meio após 24 horas. Após 48 horas, verifique se há expressão GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir alta eficiência de transfecção em células 293T. Colete os supernantes do vírus após 48, 60 e 72 horas e armazene-os a 4 graus, e adicione meio fresco, 8ml, em cada ponto após a coleta do vírus.Filtre os vírus agrupados com filtro de 0,4 mícnico. Para obter um alto título de vírus, concentre os vírus agrupados por ultracentrifugação. Transfira os supernantes do vírus filtrado para 70 tubos Ti, e centrífuga a 18.000 g durante 2 horas.Use rotor pré-cozido e centrífuga a 4 graus. Retire os tubos da centrífuga cuidadosamente e remova o sobrenatante completamente. Resuspenque a pelota suavemente em 400 microliter de DMEM sem FBS e antibióticos usando uma micropipette, incubar no gelo por 1 hora.Alíquotar os vírus e congelar a menos 80 graus. Calcule a concentração do vírus como mostrado. Estimativa da eficiência de transdução de lentivírus.Transdutor células 293T com vírus concentrado em diferentes volumes, 2, 4 e 8, para confirmar a preparação bem sucedida do lentivírus. Valor para o vírus concentrado para 100X para realizar um experimento de titulação na linha celular alvo. Semente 1 milhão de linha celular alvo em 1,5 ml de meio 10% RPMI contendo 8 microgramas por ml de polibrene em um poço de uma placa de seis poços.Adicione quatro volumes diferentes, 1, 1,5, 2, 2,5 microliter de vírus 100X. Realize a spinfection por centrifugação da placa a 920 g por 90 minutos a 37 graus centígrados. Após 72 horas, meça a porcentagem de células positivas de GFP por citometria de fluxo.Determine o volume dos vírus para obter 30% de eficiência de transdução. Esta baixa eficiência de transdução é para garantir uma integração única de shRNA por célula. Transdução da biblioteca de shRNA epigenética agrupada na linha celular resistente a medicamentos.Calcule o número de células a serem tomadas para o experimento conforme abaixo com base no número de integradores virais. Resuspend 11 milhões de células em 16 ML de 10% RPMI médio. Adicione polibreno, oito microgramas por ml e misture bem, e depois adicione o volume necessário de vírus para obter 30% de eficiência de transdução como calculado anteriormente.Semente todas as células em uma placa de seis poços a uma densidade de 1 milhão de células por 1,5 ml por poço. Centrifugar a placa por 90 minutos a 920 g a 37 graus centígrados. Incubar a placa durante a noite em uma incubadora de dióxido de carbono.Após 24 horas, troque o meio e transfira as células transduzidas para um frasco T-75. Após 48 horas, verifique o GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir uma transdução bem sucedida. Após 72 horas, quantita o GFP por citometria de fluxo.Enriquecimento das células positivas do GFP. Expanda as células transduzidas, culminando-as a uma densidade de 0,5 milhões por ml por 5 a 7 dias, e realize a triagem de fluxo com o ajuste de fluxo definido como alta pureza e baixo rendimento. Cultume as células classificadas em um meio de 10%RPMI.Após 72 horas, realize a estimativa pós-classificação do percentual das células positivas do GFP para garantir mais de 95% de eficiência de classificação. Rastreamento de abandono para identificar fatores epigenéticos que mediam a resistência às drogas. Cultura as células transduzidas pela biblioteca shRNA em 10% RPMI por até 5 dias.Centrifugar 10 milhões de células em duplicatas. Descarte o supernatante e armazene as pelotas a menos 80 graus. Essas amostras servirão como referência de base para a biblioteca epigenética shRNA.Cultura as células transduzidas restantes como duplicatas, R1 e R2, cada uma mantida em uma contagem de células que fornece uma representação de 500X da biblioteca. Trate uma das duplicatas com a droga, 10 cytarabina micromolar, e a outra sem o tratamento medicamentoso. Troque o meio para os frascos com, e sem a droga, a cada 72 horas.Repita a variação média três vezes para uma exposição cumulativa de drogas de 9 dias. Após o 9º dia de tratamento medicamentoso, verifique a viabilidade das células pelo método de exclusão azul trypan. Gire as células viáveis restantes, lave com PBS estéril e centrífuga a 280 g por 5 minutos à temperatura ambiente.Descarte o supernatante e armazene as pelotas a menos 80 para extração de DNA. Amplificação dos shRNAs integrados por PCR. Extrair DNA das células de base transduzidas, células tratadas e não tratadas, seguidas pela verificação da concentração usando fluorômetro, calcular a quantidade de DNA necessária como mostrado e submeter as amostras à primeira rodada de PCR.A mistura de reação PCR é retratada na tabela 2 com as condições do cicloviário térmico. Configure múltiplas reações contendo 850 DNA de nanograma por tubo para um total de 43 reações. Acumule os produtos PCR e purifique-os.Elute os produtos em 50 tampão de microliter e quantificá-los, e finalmente, armazenar a menos 20. Para pcr segunda rodada, use primers de índice reverso e os reagentes são tabulados na tabela 4. Configure quatro reações com 500 nanogramas do produto PCR primário em um volume total de reação de 50 microliter para cada amostra, juntamente com o controle negativo.Carregue todo o produto para eletroforese usando gel de agarose 2%TBE e confirme o tamanho da banda com uma escada de molécula KB. Visualize os produtos PCR no sistema de documentação do gel. Extirpa a banda específica e purificar usando um kit de purificação de gel.Os cálculos para a purificação com o kit estão fornecidos na tabela 3. Elute em um volume final de 30 microliter de tampão de eluição com a concentração aproximada de cada eluente em torno de 80 a 90 nanogramas por microliter. Sequenciamento de próxima geração e análise de dados.Os produtos purificados em gel são submetidos ao sequenciamento de próxima geração para obter contagem de leitura para as necessidades de shRNA empobrecidos. Corte as sequências do adaptador, alinhe as leituras filtradas às sequências de referência, carregue os arquivos usando SAMtools para obter o resumo de alinhamento. Carregue os arquivos fastQ aparados no CRISPRCloud2 e execute a análise de acordo com as instruções.Clique no link fornecido para o CRISPRCloud2. Selecione o tipo de tela como telas de sobrevivência e abandono. Defina o número de grupos e digite o nome de cada grupo.Carregue a biblioteca de referências como o formato de arquivo FASTA. Os dados carregados são processados e os resultados estão disponíveis na URL dada. Dados representativos.Este número mostra células parentais e resistentes MV4-11 tratadas com aumento da concentração de cytarabina, 0,1 micromolar para 1.000 micromolar e avaliação de viabilidade pelo ensaio MTT. Esta figura mostra parcelas representativas de fluxo do GFP quantificadas por citometria de fluxo no final de 72 horas para os promotores humanos EF-1 alfa, CMV humano e SFFV. O CMV humano mostra nosso pico heterogêneo, enquanto os humanos EF-1 alfa e SFFV mostram um único pico homogêneo.Este número mostra o gráfico da barra para as três diferentes eficiências de promotores em MV4-11. O GFP orientado pelo SFFV mostrou silenciamento do GFP na cultura prolongada. hEF-1 células GFP orientadas alfa mostraram expressão sustentada pós classificação dessas células.O painel esquerdo mostra a eficiência de transfecção da biblioteca de shRNA agrupada transfeccionada em 293T no final de 48 horas sob microscopia de fluorescência. O painel direito mostra a eficiência de transdução do vírus da piscina em células 293T com volumes de vírus variados, 2, 4 e 8 microliter. Este número representa a eficiência de transdução na linha celular resistente MV4-11 com volumes variados de vírus, como 1, 1,5, 2, 2,5 microliter para alcançar 30% de eficiência de transdução.Este número mostra a classificação das células positivas GFP com eficiência de transdução de 30% com alta pureza e ajuste de classificação de baixo rendimento. A figura mostra a ilustração esquemática do tratamento medicamentoso para as células classificadas positivas do GFP para uma exposição prolongada de cytarabina de 9 dias, seguida pela verificação da viabilidade e coleta das células para DNA. Este número mostra as regiões vinculantes do primer usado na primeira e segunda rodada de PCR.Esta figura ilustra o tamanho da banda do produto PCR no final da primeira rodada pcr, par base 397, e o segundo par de base pcr 399 rodada, que foi elucido, purificado e dado para NGS. Esta figura ilustra a representação dos shRNAs enriquecidos ou esgotados visando os fatores epigenéticos que poderiam mediar a resistência à cytarabina na LMA. Conclusão. Este protocolo destaca a importância da triagem de knockdown direcionada para interrogar genes essenciais e não essenciais sistematicamente e demonstra o uso dessa abordagem como plataforma funcional, permitindo a identificação de alvos responsáveis pela resistência a medicamentos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Pesquisa do câncer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Um fluxo de trabalho de integração de dados para identificar combinações de drogas visando interações letais sintéticas

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...