Name: pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Bu çalışma kısmen SRV'ye BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 hibe Biyoteknoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir; ve Biyoteknoloji Bölümü Hindistan BT / COE / 34 / SP13432 / 2015 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü, Hindistan: EMR / 2017 / 003880 ila P.B. RVS ve P.B. sırasıyla Wellcome DBT Hindistan İttifakı IA / S / 17/1 / 503118 ve IA / S / 15 / 1 / 501842 tarafından desteklenmektedir. S.D. CSIR-UGC bursu tarafından desteklenmektedir ve S.I. ICMR kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. Abhirup Bagchi, Sandya Rani ve CSCR Flow Cytometry Core Facility personeline yardımları için teşekkür ederiz. MedGenome Inc.'e de yüksek verimli dizileme ve veri analizine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBSC) yönergelerini takip edin ve lentivirüsü (BSL-2) işlemek için uygun tesisi kullanın. Personel, lentivirüsün kullanımı ve bertarafı konusunda uygun şekilde eğitilmelidir. Bu protokol, Vellore'deki Christian Medical College'ın biyogüvenlik yönergelerini takip etmektedir.
1. ShRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi
NOT: Deney için seçilen ...

<ol>
	<li>D&#246;hner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia:+A+comprehensive+review+and+2016+update.">Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screen+identifies+Brd4+as+a+therapeutic+target+in+acute+myeloid+leukaemia.">RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+supports+aberrant+self-renewal+in+a+mouse+model+of+MLL-AF9;NrasG12D+acute+myeloid+leukemia.">The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia.</a> Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).</li><li>Chen, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+inhibits+SIRT1-mediated+epigenetic+silencing+to+maintain+leukemic+gene+expression+in+MLL-rearranged+leukemia.">DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia.</a> Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+epigenetic+CRISPR+screen+identifies+Asf1a+as+an+immunotherapeutic+target+in+Kras-mutant+lung+adenocarcinoma.">In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma.</a> Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).</li><li>Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+of+ovarian+cancer+drug+resistance+and+resensitization.">The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).</li><li>Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+in+drug+discovery.">High throughput screening in drug discovery.</a> Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).</li><li>Lal-Nag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+model+of+the+tumor+microenvironment+for+ovarian+cancer+cell+growth.">A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 494-506 (2017).</li><li>O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+and+cancer.">Synthetic lethality and cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).</li><li>Hoffman, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+epigenetics+approach+identifies+BRM/SMARCA2+as+a+critical+synthetic+lethal+target+in+BRG1-deficient+cancers.">Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).</li><li>Fellmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microRNA+backbone+for+effective+single-copy+RNAi.">An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi.</a> Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).</li><li>Knott, S. R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+algorithm+to+predict+shRNA+potency.">A computational algorithm to predict shRNA potency.</a> Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia.">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+to+suppress+acquired+chemotherapy+resistance.">Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance.</a> Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li></ol>

RNA girişimi (RNAi), siRNA ve shRNA taramasını içeren fonksiyonel genomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. ShRNA'nın yararı, plazmid vektörlerine dahil edilebilmeleri ve genomik DNA'ya entegre edilebilmeleri, böylece kararlı ekspresyon ve dolayısıyla hedef mRNA'nın daha uzun süreli nakavtıyla sonuçlanmalarıdır. Havuzlanmış shRNA kütüphanesi taraması, geleneksel dizili ekranlara (siRNA) kıyasla sağlam ve uygun maliyetlidir. Genom çapında bir ekranda belirli bir protein sın?...

Akut miyeloid lösemide (AML) terapötik seçenekler neredeyse son elli yıldır değişmeden kalmıştır ve sitarabin (AraC) ve antrasiklinler hastalığın tedavisinde temel taşı olarak kullanılmıştır. AML tedavisinin başarısındaki zorluklardan biri, lösemik kök hücrelerin kemoterapiye direncidir ve bu da hastalığın nüksetmesine yol açar 1,2. Epigenetik regülasyon kanser patogenezinde ve ilaç direncinde hayati bir rol oynamaktadır ve umut verici terapötik hedefler olarak çeşitli epigenetik faktörler ortaya çıkmıştır 3,4,5. Epigenetik düzenleyici mekanizmalar, kemoterapötik ilaçlara sürekli maruz kalma durumunda proliferasyonu ve sağkalımı etkilemektedir. Hematolojik olmayan malignitelerde yapılan çalışmalar, ilaç etkisinin üstesinden gelen hücrelerin küçük bir kısmının çeşitli epigenetik modifikasyonlara uğradığını ve bu hücrelerin hayatta kalmasına neden olduğunu bildirmiştir 6,7. Bununla birlikte, epigenetik faktörlerin AML'de sitarabina karşı edinilmiş dirence aracılık etmedeki rolü araştırılmamıştır.
Yüksek verimli tarama, zamanla küresel önem kazanmış ve hücresel mekanizmalarda, yol profillemede ve moleküler düzeydepotansiyel hedefleri tanımlamak için farklı yönlerden standart bir yöntem haline gelen ilaç keşfine bir yaklaşımdır 8,9. Sentetik öldürücülük kavramı, her iki genin de tek başına pertürbasyonunun canlı olduğu, ancak her iki genin aynı anda canlılık kaybına neden olduğu iki gen arasındaki etkileşimi içerir10. Kanser tedavisinde sentetik öldürücülüğün kullanılması, sağlam sentetik öldürücü genetik etkileşimlerin tanımlanmasına ve mekanik olarak karakterize edilmesine yardımcı olabilir11. AML'de edinilmiş sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörleri tanımlamak için sentetik öldürücülüğe sahip yüksek verimli shRNA taramasının kombinatoryal bir yaklaşımını benimsedik.
Karışık soy lösemi geninin (MLL veya KMT2A) kromozomal translokasyonu ile yönlendirilen akut lösemilerin, hastalarda kötü sağkalım ile ilişkili olduğu bilinmektedir. MLL gen yeniden düzenlemelerinin ortaya çıkan kimerik ürünleri, yani MLL füzyon proteinleri (MLL-FP'ler), hematopoetik kök / progenitör hücreleri (HSPC'ler) çoklu epigenetik faktörlerin katılımıyla lösemik patlamalara dönüştürebilir. Bu epigenetik düzenleyiciler, lösemi programının sürdürülmesini belirleyen karmaşık bir ağ oluşturur ve bu nedenle potansiyel terapötik hedefler oluşturabilir. Bu bağlamda, MV4-11 AraC R olarak adlandırılan edinilmiş sitarabin dirençli hücre hattını geliştirmek için MV4-11 hücre hattını (FLT3-ITD mutasyonu ile MLL füzyon geni MLL-AF4'ü barındıran; MV4-11 P olarak adlandırılır) kullandık. Hücre hattı, ilaç tatili olarak bilinen ilaç tedavisinden aralıklı iyileşme ile artan dozlarda sitarabin'e maruz kaldı. Yarı-maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) in vitro sitotoksisite testi ile değerlendirildi.
Bir pZIP lentiviral omurgaya sahip hEF1a promotörü tarafından yönlendirilen havuzlanmış epigenetik shRNA Kütüphanesini (bkz. Bu kütüphane, 407 epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'lardan oluşur. Her faktörde 5-24 shRNA bulunur ve beş hedeflemeyen kontrol shRNA'sı da dahil olmak üzere toplam 5.485 shRNA bulunur. Modifiye edilmiş "UltrmiR" miR-30 iskelesi, verimli primer shRNA biyogenezi ve ekspresyonu12,13 için optimize edilmiştir.
Bu deneyin ana hatları Şekil 1A'da gösterilmiştir. Mevcut protokol, bir süspansiyon hücre hattı olan MV4-11 AraC R hücre hattındaki epigenetik faktör shRNA kütüphanesini kullanarak RNAi taramasına odaklanmaktadır (Şekil 1B). Bu protokol, kişinin seçtiği herhangi bir ilaca dirençli hücre hattındaki hedeflenen herhangi bir kütüphaneyi taramak için kullanılabilir. Transdüksiyon protokolünün yapışkan hücreler için farklı olacağına dikkat edilmelidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder Hyper Ladder</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza Seachekm</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B03001VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>12005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plasticware</td>
			<td>Corning</td>
			<td>as appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MP BIO</td>
			<td>91233354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Wak Chemie GMBH</td>
			<td>Cryosure DMSO 10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510-10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR Purification Kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>REF&#160;740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco- RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23400021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Q11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMV GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEF1a GFPlasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL60 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Hot Start Polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molm13 cell line</td>
			<td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td>Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV4-11 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-9591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 and pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene plasmid no.12260 &#38; Addgene plasmid no. 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>REF Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFFV&#160; GFP Plasmid</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>TransOmics Promoter selection KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td>
			<td>Transomics</td>
			<td>Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-IT-LTI Mirus</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>Mirus Catalog Number: MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219485591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;103319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Aria III cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Multiguge 3SR+</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging system&#160;(Fluro Chem M system)</td>
			<td>Fluro Chem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF600</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled shrna library screening to identify factors that modulate a drug resistance phenotype

Kazanılmış kemo-direncin klinik olarak ilgili itici mekanizmalarını anlamak, akut miyeloid lösemili (AML) hastalarda direnci atlatmanın ve sağkalımı iyileştirmenin yollarını aydınlatmak için çok önemlidir. Kemoterapiden kurtulan lösemik hücrelerin küçük bir kısmı, kemoterapötik hakareti tolere etmek için hazır bir epigenetik duruma sahiptir. Kemoterapiye daha fazla maruz kalmak, bu ilaç persister hücrelerin sabit bir epigenetik duruma ulaşmasını sağlar, bu da değişmiş gen ekspresyonuna yol açar, bu da ilaca dirençli popülasyonların çoğalmasına ve sonunda nüks veya refrakter hastalığa neden olur. Bu nedenle, ilaca dirençli lösemik hücrelerin sağkalımını gerektiren epigenetik modülasyonların belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Kazanılmış bir sitarabin-dirençli AML hücre hattında havuzlanmış shRNA kütüphanesi taramasını kullanarak nükleozid analog sitarabin'e (AraC) dirence aracılık eden epigenetik modülatörleri tanımlamak için bir protokol detaylandırıyoruz. Kütüphane, yüksek verimli epigenetik faktör taramasına izin veren 407 insan epigenetik faktörünü hedefleyen 5.485 shRNA yapısından oluşmaktadır.

Genel tarama iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. MV4-11 AraC R'nin (48 h) in vitro sitotoksisitesi, MV4-11 AraC R'deki IC50'nin sitarabine, MV4-11 P'den daha yüksek olduğunu ortaya koydu (Şekil 1B). Bu hücre hattı çalışmada sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörlerin taranmasında model olarak kullanılmıştır.
Şekil 2A , doğrusallaştırılmış pZ...

Watch this Scientific Journal Video about Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype at JoVE.com

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.

Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Aşağıdaki videonun genel amacı, negatif bir seçim taraması yapmak için havuzlanmış shRNA epigenetik kütüphanesinin kullanımını göstermektir. Bu tarama, dizileme yoluyla spesifik epigenetik hedeflerin belirlenmesini sağlar. Bu prosedür, AML'de edinilmiş sitarabin direncine aracılık etmekten sorumlu epigenetik faktörlerin tanımlanmasına yardımcı olabilir Adımlar aşağıdaki gibidir.ShRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi. Mevcut protokol, sitarabin dirençli MV4-11 hücre hattında epigenetik faktör shRNA kütüphanesi kullanılarak RNAi taramasına odaklanmaktadır. Bu amaçla kullanılan promotörler, yeşil floresan proteinini eksprese eden insan EF-1 alfa, insan CMV ve SFFV'dir.Tripan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücre sayısını alın. Hücreleri, mL polibren başına 8 mikrogram içeren% 10 RPMI ortamında askıya alın. Üçlü olarak altı kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına 1.5 ml ortamda 1 milyon hücre tohumlayın.Farklı hacimlerde konsantre lentivirüsler ekleyin. Örneğin, lentivirüsler, örneğin, lentivirüslerin her bir kuyucuğa titresine bağlı olarak 10, 20 ve 40 mikrolitre. İçeriği karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.90 dakika boyunca 37 santigrat derecede 920 g'da santrifüjleme ile spinfenfeksiyon gerçekleştirin. Plakaları hemen bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. GFP'yi 48 saatin sonunda gözlemleyin ve 72 saatin sonunda da aynısını ölçün.Ardından, kültür genelinde tutarlı GFP ifadesi gösteren destekçiyi seçmek için akış şemasında gösterilen adımları izleyin. Havuzlanmış lentiviral insan epigenetik faktör shRNA kütüphanesinin hazırlanması. Her plakada 8 ml% 10 DMFM ortamı bulunan üç adet 10 santimetrelik hücre kültürü kabında iyi bir proliferasyon oranına sahip düşük bir geçiş numarasında kültür 293T hücreleri.Hücreler% 60 akıcılığa ulaştığında, tamamen taze ortamla değiştirin. Serumsuz ortam, lentiviral ambalaj plazmidi PAX2, zarf plazmidi pMD2 içeren transfeksiyon karışımını ana hatlarıyla hazırlayın. G, havuzlanmış kütüphane plazmidleri ve son olarak transfeksiyon reaktifi.İyice karıştırmak için karışıma dokunun ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Transfeksiyon karışımını 293T hücrelerine ekleyin ve plakaları döndürerek yavaşça karıştırın. Plakaları bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin.24 saat sonra ortamı değiştirin. 48 saat sonra, 293T hücrelerine yüksek transfeksiyon verimliliği sağlamak için bir floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunu kontrol edin. Virüs süpernatantlarını 48, 60 ve 72 saat sonra toplayın ve 4 derecede saklayın ve virüsü topladıktan sonra her zaman noktasında taze ortam, 8ml ekleyin.Havuza alınan virüsleri 0,4 mikron filtre ile filtreleyin. Yüksek bir virüs titresi elde etmek için, havuzlanmış virüsleri ultrasantrifüjleme ile konsantre edin. Filtrelenmiş virüs süpernatantlarını 70 Ti tüpüne aktarın ve 2 saat boyunca 18.000 g'da santrifüj yapın.Ön soğutmalı rotor ve santrifüj 4 derecede kullanın. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın ve süpernatantı tamamen çıkarın. Peleti FBS ve antibiyotik olmadan 400 mikrolitre DMEM'de bir mikropipet kullanarak nazikçe askıya alın, 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.Virüsleri alikote edin ve eksi 80 derecede dondurun. Gösterildiği gibi virüsün konsantrasyonunu hesaplayın. Lentivirüslerin transdüksiyon etkinliğinin tahmini.Lentivirüsün başarılı bir şekilde hazırlandığını doğrulamak için 293T hücrelerini farklı hacimlerde, 2, 4 ve 8'de konsantre bir virüsle dönüştürün. Hedef hücre hattında bir titrasyon deneyi gerçekleştirmek için konsantre virüsün değeri 100X'tir. Tohum 1.5 ml% 10 RPMI ortamında, altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda ml başına 8 mikrogram polibren içeren.Dört farklı hacim, 1, 1.5, 2, 2.5 mikrolitre 100X virüs ekleyin. 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca plakanın 920 g'da santrifüjlenmesiyle serpinti yapın. 72 saat sonra, GFP pozitif hücrelerin yüzdesini akış sitometrisi ile ölçün.%30 iletim verimliliği elde etmek için virüslerin hacmini belirleyin. Bu düşük iletim verimliliği, hücre başına tek shRNA entegrasyonu sağlamaktır. Havuzlanmış epigenetik shRNA kütüphanesinin ilaca dirençli hücre hattında transdüksiyonu.Deney için alınacak hücre sayısını, viral integrantların sayısına göre aşağıdaki gibi hesaplayın. %10 RPMI ortamının 16 ML'sinde 11 milyon hücreyi yeniden askıya alın. Polibren ekleyin, ml başına sekiz mikrogram ve iyice karıştırın ve daha önce hesaplandığı gibi% 30 iletim verimliliği elde etmek için gerekli virüs hacmini ekleyin.Tüm hücreleri, kuyucuk başına 1.5 ml başına 1 milyon hücre yoğunluğunda altı kuyucuklu bir plakada tohumlayın. Plakayı 37 santigrat derecede 920 g'da 90 dakika boyunca santrifüj edin. Plakayı bir karbondioksit inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.24 saat sonra, ortamı değiştirin ve dönüştürülmüş hücreleri bir T-75 şişesine aktarın. 48 saat sonra, başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP'yi bir floresan mikroskobu altında kontrol edin. 72 saat sonra, GFP'yi akış sitometrisi ile sayın.GFP pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi. Dönüştürülen hücreleri 5 ila 7 gün boyunca ml başına 0,5 milyon yoğunlukta kültürleyerek genişletin ve akış sıralama ayarı yüksek saflık ve düşük verim olarak ayarlanarak akış ayıklama gerçekleştirin. Sıralanmış hücreleri% 10 RPMI ortamında kültürleyin.72 saat sonra, %95'ten fazla ayıklama verimliliği sağlamak için GFP pozitif hücrelerinin yüzdesinin sıralama sonrası tahminini gerçekleştirin. İlaç direncine aracılık eden epigenetik faktörleri tanımlamak için bırakma taraması. ShRNA kütüphanesine dönüştürülmüş hücreleri 5 güne kadar %10 RPMI'da kültürleyin.10 milyon hücreyi kopyalar halinde santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peletleri eksi 80 derecede saklayın. Bu örnekler epigenetik shRNA kütüphanesi için temel referans görevi görecektir.Kalan dönüştürülmüş hücreleri, her biri kitaplığın 500X temsilini sağlayan bir hücre sayısında tutulan kopyalar olarak R1 ve R2 olarak kültürleyin. Kopyalardan birini ilaçla, 10 mikromolar sitarabinle, diğerini ise ilaç tedavisi olmadan tedavi edin. Şişelerin ortamını her 72 saatte bir ilaçla ve ilaçsız olarak değiştirin.9 günlük kümülatif ilaç maruziyeti için orta değişimi üç kez tekrarlayın. İlaç tedavisinin 9. gününden sonra, tripan mavisi dışlama yöntemi ile hücrelerin canlılığını kontrol edin. Kalan canlı hücreleri döndürün, steril PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 g'da santrifüj yapın.Süpernatantı atın ve DNA ekstraksiyonu için peletleri eksi 80'de saklayın. Entegre shRNA'ların PCR ile amplifikasyonu. DNA'yı dönüştürülmüş bazal hücrelerden, işlenmiş ve tedavi edilmemiş hücrelerden çıkarın, ardından florometre kullanarak konsantrasyonu kontrol edin, gösterildiği gibi gerekli DNA miktarını hesaplayın ve örnekleri PCR'nin ilk turuna tabi tutun.PCR reaksiyon karışımı tablo 2'de termal döngü koşulları ile gösterilmiştir. Toplam 43 reaksiyon için tüp başına 850 nanogram DNA içeren çoklu reaksiyonlar ayarlayın. PCR ürünlerini bir araya getirin ve saflaştırın.Ürünleri 50 mikrolitrelik tamponda süzün ve miktarını ölçün ve son olarak eksi 20'de saklayın. İkinci tur PCR için, ters indeks primerleri kullanın ve reaktifler tablo 4'te tablolaştırılmıştır. Negatif kontrol ile birlikte her numune için toplam 50 mikrolitre reaksiyon hacminde birincil PCR ürününün 500 nanogramı ile dört reaksiyon ayarlayın.Tüm ürünü elektroforez için% 2 TBE agaroz jeli kullanarak yükleyin ve bant boyutunu bir KB molekül merdiveni ile onaylayın. PCR ürünlerini jel dokümantasyon sisteminde görselleştirin. Belirli bandı tüketin ve bir jel saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.Kit ile saflaştırma için hesaplamalar tablo 3'te verilmiştir. 30 mikrolitre elüsyon tamponunun son hacminde, her bir elüentin yaklaşık konsantrasyonu mikrolitre başına 80 ila 90 nanogram civarında sülte edilir. Yeni nesil sıralama ve veri analizi.Jel saflaştırılmış ürünler, tükenmiş shRNA ihtiyaçları için okuma sayıları elde etmek üzere yeni nesil dizilemeye tabi tutulur. Bağdaştırıcı dizilerini kırpın, filtrelenmiş okumaları referans dizilerine hizalayın, hizalama özeti elde etmek için SAMtools'u kullanarak dosyaları yükleyin. Kırpılmış fastQ dosyalarını CRISPRCloud2'ye yükleyin ve analizi talimatlara göre gerçekleştirin.CRISPRCloud2 için sağlanan bağlantıya tıklayın. Ekran türünü Hayatta Kalma ve Bırakma ekranları olarak seçin. Grup sayısını ayarlayın ve her grubun adını yazın.Referans kitaplığını FASTA dosya formatı olarak yükleyin. Yüklenen veriler işlenir ve sonuçlar verilen URL'de mevcuttur. Temsili veriler.Bu şekil, artan sitarabin konsantrasyonu, 0.1 mikromolar ila 1.000 mikromolar ve MTT testi ile canlılık değerlendirmesi ile tedavi edilen MV4-11 ebeveyn ve dirençli hücreleri göstermektedir. Bu şekil, insan EF-1 alfa, insan CMV ve SFFV promotörleri için 72 saatin sonunda akış sitometrisi ile ölçülen GFP'nin temsili akış grafiklerini göstermektedir. İnsan CMV'si heterojen zirvemizi gösterirken, insan EF-1 alfa ve SFFV tek bir homojen tepe noktası gösterir.Bu şekilde, MV4-11'deki üç farklı promotör verimliliği için çubuk grafik gösterilmektedir. SFFV güdümlü GFP, uzun süreli kültürde GFP'nin susturulduğunu gösterdi. hEF-1 alfa güdümlü GFP hücreleri, bu hücrelerin sıralanmasından sonra sürekli ekspresyon gösterdi.Sol panel, floresan mikroskobu altında 48 saat sonunda 293T'de transfekte edilen havuzlanmış shRNA kütüphanesinin transfeksiyon verimliliğini göstermektedir. Sağ panel, değişen virüs hacimlerine, 2, 4 ve 8 mikrolitreye sahip 293T hücrelerinde havuz virüsünün transdüksiyon verimliliğini gösterir. Bu şekil,% 30 iletim verimliliği elde etmek için 1, 1.5, 2, 2.5 mikrolitre gibi değişen virüs hacimlerine sahip MV4-11 dirençli hücre hattındaki transdüksiyon verimliliğini temsil eder.Bu şekil, GFP pozitif hücrelerinin %30 iletim verimliliği ile yüksek saflıkta ve düşük verimli ayıklama ayarında sıralanmasını göstermektedir. Şekil, 9 günlük uzun süreli sitarabin maruziyeti için GFP pozitif sıralanmış hücreler için ilaç tedavisinin şematik gösterimini göstermektedir, ardından canlılığı kontrol etmek ve DNA için hücreleri toplamak suretiyle gösterilmiştir. Bu şekil, PCR'nin birinci ve ikinci turunda kullanılan astarın bağlanma bölgelerini göstermektedir.Bu şekil, birinci tur PCR, 397 baz çifti ve jel salınımlı, saflaştırılmış ve NGS için verilen ikinci tur PCR ürünü 399 baz çiftinin sonundaki PCR ürününün bant boyutunu göstermektedir. Bu şekil, AML'de sitarabin direncine aracılık edebilecek epigenetik faktörleri hedef alan zenginleştirilmiş veya tükenmiş shRNA'ların temsilini göstermektedir. Son. Bu protokol, hem temel hem de gerekli olmayan genleri sistematik olarak sorgulamak için hedefli nakavt taramasının önemini vurgulamakta ve bu yaklaşımın ilaç direncinden sorumlu hedeflerin belirlenmesine izin veren işlevsel bir platform olarak kullanıldığını göstermektedir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedefleyen İlaç Kombinasyonlarını Tanımlamak için Veri Entegrasyonu İş Akışı

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...