Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Denna studie finansieras delvis av ett bidrag från Institutionen för bioteknik BT/PR8742/AGR/36/773/2013 till SRV; och Institutionen för bioteknik Indien BT / COE / 34 / SP13432/2015 och Institutionen för vetenskap och teknik, Indien: EMR / 2017/003880 till P.B. RVS och P.B. stöds av Wellcome DBT India Alliance IA / S / 17/1 / 503118 respektive IA / S / 15/1 / 501842. S.D. stöds av CSIR-UGC-stipendiet, och S.I. stöds av ett ICMR senior research fellowship. Vi tackar Abhirup Bagchi, Sandya Rani och CSCR Flow Cytometry Core Facility-personalen för deras hjälp. Vi tackar också MedGenome Inc. för att ha hjälpt till med sekvensering och dataanalys med hög genomströmning.

Följ riktlinjerna från Institutional Biosafety Committee (IBSC) och använd rätt anläggning för att hantera lentivirus (BSL-2). Personalen bör ha lämplig utbildning i hantering och bortskaffande av lentivirus. Detta protokoll följer riktlinjerna för biosäkerhet från Christian Medical College, Vellore.
1. Val av den mest potenta promotorn för att erhålla ihållande och långvarigt uttryck av shRNA: erna
OBS: Det är viktigt att utföra ett...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA-interferens (RNAi) används i stor utsträckning för funktionella genomikstudier, som inkluderar siRNA- och shRNA-screening. Fördelen med shRNA är att de kan införlivas i plasmidvektorer och integreras i genomiskt DNA, vilket resulterar i stabilt uttryck och därmed mer långvarig knockdown av mål-mRNA. En poolad shRNA-biblioteksscreening är robust och kostnadseffektiv jämfört med de konventionella arrayed screens (siRNA). Att identifiera väsentligheten hos en specifik klass av proteiner i en genom-bred skä...

Terapeutiska alternativ vid akut myeloisk leukemi (AML) har varit oförändrade under nästan de senaste fem decennierna, med cytarabin (AraC) och antracykliner som hörnstenen för behandling av sjukdomen. En av utmaningarna för framgången med AML-terapi är leukemiska stamcellers resistens mot kemoterapi, vilket leder till sjukdomsåterfall 1,2. Epigenetisk reglering spelar en viktig roll i cancerpatogenes och läkemedelsresistens, och flera epigenetiska faktorer har framkommit som lovande terapeutiska mål 3,4,5. Epigenetiska regleringsmekanismer påverkar proliferation och överlevnad under kontinuerlig exponering för kemoterapeutiska läkemedel. Studier av icke-hematologiska maligniteter har rapporterat att en liten del av cellerna som övervinner läkemedelseffekten genomgår olika epigenetikmodifieringar, vilket resulterar i dessa cellers överlevnad 6,7. Emellertid, den roll som epigenetiska faktorer spelar för att förmedla förvärvad resistens mot cytarabin i AML har inte undersökts.
Screening med hög genomströmning är ett tillvägagångssätt för läkemedelsupptäckt som har fått global betydelse över tid och har blivit en standardmetod i olika aspekter för att identifiera potentiella mål i cellulära mekanismer, för vägprofilering och på molekylär nivå 8,9. Det syntetiska dödlighetskonceptet involverar interaktionen mellan två gener där störningen av endera genen ensam är livskraftig men av båda generna samtidigt resulterar i förlust av livskraft10. Utnyttjande av syntetisk dödlighet vid cancerbehandling kan bidra till att identifiera och mekaniskt karakterisera robusta syntetiska dödliga genetiska interaktioner11. Vi har antagit ett kombinatoriskt tillvägagångssätt för shRNA-screening med hög genomströmning med syntetisk dödlighet för att identifiera de epigenetiska faktorer som är ansvariga för förvärvad cytarabinresistens vid AML.
Akuta leukemier som drivs av kromosomal translokation av den blandade leukemigenen (MLL eller KMT2A) är kända för att vara associerade med dålig överlevnad hos patienter. De resulterande chimärta produkterna av MLL-genomläggningar, dvs MLL-fusionsproteiner (MLL-FP), kan omvandla hematopoetiska stam- / stamceller (HSPC) till leukemiska blaster med inblandning av flera epigenetiska faktorer. Dessa epigenetiska regulatorer utgör ett komplicerat nätverk som dikterar upprätthållandet av leukemiprogrammet och kan därför bilda potentiella terapeutiska mål. I detta sammanhang använde vi MV4-11-cellinjen (som hyser MLL-fusionsgenen MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutationen; benämnd MV4-11 P) för att utveckla den förvärvade cytarabinresistenta cellinjen, benämnd MV4-11 AraC R. Cellinjen utsattes för ökande doser av cytarabin med intermittent återhämtning från läkemedelsbehandlingen, känd som en läkemedelssemester. Den halvmaximatiska hämmande koncentrationen (IC50) bedömdes genom cytotoxicitetsanalys in vitro.
Vi använde det poolade epigenetiska shRNA-biblioteket (se Materialtabell) som drivs av hEF1a-promotorn med en pZIP-lentiviral ryggrad. Detta bibliotek består av shRNA som riktar sig till 407 epigenetiska faktorer. Varje faktor har 5-24 shRNA, med totalt 5 485 shRNA, inklusive fem icke-riktade kontrolls-shRNA. Den modifierade "UltrmiR" miR-30-ställningen har optimerats för effektiv primär shRNA-biogenes och uttryck12,13.
Konturerna av detta experiment illustreras i figur 1A. Det nuvarande protokollet fokuserar på RNAi-screening med användning av det epigenetiska faktor shRNA-biblioteket i MV4-11 AraC R-cellinjen (figur 1B), en suspensionscellinje. Detta protokoll kan användas för att screena alla riktade bibliotek i valfri läkemedelsresistent cellinje. Det bör noteras att transduktionsprotokollet kommer att vara annorlunda för vidhäftande celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Att förstå kliniskt relevanta drivkraftsmekanismer för förvärvad kemoresistens är avgörande för att belysa sätt att kringgå resistens och förbättra överlevnaden hos patienter med akut myeloisk leukemi (AML). En liten del av leukemiska celler som överlever kemoterapi har ett redo epigenetiskt tillstånd för att tolerera kemoterapeutisk förolämpning. Ytterligare exponering för kemoterapi gör det möjligt för dessa läkemedelsbeständiga celler att uppnå ett fast epigenetiskt tillstånd, vilket leder till förändrat genuttryck, vilket resulterar i spridning av dessa läkemedelsresistenta populationer och så småningom återfall eller eldfast sjukdom. Därför är det viktigt att identifiera epigenetiska moduleringar som kräver överlevnad av läkemedelsresistenta leukemiska celler. Vi beskriver ett protokoll för att identifiera epigenetiska modulatorer som förmedlar resistens mot nukleosidanalog cytarabin (AraC) med hjälp av poolad shRNA-biblioteksscreening i en förvärvad cytarabinresistent AML-cellinje. Biblioteket består av 5 485 shRNA-konstruktioner riktade mot 407 humana epigenetiska faktorer, vilket möjliggör epigenetisk faktorscreening med hög genomströmning.

Det övergripande arbetsflödet för screening visas i figur 1A. Cytotoxiciteten in vitro hos MV4-11 AraC R (48 timmar) visade att IC50 till cytarabin i MV4-11 AraC R var högre än MV4-11 P (figur 1B). Denna cellinje användes i studien som modell för screening av de epigenetiska faktorer som är ansvariga för cytarabinresistens.
Figur 2A visar de linjäriserade pZIP-vektorkar...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

RNA-interferens (RNAi) screening med hög genomströmning med hjälp av en pool av lentivirala shRNA kan vara ett verktyg för att detektera terapeutiskt relevanta syntetiska dödliga mål vid maligniteter. Vi tillhandahåller en poolad shRNA-screeningmetod för att undersöka de epigenetiska effektorerna vid akut myeloisk leukemi (AML).

Poolad shRNA-biblioteksscreening för att identifiera faktorer som modulerar en läkemedelsresistensfenotyp

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Det övergripande målet med följande video är att visa användningen av det poolade shRNA-epigenetiska biblioteket för att genomföra en negativ urvalsscreening. Denna screening gör det möjligt att identifiera specifika epigenetiska mål genom sekvensering. Denna procedur kan bidra till att identifiera de epigenetiska faktorer som är ansvariga för att förmedla förvärvad cytarabinresistens vid AML Stegen är följande.Val av den mest potenta promotorn för att erhålla ihållande och långvarigt uttryck av shRNA. Det nuvarande protokollet fokuserar på RNAi-screening med epigenetisk faktor shRNA-bibliotek i cytarabinresistent MV4-11-cellinje. Promotorerna som används för detta ändamål är human EF-1 alfa, mänsklig CMV och SFFV, promotorer som uttrycker grönt fluorescensprotein.Ta cellantalet med trypan blå uteslutningsmetod. Suspendera cellerna i 10% RPMI-medium innehållande 8 mikrogram per ml polybren. Frö 1 miljon celler i 1,5 ml medium per brunn av en sexbrunnsplatta i tre exemplar.Tillsätt olika volymer koncentrerade lentivirus. Till exempel lentivirus, till exempel 10, 20 och 40 mikroliter, beroende på titer av lentivirus till varje brunn. Virvla försiktigt plattan för att blanda innehållet.Utför spinnfektion genom centrifugering vid 920 g vid 37 grader Celsius i 90 minuter. Inkubera omedelbart plattorna i en koldioxidinkubator. Observera GFP i slutet av 48 timmar och kvantifiera detsamma i slutet av 72 timmar.Följ sedan stegen som visas i flödesschemat för att välja promotorn som visar konsekvent GFP-uttryck i hela kulturen. Framställning av det poolade lentivirala humana epigenetiska faktor shRNA-biblioteket. Odling 293T-celler med lågt passagenummer med god proliferationshastighet i tre 10-centimeter cellodlingsrätter med 8 ml 10% DMFM-medium i varje tallrik.När cellerna uppnår 60% sammanflöde, ersätt med färskt medium helt. Förbered transfektionsblandningen enligt beskrivningen som innehåller serumfritt medium, lentiviral förpackningsplasmid PAX2, kuvertplasmid pMD2. G, poolade biblioteksplasmider och slutligen transfektionsreagenset.Tryck på blandningen för att blanda den väl och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Tillsätt transfektionsblandningen till 293T-cellerna och blanda försiktigt genom att virvla plattorna. Inkubera plattorna i en koldioxidinkubator.Byt medium efter 24 timmar. Efter 48 timmar, kontrollera om GFP-uttryck under ett fluorescensmikroskop säkerställer hög transfektionseffektivitet i 293T-celler. Samla viruset supernatanter efter 48, 60 och 72 timmar och förvara dem vid 4 grader, och tillsätt färskt medium, 8 ml, vid varje tidpunkt efter att ha samlat viruset.Filtrera de poolade virusen med 0,4 mikron filter. För att erhålla en hög titer av virus, koncentrera de poolade virusen genom ultracentrifugering. Överför de filtrerade virussupernatanterna till 70 Ti-rör och centrifug vid 18 000 g i 2 timmar.Använd förkyld rotor och centrifug vid 4 grader. Ta försiktigt ut rören från centrifugen och ta bort supernatanten helt. Resuspend pelletsen försiktigt i 400 mikroliter DMEM utan FBS och antibiotika med hjälp av en mikropipett, inkubera på is i 1 timme.Alicitera virusen och frys vid minus 80 grader. Beräkna koncentrationen av viruset som visas. Uppskattning av transduktionseffektiviteten hos lentivirus.Transducera 293T-celler med ett koncentrerat virus i olika volymer, 2, 4 och 8, för att bekräfta den framgångsrika beredningen av lentiviruset. Värde till koncentrerat virus till 100X för att utföra ett titreringsexperiment i målcellinjen. Frö 1 miljon målcellinje i 1,5 ml 10% RPMI-medium innehållande 8 mikrogram per ml polybren i en brunn av en sexbrunnsplatta.Lägg till fyra olika volymer, 1, 1,5, 2, 2,5 mikroliter 100X virus. Utför spinfektion genom centrifugering av plattan vid 920 g i 90 minuter vid 37 grader Celsius. Efter 72 timmar mäter du procentandelen GFP-positiva celler med flödescytometri.Bestäm virusvolymen för att erhålla 30% transduktionseffektivitet. Denna låga transduktionseffektivitet är att säkerställa en enda shRNA-integration per cell. Transduktion av det poolade epigenetiska shRNA-biblioteket i den läkemedelsresistenta cellinjen.Beräkna antalet celler som ska tas för experimentet enligt nedan baserat på antalet virala integranter. Resuspend 11 miljoner celler i 16 ML av 10% RPMI medium. Tillsätt polybren, åtta mikrogram per ml och blanda väl, och tillsätt sedan den erforderliga volymen virus för att erhålla 30% transduktionseffektivitet som beräknats tidigare.Frö alla celler på en sexbrunnsplatta med en densitet av 1 miljon celler per 1,5 ml per brunn. Centrifugera plattan i 90 minuter vid 920 g vid 37 grader Celsius. Inkubera plattan över natten i en koldioxidinkubator.Byt medium efter 24 timmar och överför de transducerade cellerna till en T-75-kolv. Efter 48 timmar, kontrollera GFP under ett fluorescensmikroskop för att säkerställa framgångsrik transduktion. Efter 72 timmar, kvantitera GFP genom flödescytometri.Anrikning av GFP-positiva celler. Expandera de transducerade cellerna genom att odla dem med en densitet av 0,5 miljoner per ml i 5 till 7 dagar och utför flödessortering med flödessorteringsinställningen inställd som hög renhet och lågt utbyte. Odla de sorterade cellerna i ett 10% RPMI-medium.Efter 72 timmar, utför eftersorteringsuppskattningen av procentandelen GFP-positiva celler för att säkerställa mer än 95% sorteringseffektivitet. Dropout screening för att identifiera epigenetiska faktorer som förmedlar läkemedelsresistens. Odla de shRNA-biblioteksöverförda cellerna i 10% RPMI i upp till 5 dagar.Centrifugera 10 miljoner celler i dubbletter. Kassera supernatanten och förvara pelletsen på minus 80 grader. Dessa prover kommer att fungera som baslinjereferens för det epigenetiska shRNA-biblioteket.Odla de återstående transducerade cellerna som dubbletter, R1 och R2, var och en bibehållen vid ett cellantal som ger en 500X representation av biblioteket. Behandla en av dubbletterna med läkemedlet, 10 mikromolärt cytarabin, och den andra utan läkemedelsbehandling. Byt medium för kolvarna med, och utan läkemedlet, var 72: e timme.Upprepa medieförändringen tre gånger för en kumulativ läkemedelsexponering på 9 dagar. Efter den 9: e dagen av läkemedelsbehandling, kontrollera cellernas livskraft med trypanblå uteslutningsmetoden. Snurra ner de återstående livskraftiga cellerna, tvätta med steril PBS och centrifug vid 280 g i 5 minuter vid rumstemperatur.Kassera supernatanten och förvara pelletsen på minus 80 för DNA-extraktion. Förstärkning av de integrerade shRNA med PCR. Extrahera DNA från de transducerade baslinjecellerna, behandlade och obehandlade celler, följt av att kontrollera koncentrationen med fluorometer, beräkna mängden DNA som krävs som visas och utsätta proverna för den första omgången PCR.PCR-reaktionsblandningen avbildas i tabell 2 med termiska cyklerbetingade. Ställ in flera reaktioner som innehåller 850 nanogram DNA per rör för totalt 43 reaktioner. Slå ihop PCR-produkterna och rena dem.Eluera produkterna i 50 mikroliter buffert och kvantifiera dem, och slutligen lagra på minus 20. För andra omgången PCR, använd omvända indexprimrar och reagenserna tabelleras i tabell 4. Ställ in fyra reaktioner med 500 nanogram av den primära PCR-produkten i en total reaktionsvolym på 50 mikroliter för varje prov tillsammans med den negativa kontrollen.Ladda hela produkten för elektrofores med 2% TBE agarosgel och bekräfta bandstorleken med en KB-molekylstege. Visualisera PCR-produkterna på geldokumentationssystemet. Punktbeskatta det specifika bandet och rena med hjälp av ett gelreningssats.Beräkningar för rening med satsen finns i tabell 3. Eluera i en slutlig volym på 30 mikroliter elueringsbuffert med den ungefärliga koncentrationen av varje elueringsmedel runt 80 till 90 nanogram per mikroliter. Nästa generations sekvensering och dataanalys.De gelrenade produkterna utsätts för nästa generations sekvensering för att erhålla läsantal för de utarmade shRNA-behoven. Trimma adaptersekvenserna, justera de filtrerade läsningarna till referenssekvenserna, ladda filerna med SAMtools för att få justeringssammanfattning. Ladda de trimmade fastQ-filerna i CRISPRCloud2 och utför analysen enligt instruktionerna.Klicka på länken för CRISPRCloud2. Välj skärmtyp som överlevnads- och avhoppsskärmar. Ange antalet grupper och skriv namnet för varje grupp.Ladda upp referensbiblioteket som FASTA-filformat. Data som laddas upp bearbetas och resultaten är tillgängliga i den angivna URL:en. Representativa data.Denna figur visar MV4-11 föräldra- och resistenta celler behandlade med ökande cytarabinkoncentration, 0,1 mikromolar till 1000 mikromolära och viabilitetsbedömning genom MTT-analys. Denna figur visar representativa flödesdiagram för GFP kvantifierade med flödescytometri i slutet av 72 timmar för humana EF-1 alfa-, humana CMV- och SFFV-promotorer. Mänsklig CMV visar vår heterogena topp medan mänsklig EF-1 alfa och SFFV visar en enda homogen topp.Denna figur visar stapeldiagrammet för de tre olika promotoreffektiviteterna i MV4-11. SFFV-driven GFP visade tystnad av GFP i långvarig kultur. hEF-1 alfa-drivna GFP-celler visade ihållande uttryck efter sortering av dessa celler.Den vänstra panelen visar transfektionseffektiviteten hos det poolade shRNA-biblioteket transfekterat i 293T i slutet av 48 timmar under fluorescensmikroskopi. Den högra panelen visar poolvirusets transduktionseffektivitet i 293T-celler med varierande virusvolymer, 2, 4 och 8 mikroliter. Denna siffra representerar transduktionseffektiviteten i MV4-11-resistent cellinje med varierande volymer virus, som 1, 1,5, 2, 2,5 mikroliter för att uppnå 30% transduktionseffektivitet.Denna figur visar sorteringen av GFP-positiva celler med 30% transduktionseffektivitet med hög renhet och låg avkastningssorteringsinställning. Figuren visar schematisk illustration av läkemedelsbehandling för GFP-positiva sorterade celler för en långvarig cytarabinexponering på 9 dagar, följt av att kontrollera livskraften och samla cellerna för DNA. Denna figur visar bindningsregionerna för primern som används i första och andra omgången av PCR.Denna figur illustrerar bandstorleken på PCR-produkten i slutet av den första omgången PCR, 397 baspar och det andra runda PCR-produkt 399-basparet, som geleluerades, renades och gavs för NGS. Denna figur illustrerar representationen av de berikade eller utarmade shRNA som riktar sig mot de epigenetiska faktorer som kan förmedla cytarabinresistens vid AML. Slutsats. Detta protokoll belyser vikten av riktad knockdown-screening för att systematiskt förhöra både väsentliga och icke-väsentliga gener och visar användningen av detta tillvägagångssätt som en funktionell plattform, vilket möjliggör identifiering av mål som är ansvariga för läkemedelsresistens.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Användning av RNA-sekvensering för att upptäcka Novel Splice varianter besläktade med drogmotstånd i<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer modeller

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flöde flödescytometri-baserade Drug Screening System för identifiering av små molekyler som främjar celldifferentiering av Glioblastoma stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Söker förare vägar av förvärvad resistens till riktad terapi: resistenta Subclone Generation och känslighet återställa av genen Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Genome-wide RNAi Screening att identifiera värd faktorer som modulerar onkolytisk Virus terapi

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation av High-Throughput tredimensionella tumör Spheroids för drogkontroll

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En kromatin Immunoprecipitation analysen identifiera roman NFAT2 målgener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Ett arbetsflöde för dataintegrering för att identifiera läkemedelskombinationer som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktioner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...