Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Este estudio está financiado en parte por una subvención del Departamento de Biotecnología BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; y Departamento de Biotecnología de la India BT/COE/34/SP13432/2015 y Departamento de Ciencia y Tecnología de la India: EMR/2017/003880 a P.B. RVS y P.B. cuentan con el apoyo de Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. S.D. cuenta con el apoyo de la beca CSIR-UGC, y S.I. cuenta con el apoyo de una beca de investigación senior de ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani y al personal de CSCR Flow Cytometry Core Facility por su ayuda. También agradecemos a MedGenome Inc. por ayudar con la secuenciación de alto rendimiento y el análisis de datos.

Siga las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC) y use la instalación adecuada para manejar el lentivirus (BSL-2). El personal debe estar debidamente capacitado en el manejo y eliminación de lentivirus. Este protocolo sigue las pautas de bioseguridad de Christian Medical College, Vellore.
1. Selección del promotor más potente para obtener una expresión persistente y prolongada de los shRNAs
NOTA: Es imprescindible realizar un expe...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

La interferencia de ARN (ARNi) se utiliza ampliamente para estudios de genómica funcional, que incluyen la detección de siRNA y shRNA. El beneficio de los shRNA es que pueden incorporarse a vectores plásmidos e integrarse en el ADN genómico, lo que resulta en una expresión estable y, por lo tanto, un derribo más prolongado del ARNm objetivo. Un cribado de biblioteca de shRNA agrupado es robusto y rentable en comparación con los cribados convencionales (siRNA). Identificar la esencialidad de una clase específica d...

Las opciones terapéuticas en la leucemia mieloide aguda (LMA) se han mantenido sin cambios durante casi las últimas cinco décadas, con la citarabina (AraC) y las antraciclinas como la piedra angular para el tratamiento de la enfermedad. Uno de los desafíos para el éxito de la terapia con LMA es la resistencia de las células madre leucémicas a la quimioterapia, lo que lleva a la recaída de la enfermedad 1,2. La regulación epigenética juega un papel vital en la patogénesis del cáncer y la resistencia a los medicamentos, y varios factores epigenéticos han surgido como objetivos terapéuticos prometedores 3,4,5. Los mecanismos reguladores epigenéticos afectan la proliferación y la supervivencia bajo la exposición continua a fármacos quimioterapéuticos. Los estudios en neoplasias malignas no hematológicas han informado que una pequeña fracción de células que superan el efecto del fármaco sufren diversas modificaciones epigenéticas, lo que resulta en la supervivencia de esas células 6,7. Sin embargo, no se ha explorado el papel de los factores epigenéticos en la mediación de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.
El cribado de alto rendimiento es un enfoque para el descubrimiento de fármacos que ha ganado importancia global con el tiempo y se ha convertido en un método estándar en diferentes aspectos para identificar objetivos potenciales en mecanismos celulares, para el perfil de vías y a nivel molecular 8,9. El concepto de letalidad sintética implica la interacción entre dos genes donde la perturbación de cualquiera de los genes por sí sola es viable, pero de ambos genes simultáneamente resulta en la pérdida de viabilidad10. Explotar la letalidad sintética en el tratamiento del cáncer podría ayudar a identificar y caracterizar mecánicamente interacciones genéticas letales sintéticas robustas11. Hemos adoptado un enfoque combinatorio de cribado de shRNA de alto rendimiento con letalidad sintética para identificar los factores epigenéticos responsables de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.
Se sabe que las leucemias agudas impulsadas por la translocación cromosómica del gen de la leucemia de linaje mixto (MLL o KMT2A) se asocian con una supervivencia deficiente en los pacientes. Los productos quiméricos resultantes de los reordenamientos del gen MLL , es decir, las proteínas de fusión MLL (MLL-FPs), pueden transformar las células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en blastos leucémicos con la participación de múltiples factores epigenéticos. Estos reguladores epigenéticos constituyen una red complicada que dicta el mantenimiento del programa de leucemia y, por lo tanto, podrían formar potenciales dianas terapéuticas. En este contexto, utilizamos la línea celular MV4-11 (que alberga el gen de fusión MLL MLL-AF4 con la mutación FLT3-ITD; denominada MV4-11 P) para desarrollar la línea celular resistente a la citarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. La línea celular fue expuesta a dosis crecientes de citarabina con recuperación intermitente del tratamiento farmacológico, conocido como vacaciones de drogas. La concentración inhibitoria medio máxima (IC50) se evaluó mediante ensayo de citotoxicidad in vitro .
Se utilizó la biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabla de Materiales) impulsada por el promotor hEF1a con una columna vertebral lentiviral pZIP. Esta biblioteca comprende shRNAs dirigidos a 407 factores epigenéticos. Cada factor tiene de 5 a 24 shRNAs, con un total de 5.485 shRNAs, incluyendo cinco shRNAs de control no objetivo. El andamio miR-30 "UltrmiR" modificado ha sido optimizado para una biogénesis y expresión eficientes de shRNA primario12,13.
El esquema de este experimento se ilustra en la Figura 1A. El protocolo actual se centra en el cribado de ARNi utilizando la biblioteca de ARNt shRNA del factor epigenético en la línea celular MV4-11 AraC R (Figura 1B), una línea celular en suspensión. Este protocolo se puede utilizar para examinar cualquier biblioteca dirigida en cualquier línea celular resistente a los medicamentos de su elección. Cabe señalar que el protocolo de transducción será diferente para las células adherentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Comprender los mecanismos impulsores clínicamente relevantes de la quimiorresistencia adquirida es crucial para dilucidar las formas de eludir la resistencia y mejorar la supervivencia en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA). Una pequeña fracción de las células leucémicas que sobreviven a la quimioterapia tienen un estado epigenético preparado para tolerar el insulto quimioterapéutico. La exposición adicional a la quimioterapia permite que estas células persistentes de medicamentos alcancen un estado epigenético fijo, lo que conduce a una expresión génica alterada, lo que resulta en la proliferación de estas poblaciones resistentes a los medicamentos y, finalmente, en una recaída o enfermedad refractaria. Por lo tanto, es fundamental identificar las modulaciones epigenéticas que requieren la supervivencia de las células leucémicas resistentes a los medicamentos. Detallamos un protocolo para identificar moduladores epigenéticos que median la resistencia a la citarabina analógica de nucleósidos (AraC) utilizando el cribado de la biblioteca de SHRNA agrupado en una línea celular de LMA adquirida resistente a la citarabina. La biblioteca consta de 5.485 construcciones de shRNA dirigidas a 407 factores epigenéticos humanos, lo que permite la detección del factor epigenético de alto rendimiento.

El flujo de trabajo de filtrado general se muestra en la Figura 1A. La citotoxicidad in vitro del MV4-11 AraC R (48 h) reveló que el IC50 a citarabina en el MV4-11 AraC R era mayor que el MV4-11 P (Figura 1B). Esta línea celular se utilizó en el estudio como modelo para el cribado de los factores epigenéticos responsables de la resistencia a la citarabina.
La Figura 2A muestr...

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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).

Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

El objetivo general del siguiente video es demostrar el uso de la biblioteca epigenética de shRNA agrupada para realizar una selección negativa. Este cribado permite identificar dianas epigenéticas específicas a través de la secuenciación. Este procedimiento podría ayudar a identificar los factores epigenéticos responsables de mediar la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA Los pasos son los siguientes.Selección del promotor más potente para obtener la expresión persistente y prolongada de los shRNAs. El protocolo actual se centra en el cribado de ARNi utilizando la biblioteca de SHRNA del factor epigenético en la línea celular MV4-11 resistente a la citarabina. Los promotores utilizados para este propósito son EF-1 alfa humano, CMV humano y SFFV, promotores que expresan la proteína de fluorescencia verde.Tome el recuento de celdas utilizando el método de exclusión azul tripano. Suspender las células en medio 10%RPMI que contenga 8 microgramos por ml de polibreno. Sembrar 1 millón de células en 1,5 ml de medio por pocillo de una placa de seis pocillos en triplicados.Agregue diferentes volúmenes de lentivirus concentrados. Por ejemplo, los lentivirus, por ejemplo, de 10, 20 y 40 microlitros, dependiendo del título de los lentivirus a cada pozo. Agite suavemente la placa para mezclar el contenido.Realizar la espinfección por centrifugación a 920 g a 37 grados centígrados durante 90 minutos. Incuba inmediatamente las placas en una incubadora de dióxido de carbono. Observe el GFP al final de 48 horas y cuantifique el mismo al final de 72 horas.A continuación, siga los pasos que se muestran en el diagrama de flujo para elegir el promotor que muestre una expresión GFP coherente en toda la cultura. Preparación de la biblioteca de shRNA del factor epigenético humano lentiviral agrupado. Cultivo de células 293T a un número de paso bajo con una buena tasa de proliferación en tres placas de cultivo celular de 10 centímetros con 8ml de medio 10% DMFM en cada placa.Una vez que las células alcancen el 60% de confluencia, reemplácelas por medio fresco por completo. Prepare la mezcla de transfección como se describe que contiene medio libre de suero, plásmido de empaque lentiviral PAX2, plásmido de envoltura pMD2. G, plásmidos de biblioteca agrupados y, finalmente, el reactivo de transfección.Toca la mezcla para mezclarla bien e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Agregue la mezcla de transfección a las células 293T y mezcle suavemente girando las placas. Incubar las placas en una incubadora de dióxido de carbono.Cambie el medio después de 24 horas. Después de 48 horas, verifique la expresión de GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una alta eficiencia de transfección en células 293T. Recolecte los sobrenadantes del virus después de 48, 60 y 72 horas y guárdelos a 4 grados, y agregue un medio fresco, 8 ml, en cada punto de tiempo después de recolectar el virus.Filtre los virus agrupados con un filtro de 0,4 micras. Para obtener un título alto de virus, concentre los virus agrupados por ultracentrifugación. Transfiera los sobrenadantes de virus filtrados a 70 tubos de Ti y centrífuga a 18, 000 g durante 2 horas.Use rotor y centrífuga preenfriados a 4 grados. Saque los tubos de la centrífuga con cuidado y retire el sobrenadante por completo. Resusped el pellet suavemente en 400 microlitros de DMEM sin FBS y antibióticos usando una micropipeta, incubar en hielo durante 1 hora.Alícuota los virus y congela a menos 80 grados. Calcule la concentración del virus como se muestra. Estimación de la eficiencia de transducción de lentivirus.Transducir células 293T con un virus concentrado en diferentes volúmenes, 2, 4 y 8, para confirmar la preparación exitosa del lentivirus. Valor del virus concentrado a 100X para realizar un experimento de titulación en la línea celular objetivo. Sembrar 1 millón de líneas celulares objetivo en 1,5 ml de medio 10%RPMI que contiene 8 microgramos por ml de polibreno en un pocillo de una placa de seis pocillos.Agregue cuatro volúmenes diferentes, 1, 1.5, 2, 2.5 microlitros de virus 100X. Realizar la espinfección por centrifugación de la placa a 920 g durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de 72 horas, mida el porcentaje de células GFP positivas por citometría de flujo.Determinar el volumen de los virus para obtener una eficiencia de transducción del 30%. Esta baja eficiencia de transducción es para garantizar la integración de shRNA único por célula. Transducción de la biblioteca epigenética agrupada de SHRNA en la línea celular resistente a los medicamentos.Calcule el número de células que se tomarán para el experimento como se indica a continuación en función del número de integrantes virales. Resuspendir 11 millones de células en 16 ML de medio 10%RPMI. Agregue polibreno, ocho microgramos por ml y mezcle bien, y luego agregue el volumen requerido de virus para obtener una eficiencia de transducción del 30% como se calculó anteriormente.Sembra todas las células en una placa de seis pocillos a una densidad de 1 millón de células por 1,5 ml por pocillo. Centrifugar la placa durante 90 minutos a 920 g a 37 grados centígrados. Incubar la placa durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono.Después de 24 horas, cambie el medio y transfiera las células transducidas a un matraz T-75. Después de 48 horas, verifique la GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una transducción exitosa. Después de 72 horas, cuantifique la GFP mediante citometría de flujo.Enriquecimiento de las células GFP positivas. Expanda las células transducidas cultivándolas a una densidad de 0,5 millones por ml durante 5 a 7 días, y realice la clasificación de flujo con el ajuste de clasificación de flujo establecido como de alta pureza y bajo rendimiento. Cultive las células clasificadas en un medio 10%RPMI.Después de 72 horas, realice la estimación posterior a la clasificación del porcentaje de células GFP positivas para garantizar una eficiencia de clasificación de más del 95%. Detección de abandonos para identificar los factores epigenéticos que median la resistencia a los medicamentos. Cultive las células transducidas por la biblioteca de shRNA en 10%RPMI durante un máximo de 5 días.Centrifugar 10 millones de células por duplicado. Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos a menos 80 grados. Estas muestras servirán como referencia de referencia para la biblioteca epigenética de SHRNA.Cultive las células transducidas restantes como duplicados, R1 y R2, cada uno mantenido en un recuento de células que proporciona una representación 500X de la biblioteca. Trate uno de los duplicados con el medicamento, 10 citarabina micromolar, y el otro sin el tratamiento farmacológico. Cambie el medio para los matraces con y sin el medicamento cada 72 horas.Repita el cambio de medio tres veces para una exposición acumulativa al medicamento de 9 días. Después del 9º día de tratamiento farmacológico, verifique la viabilidad de las células mediante el método de exclusión de azul tripano. Girar hacia abajo las células viables restantes, lavar con PBS estéril y centrifugar a 280 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos a menos 80 para la extracción de ADN. Amplificación de los shRNAs integrados por PCR. Extraer adn de las células basales transducidas, células tratadas y no tratadas, seguido de verificar la concentración con fluorómetro, calcular la cantidad de ADN requerida como se muestra y someter las muestras a la primera ronda de PCR.La mezcla de reacción de PCR se representa en la tabla 2 con las condiciones del termociclador. Configure múltiples reacciones que contengan 850 nanogramos de ADN por tubo para un total de 43 reacciones. Agrupa los productos de PCR y depuralos.Eluya los productos en un búfer de 50 microlitros y cuantifiquelos, y finalmente, guárdelos a menos 20. Para la PCR de segunda ronda, utilice cebadores de índice inverso y los reactivos se tabulan en la tabla 4. Configure cuatro reacciones con 500 nanogramos del producto primario de PCR en un volumen total de reacción de 50 microlitros para cada muestra junto con el control negativo.Cargue todo el producto para electroforesis utilizando gel de agarosa 2% TBE y confirme el tamaño de la banda con una escalera de moléculas KB. Visualice los productos de PCR en el sistema de documentación del gel. Elimine la banda específica y purifique con un kit de purificación en gel.Los cálculos para la purificación con el kit se proporcionan en la tabla 3. Elute en un volumen final de 30 microlitros de tampón de elución con la concentración aproximada de cada eluyente alrededor de 80 a 90 nanogramos por microlitro. Secuenciación de próxima generación y análisis de datos.Los productos purificados en gel se someten a secuenciación de próxima generación para obtener recuentos de lectura para las necesidades de shRNA agotadas. Recorte las secuencias del adaptador, alinee las lecturas filtradas con las secuencias de referencia, cargue los archivos utilizando SAMtools para obtener un resumen de alineación. Cargue los archivos fastQ recortados en CRISPRCloud2 y realice el análisis según las instrucciones.Haga clic en el enlace proporcionado para el CRISPRCloud2. Seleccione el tipo de pantalla como pantallas supervivencia y abandono. Establezca el número de grupos y escriba el nombre de cada grupo.Cargue la biblioteca de referencia como formato de archivo FASTA. Los datos cargados se procesan y los resultados están disponibles en la URL dada. Datos representativos.Esta figura muestra células parentales y resistentes MV4-11 tratadas con concentración creciente de citarabina, 0,1 micromolares a 1.000 micromolares y evaluación de viabilidad mediante ensayo MTT. Esta figura muestra diagramas de flujo representativos de la GFP cuantificadas por citometría de flujo al final de 72 horas para los promotores humanos EF-1 alfa, CMV humano y SFFV. El CMV humano muestra nuestro pico heterogéneo, mientras que el EF-1 alfa y el SFFV humanos muestran un único pico homogéneo.Esta figura muestra el gráfico de barras para las tres eficiencias de promotor diferentes en MV4-11. La GFP impulsada por SFFV mostró silenciamiento de la GFP en cultivo prolongado. Las células GFP impulsadas por hEF-1 alfa mostraron una expresión sostenida después de la clasificación de estas células.El panel izquierdo muestra la eficiencia de transfección de la biblioteca de shRNA agrupada transfectada en 293T al final de 48 horas bajo microscopía de fluorescencia. El panel derecho muestra la eficiencia de transducción del virus de la piscina en células 293T con volúmenes de virus variables, 2, 4 y 8 microlitros. Esta cifra representa la eficiencia de transducción en líneas celulares resistentes a MV4-11 con volúmenes variables de virus, como 1, 1.5, 2, 2.5 microlitros para lograr una eficiencia de transducción del 30%.Esta figura muestra la clasificación de las células positivas GFP con una eficiencia de transducción del 30% con alta pureza y un ajuste de clasificación de bajo rendimiento. La figura muestra una ilustración esquemática del tratamiento farmacológico para las células clasificadas GFP positivas para una exposición prolongada a citarabina de 9 días, seguida de la verificación de la viabilidad y la recolección de las células para el ADN. Esta figura muestra las regiones de unión del cebador utilizado en la primera y segunda ronda de PCR.Esta figura ilustra el tamaño de la banda del producto de PCR al final de la primera ronda de PCR, el par de bases 397 y el segundo par de bases del producto de PCR 399, que fue eluido en gel, purificado y dado para NGS. Esta figura ilustra la representación de los shRNAs enriquecidos o agotados dirigidos a los factores epigenéticos que podrían mediar la resistencia a la citarabina en la LMA. Conclusión. Este protocolo destaca la importancia de la detección de derribo dirigida para interrogar sistemáticamente genes esenciales y no esenciales y demuestra el uso de este enfoque como una plataforma funcional, que permite la identificación de objetivos responsables de la resistencia a los medicamentos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Detección sistema para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación celular de células de Glioblastoma de drogas basados en citometría flujo

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Buscando vías de controlador de adquirir resistencia a la terapia dirigida: sensibilidad restaurar por Gene Knock-down y generación Subclone resistente a los medicamentos

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Un flujo de trabajo de integración de datos para identificar combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...