Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

نشكر كارلوس أوسكار سورزانو على المساعدة في تثبيت Scipion3 وكيليان شنيل وآرني مولر للمساعدة في نقل البيانات بين منصات المعالجة المختلفة. تم دعم جزء من هذا البحث من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة U24GM129547 وتم إجراؤه في PNCC في OHSU وتم الوصول إليه من خلال EMSL (grid.436923.9) ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة بدء التشغيل من جامعة روتجرز إلى Arek Kulczyk.

1. إنشاء مشروع cryoSPARC v3 جديد واستيراد البيانات
ملاحظة: تم الحصول على البيانات في جامعة أوريغون للصحة والعلوم (OHSU) في بورتلاند باستخدام مجهر إلكتروني تيتان كريوس بقوة 300 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكترون مباشر من طراز فالكون 3. تم جمع الصور في وضع العد بجرعة إجمالية قدرها 28.38 e...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

في هذه المقالة ، نقدم سير عمل SPA قويا لمعالجة بيانات cryo-EM عبر منصات برمجية مختلفة لتحقيق عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (الشكل 1). ينطبق سير العمل هذا على مجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية الكبيرة. وترد الخطوات اللاحقة للبروتوكول في الشكل 4، ب...

يتيح الفحص المجهري الإلكتروني المبرد (cryo-EM) وتحليل الجسيمات المفردة (SPA) تحديد بنية مجموعة واسعة من التجمعات الجزيئية الحيوية في حالتها المائية ، مما يساعد على إلقاء الضوء على أدوار هذه الجزيئات الكبيرة بالتفصيل الذري. جعلت التحسينات في بصريات المجهر وأجهزة الكمبيوتر وبرامج معالجة الصور من الممكن تحديد هياكل الجزيئات الحيوية بدقة تتجاوز 2 Å1,2,3. تم إيداع أكثر من 2,300 هيكل من هياكل التبريد EM في بنك بيانات البروتين (PDB) في عام 2020 ، مقارنة ب 192 بنية في عام 20144 ، مما يشير إلى أن cryo-EM أصبح الطريقة المفضلة للعديد من علماء الأحياء الهيكلية. هنا ، نصف سير عمل يجمع بين ثلاثة برامج SPA مختلفة لتحديد بنية عالية الدقة (الشكل 1).
الهدف من SPA هو إعادة بناء أحجام 3D من عينة مستهدفة من صور 2D صاخبة مسجلة بواسطة كاشف المجهر. تجمع أجهزة الكشف الصور كأفلام ذات إطارات فردية من نفس مجال الرؤية. من أجل الحفاظ على العينة ، يتم جمع الإطارات بجرعة إلكترون منخفضة وبالتالي يكون لها نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة (SNR). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي التعرض للإلكترون إلى تحفيز الحركة داخل شبكات التبريد EM المزججة، مما يؤدي إلى عدم وضوح الصورة. للتغلب على هذه المشكلات ، تتم محاذاة الإطارات لتصحيح الحركة التي يسببها الشعاع ومتوسطها لإنتاج ميكروغراف مع زيادة SNR. ثم تخضع هذه المجهر لتقدير دالة نقل التباين (CTF) لحساب آثار عدم التركيز البؤري والانحرافات التي يفرضها المجهر. من الصور المجهرية المصححة بواسطة CTF ، يتم اختيار الجسيمات الفردية واستخراجها وفرزها في متوسطات فئة 2D تمثل اتجاهات مختلفة اعتمدتها العينة في الجليد الزجاجي. يتم استخدام مجموعة الجسيمات المتجانسة الناتجة كمدخلات لإعادة بناء ab initio 3D لإنشاء نموذج أو نماذج خشنة ، والتي يتم تكريرها بعد ذلك بشكل متكرر لإنتاج واحد أو أكثر من الهياكل عالية الدقة. بعد إعادة الإعمار، يتم إجراء تحسينات هيكلية لزيادة تحسين جودة ودقة خريطة cryo-EM. وأخيرا، إما أن يكون النموذج الذري مشتقا مباشرة من الخريطة، أو أن الخريطة مزودة بإحداثيات ذرية تم الحصول عليها في مكان آخر.
تتوفر حزم برامج مختلفة لإنجاز المهام الموضحة أعلاه ، بما في ذلك Appion5 و cisTEM6 و cryoSPARC7 و EMAN8 و IMAGIC9 و RELION10 و Scipion11 و SPIDER12 و Xmipp13 وغيرها. في حين أن هذه البرامج تتبع خطوات معالجة مماثلة، فإنها تستخدم خوارزميات مختلفة، على سبيل المثال، لاختيار الجسيمات، وإنشاء نماذج أولية، وتحسين عمليات إعادة البناء. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب هذه البرامج مستوى متفاوتا من معرفة المستخدم والتدخل للعمل ، حيث يعتمد بعضها على ضبط المعلمات التي يمكن أن تكون بمثابة عقبة أمام المستخدمين الجدد. وغالبا ما تؤدي هذه التناقضات إلى خرائط ذات جودة ودقة غير متناسقتين عبر المنصات14، مما يدفع العديد من الباحثين إلى استخدام حزم برامج متعددة لتحسين النتائج والتحقق من صحتها. في هذه المقالة ، نسلط الضوء على استخدام cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ل AAV ، وهو ناقل يستخدم على نطاق واسع للعلاج الجيني 15. حزم البرامج المذكورة أعلاه مجانية للمستخدمين الأكاديميين. يتطلب cryoSPARC v3 و Scipion 3 تراخيص.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

جعلت التطورات الحديثة في كل من الأجهزة وبرامج معالجة الصور المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) الطريقة المفضلة لعلماء الأحياء الهيكلية لتحديد الهياكل عالية الدقة لمجموعة واسعة من الجزيئات الكبيرة. تتوفر مجموعات برامج متعددة للمستخدمين الجدد والخبراء لمعالجة الصور وحساب الهيكل ، مما يبسط نفس سير العمل الأساسي: تخضع الأفلام التي يتم الحصول عليها بواسطة كاشفات المجهر للتصحيح لتقدير وظيفة الحركة ونقل التباين (CTF) الناجم عن الحزمة. بعد ذلك ، يتم اختيار صور الجسيمات واستخراجها من إطارات الأفلام المتوسطة للتصنيف التكراري 2D و 3D ، تليها إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والصقل والتحقق من الصحة. نظرا لأن حزم البرامج المختلفة تستخدم خوارزميات مختلفة وتتطلب مستويات مختلفة من الخبرة للعمل ، فإن خرائط 3D التي تولدها غالبا ما تختلف في الجودة والدقة. وبالتالي ، يقوم المستخدمون بنقل البيانات بانتظام بين مجموعة متنوعة من البرامج للحصول على أفضل النتائج. توفر هذه الورقة دليلا للمستخدمين للتنقل في سير العمل عبر حزم البرامج الشائعة: cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على بنية دقة شبه ذرية للفيروس المرتبط بالغدة الدرقية (AAV). نقوم أولا بتفصيل خط أنابيب معالجة الصور باستخدام cryoSPARC v3 ، حيث تسمح خوارزمياته الفعالة وواجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام للمستخدمين بالوصول بسرعة إلى خريطة ثلاثية الأبعاد. في الخطوة التالية ، نستخدم PyEM والبرامج النصية الداخلية لتحويل ونقل إحداثيات الجسيمات من أفضل جودة لإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها في cryoSPARC v3 إلى RELION-3 و Scipion 3 وإعادة حساب الخرائط ثلاثية الأبعاد. وأخيرا، نحدد خطوات لمزيد من التحسين والتحقق من صحة الهياكل الناتجة من خلال دمج خوارزميات من RELION-3 و Scipion 3. في هذه المقالة ، نصف كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات معالجة لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات البيانات لتحديد الهيكل عالي الدقة.

لقد قدمنا خط أنابيب SPA شامل للحصول على هيكل عالي الدقة باستخدام ثلاث منصات معالجة مختلفة: cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3. يلخص الشكل 1 والشكل 4 سير عمل المعالجة العام، ويفصل الجدول 1 بروتوكولات التحسين. تم استخدام هذه البروتوكولات أثناء تحسينات هيكل 2.3 Å من AAV ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

توضح هذه المقالة كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات لمعالجة cryo-EM ، أي cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 ، لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات بيانات الجسيمات المفردة لتحديد بنية عالية الدقة.

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات هو طريقة للتحديد المنظم للجزيئات الكبيرة عند دقة ذرية قريبة. تتوفر حزم برامج متعددة لمعالجة الصور وحسابات البنية ، ولكن النتيجة على خرائط 3D غالبا ما تختلف في الجودة والدقة بسبب الاختلافات في الخوارزميات المطبقة أثناء الحسابات. وبالتالي ، فإن استخدام مجموعة من البرامج المختلفة غالبا ما يكون مفيدا لتحقيق أفضل النتائج.يوجه هذا البروتوكول المستخدمين للتنقل في سير العمل عبر ثلاث منصات مختلفة لمعالجة cryo-EM: CryoSPARC و RELION و Scipion. سنوضح كيفية استخدام خط الأنابيب هذا للحصول على بنية عالية الدقة للفيروس المرتبط بالغدي وهو ناقل يستخدم على نطاق واسع للعلاج الجيني. بعد فتح CryoSPARC v3 في متصفح ويب وإنشاء مساحة عمل للمشروع ، انتقل إلى مساحة العمل الجديدة وافتح منشئ الوظائف على اللوحة اليمنى.انقر فوق استيراد الأفلام وقم بتوفير مسار الأفلام والحصول على مسار ملف مرجعي. ثم قم بتعيين معلمات الاستحواذ. بعد ذلك ، انقر فوق قائمة الانتظار ، وحدد مسارا لتشغيل المهمة ومساحة عمل وانقر فوق إنشاء.افتح تصحيح حركة التصحيح وبطاقة مهمة استيراد الأفلام. ثم اسحب إخراج imported_movies إلى العنصر النائب للأفلام في المهمة الجديدة وقم بانتظار المهمة. لتنفيذ دالة نقل التباين أو تقدير CTF، افتح تقدير CTF للتصحيح.أدخل الصور المجهرية التي تم إنشاؤها وقم بانتظار المهمة. لفحص الصور المجهرية المتوسطة والمصححة من CTF وتحديد مجموعة فرعية لمزيد من المعالجة ، افتح التعرضات التنظيمية ، وأدخل التعرضات التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة وقم بانتظار المهمة. بعد دخول الوظيفة في وضع الانتظار ، انقر فوق علامة التبويب التفاعلية على بطاقة الوظيفة.اضبط عتبات المعلمات واقبل أو ارفض الصور المجهرية الفردية لمزيد من المعالجة. أثناء معالجة البيانات الحالية ، اضبط العتبة العليا للاستجماتيزم على 400 أنغستروم ، ودقة CTF تناسب خمسة أنغستروم وسماكة الجليد النسبية إلى اثنين. ثم انقر فوق تم لتحديد المجهر للمعالجة النهائية.للانتقاء اليدوي، افتح أداة الانتقاء اليدوي. أدخل التعرضات المقبولة وقم بانتظار المهمة. ثم انقر فوق علامة التبويب التفاعلية ، واضبط حجم الصندوق على 300 بكسل وانقر على بضع مئات من الجسيمات عبر صور مجهرية متعددة ، وتجنب الجسيمات المتداخلة.بمجرد الانتهاء من الاختيار ، انقر فوق الانتهاء من اختيار جزيئات الاستخراج. بعد ذلك ، لإنشاء قوالب لاختيار الجسيمات تلقائيا ، انقر فوق تصنيف 2D وأدخل اختيارات الجسيمات التي تم إنشاؤها. ثم قم بتغيير عدد فئات 2D إلى 10 وقم بانتظار المهمة.بعد ذلك ، افتح فئات 2D المحددة وأدخل الجسيمات ومتوسطات الفئات التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة. ثم انقر فوق علامة التبويب التفاعلية ، وحدد فئات 2D التمثيلية مع نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة وانقر فوق تم. لاختيار الجسيمات المستندة إلى القالب ، افتح منتقي القوالب وأدخل فئات 2D المحددة والرسوم البيانية المجهرية.ثم اضبط قطر الجسيم على 220 أنغستروم واصطف في قائمة انتظار المهمة. أخيرا ، افتح المستخلص من الصور المجهرية وأدخل الصور المجهرية والجسيمات التي تم الحصول عليها من فحص مختارات الجسيمات. ثم اضبط حجم المربع المستخرج على 300 بكسل وقم بانتظار المهمة.للتصنيف 2D ، انقر فوق تصنيف 2D وأدخل الجسيمات المستخرجة. ثم قم بتعيين عدد فئات 2D إلى 50 وقم بانتظار المهمة. بعد ذلك ، افتح فئات 2D المحددة وأدخل الجسيمات التي تم الحصول عليها ومتوسطات الفئات.انقر فوق علامة التبويب التفاعلية. اختر فئات 2D بناء على الدقة وعدد الجسيمات في الفئة وانقر فوق تم. لإنشاء وحدة تخزين 3D أولية ، افتح إعادة بناء ab-initio وأدخل الجسيمات من التصنيف النهائي 2D.ثم اضبط التماثل على icosahedral واصطف في قائمة الانتظار. بعد ذلك ، افتح الصقل المتجانس ، وأدخل الحجم من الخطوة السابقة والجسيمات من التصنيف النهائي 2D. ثم قم بتغيير التماثل وقم بانتظار المهمة.عند الانتهاء من المهمة ، افحص ارتباط غلاف فورييه أو منحنى FSC وقم بتنزيل وحدة التخزين لفحصها في UCSF Chimera. في CryoSPARC v3 ، افتح بطاقة المهمة الخاصة بوظيفة فئة 2D المحددة من التصنيف ثنائي الأبعاد النهائي. ثم في علامة التبويب التفاصيل ، انقر فوق مهمة التصدير.باستخدام PyEM ، قم بتحويل particles_exported. ملف cs إلى تنسيق نجمة عن طريق تنفيذ الأمر المشار إليه. بعد النقر فوق استخراج الجسيمات، في علامة التبويب إدخال/إخراج، أدخل المجهر والإحداثيات المصححة من CTF.ثم انقر فوق علامة التبويب استخراج ، وقم بتغيير حجم مربع الجسيمات إلى 300 بكسل وقم بتشغيل المهمة. لتحسين ثلاثي الأبعاد ، استخدم الخريطة التي تم إنشاؤها في CryoSPARC v3 كنموذج أولي في RELION-3. حدد طريقة الاستيراد وقم بتعيين المعلمات المشار إليها في علامة التبويب إدخال/إخراج.ثم في علامة التبويب الآخرين ، حدد خريطة CryoSPARC v3 كملف إدخال ، وقم بتغيير نوع العقدة إلى مرجع ثلاثي الأبعاد وقم بتشغيل المهمة. بعد ذلك ، حدد التحسين التلقائي 3D وفي علامة التبويب I / O ، قم بتعيين صور الإدخال كجسيمات. ملف نجمة من مهمة التحديد الأخيرة.استخدم إعادة بناء CryoSPARC v3 كخريطة مرجعية ، وانقر فوق علامة التبويب المرجعية وقم بتغيير مرشح التمرير المنخفض الأولي إلى 50 angstroms والتماثل إلى icosahedral. ثم في علامة التبويب التحسين ، قم بتغيير قطر القناع إلى 280 angstroms وقم بتشغيل المهمة. للمعالجة اللاحقة ، انقر فوق المعالجة اللاحقة.وفي علامة التبويب الإدخال/الإخراج، أدخل الخرائط النصفية والقناع اللذين تم إنشاؤهما واضبط حجم البكسل المعاير على 1.045 أنغستروم. ثم في علامة التبويب شحذ ، لتقدير B-factor تلقائيا ، أدخل نعم. للحصول على أقل دقة لملاءمة B التلقائية، أدخل 10.ولاستخدام عامل B الخاص بك ، رقم الإدخال. أخيرا ، في علامة التبويب عامل التصفية ، قم بتعيين تخطي ترجيح FSC إلى لا وقم بتشغيل المهمة. للتدريب على التلميع ، افتح تلميع بايزي.وفي علامة التبويب الإدخال/الإخراج، أدخل الصور المجهرية والجسيمات وPostProcess المصححة للحركة. ملف نجمة تم الحصول عليه سابقا. انقر فوق علامة التبويب التدريب واضبط معلمات التدريب المثلى على نعم ، جزء من وحدات بكسل فورييه للاختبار إلى 0.5 واستخدم هذا العدد الكبير من الجسيمات إلى 5000.ثم قم بتشغيل الوظيفة. بمجرد الانتهاء من مهمة التدريب ، انقر فوق تلميع بايزي. ثم في علامة التبويب التدريب ، قم بتعيين معلمات التدريب المثلى إلى لا.حدد علامة التبويب البولندية وفي ملف المعلمة المحسن ، حدد المسار إلى opt_params_all_groups. txt من الخطوة السابقة وانقر على تشغيل. لتقدير انحرافات الترتيب الأعلى، افتح تحسين CTF.وفي علامة التبويب الإدخال/الإخراج ضمن الجسيمات، حدد المسار إلى ملف النجمة الذي يحتوي على جزيئات مصقولة من وظيفة 3D المكررة الأخيرة. ثم ضمن ملف STAR بعد العملية، قم بتعيين المسار إلى الإخراج من أحدث مهمة ما بعد المعالجة. بعد ذلك ، حدد علامة التبويب ملائمة واضبط تقدير التكبير المتباين إلى لا.أداء CTF معلمة مناسبة ل لا. تقدير إمالة الشعاع إلى نعم. أيضا تقدير trefoil إلى نعم.وتقدير انحرافات من الدرجة الرابعة إلى نعم. ثم قم بتشغيل الوظيفة. لمزيد من تحسين خريطة RELION-3 والتحقق من صحتها ، قم بتشغيل Scipion 3 وإنشاء مشروع جديد.في لوحة البروتوكولات اليمنى، حدد القائمة المنسدلة الواردات وانقر على استيراد الجسيمات. تغيير استيراد المعلمات من إلى RELION-3 وملف نجمة إلى postprocess.star. ثم حدد معلمات الاستحواذ كما هو موضح سابقا وانقر فوق تنفيذ.بعد ذلك ، انقر فوق القائمة المنسدلة الواردات وحدد أحجام الاستيراد. ضمن استيراد من، أعط المسار إلى خريطة RELION-3، وقم بتغيير معدل أخذ العينات بحجم البكسل إلى 1.045 أنغستروم لكل بكسل ونفذ. لإجراء محاذاة شاملة، حدد القائمة المنسدلة تنقيح من لوحة البروتوكولات وانقر على xmipp3-highres.أدخل الجسيمات والأحجام المستوردة من الخطوات السابقة كصور كاملة الحجم وأحجام أولية على التوالي واضبط مجموعة التماثل على icosahedral. ثم في علامة التبويب محاذاة الصورة ضمن التعيين الزاوي ، اختر عالمي ، واضبط الدقة القصوى المستهدفة على ثلاثة angstroms وقم بتشغيل المهمة. لإجراء محاذاة محلية، حدد xmipp3-highres عمومي، وقم بتغيير المتابعة من التشغيل السابق إلى نعم وحدد المهمة السابقة.ثم في علامة التبويب التعيين الزاوي ، قم بتغيير محاذاة الصورة إلى المحلية واضبط الحد الأقصى للدقة المستهدفة على 2.1 angstroms. بعد الانتهاء ، في نافذة نتائج xmipp3-highres ، انقر فوق مخططات دقة العرض لمعرفة كيف تغيرت FSC بعد التحسين وانقر فوق الرسم البياني للرسم مع التغييرات الزاوية لمعرفة ما إذا كانت تعيينات زاوية أويلر قد تغيرت. افحص مستوى الصوت في UCSF Chimera.قم بالتكبير والبحث عن ميزات عالية الدقة. تم اختيار الصور المجهرية ذات الملاءمة الجيدة ل CTF والاستجماتيزم المنخفض لمزيد من المعالجة ، في حين تم التخلص من تلك التي تعاني من الاستجماتيزم العالي والمصادرة. تم اختيار متوسطات فئة 2D التي تحتوي على فئات محددة جيدا ، وتم رفض تلك ذات الدقة المنخفضة والضوضاء والجسيمات الجزئية.تظهر هنا مناطق خريطة المجهر الإلكتروني المبرد المزودة بإحداثيات ذرية لفيروس مرتبط بالغدي. تسمح كثافات EM المحددة جيدا بتركيب سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية الفردية وجزيئات الماء وأيونات المغنيسيوم. تشير منحنيات FSC المحسوبة باستخدام CryoSPARC v3 وRELION-3 وScipion إلى زيادة الدقة عبر سير العمل ، وتقديرات الدقة عند أربع شرائح مختلفة من خلال الهياكل وتوضح الرسوم البيانية للدقة التحسن التدريجي في الدقة المحلية بين الخرائط طوال سير العمل.أدى الجمع بين خوارزميات معالجة cryo-EM من CryoSPARC و RELION-3 و Scipion و Phoenix إلى زيادة دقة هياكل الفيروسات المرتبطة بالغدية من 2.9 إلى 2.3 angstroms عبر خط أنابيب المعالجة. من المهم أن نتذكر أن المعلمات المحددة في كل خطوة تعتمد على العينة والمجهر. بالإضافة إلى ذلك ، تعتمد القدرة على الوصول إلى دقة عالية بشكل كبير على جودة العينة والبيانات الخام.في هذا الفيديو، نقدم سير عمل SP القوي لمعالجة بيانات cryo-EM عبر منصات البرامج المختلفة. باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء تنفيذ خوارزميات لبرامج متعددة لتحسين هياكل cryo والتحقق من صحتها. يمكن تطبيق سير العمل هذا على حسابات البنية لمجموعة واسعة من التجميعات الجزيئية الكبيرة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

جمع بيانات Cryo-EM أحادية الجسيمات مع إمالة المرحلة باستخدام Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...