Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Vi takker Carlos Oscar Sorzano for hjælp med Scipion3-installationen og Kilian Schnelle og Arne Møller for hjælp til dataoverførsel mellem forskellige behandlingsplatforme. En del af denne forskning blev støttet af NIH-tilskud U24GM129547 og udført på PNCC på OHSU og tilgået via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsoreret af Office of Biological and Environmental Research. Denne undersøgelse blev støttet af et opstartstilskud fra Rutgers University til Arek Kulczyk.

1. Oprettelse af et nyt cryoSPARC v3-projekt og import af data
BEMÆRK: Data blev erhvervet på Oregon Health and Science University (OHSU) i Portland ved hjælp af et 300 kV Titan Krios elektronmikroskop udstyret med en Falcon 3 direkte elektrondetektor. Billeder blev indsamlet i en tælletilstand med en samlet dosis på 28,38 e−/Å2 fordelt på 129 billeder og et defokusområde fra -0,5 μm til -2,5 μm ved en pixelstørrelse på 1,045 Å ved hjælp af ...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

I denne artikel præsenterer vi en robust SPA-arbejdsgang til cryo-EM-databehandling på tværs af forskellige softwareplatforme for at opnå 3D-rekonstruktioner i høj opløsning (figur 1). Denne arbejdsgang gælder for en lang række biologiske makromolekyler. De efterfølgende trin i protokollen er skitseret i figur 4, herunder forbehandling af film, partikelplukning og klassificering og flere metoder til strukturforbedringer (tabel 1...

Kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) og enkeltpartikelanalyse (SPA) muliggør strukturbestemmelse af en lang række biomolekylære samlinger i deres hydrerede tilstand, hvilket hjælper med at belyse disse makromolekylers roller i atomare detaljer. Forbedringer i mikroskopoptik, computerhardware og billedbehandlingssoftware har gjort det muligt at bestemme strukturer af biomolekyler ved opløsning, der når ud over 2 Å1,2,3. Mere end 2.300 cryo-EM-strukturer blev deponeret i Protein Data Bank (PDB) i 2020 sammenlignet med 192 strukturer i 20144, hvilket indikerer, at cryo-EM er blevet den valgte metode for mange strukturbiologer. Her beskriver vi en arbejdsgang, der kombinerer tre forskellige SPA-programmer til bestemmelse af struktur i høj opløsning (figur 1).
Målet med SPA er at rekonstruere 3D-volumener af en målprøve fra støjende 2D-billeder optaget af en mikroskopdetektor. Detektorer indsamler billeder som film med individuelle rammer af samme synsfelt. For at bevare prøven opsamles rammer med en lav elektrondosis og har dermed et dårligt signal-støj-forhold (SNR). Derudover kan elektroneksponering fremkalde bevægelse inden for de glaserede cryo-EM-gitre, hvilket resulterer i billedsløring. For at overvinde disse problemer justeres rammer for at korrigere for stråleinduceret bevægelse og i gennemsnit for at give en mikrograf med en øget SNR. Disse mikrografer gennemgår derefter CTF-estimering (Contrast Transfer Function) for at tage højde for virkningerne af defokusering og afvigelser, der pålægges af mikroskopet. Fra de CTF-korrigerede mikrografer udvælges, ekstraheres og sorteres individuelle partikler i 2D-klassegennemsnit, der repræsenterer forskellige retninger, der er vedtaget af prøven i glasagtig is. Det resulterende homogene sæt partikler anvendes som input til ab initio 3D-rekonstruktion for at generere en grov model eller modeller, som derefter iterativt raffineres for at producere en eller flere højopløsningsstrukturer. Efter genopbygning udføres strukturelle forbedringer for yderligere at forbedre kvaliteten og opløsningen af cryo-EM-kortet. Endelig er enten en atommodel direkte afledt af kortet, eller kortet er udstyret med atomkoordinater opnået andre steder.
Forskellige softwarepakker er tilgængelige for at udføre de opgaver, der er beskrevet ovenfor, herunder Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 og andre. Mens disse programmer følger lignende behandlingstrin, anvender de forskellige algoritmer, for eksempel til at vælge partikler, generere indledende modeller og forfine rekonstruktioner. Derudover kræver disse programmer et varierende niveau af brugerkendskab og intervention for at fungere, da nogle afhænger af finjustering af parametre, der kan fungere som en hindring for nye brugere. Disse uoverensstemmelser resulterer ofte i kort med inkonsekvent kvalitet og opløsning på tværs af platforme14, hvilket får mange forskere til at bruge flere softwarepakker til at forfine og validere resultaterne. I denne artikel fremhæver vi brugen af cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for at opnå en 3D-rekonstruktion af AAV i høj opløsning, en meget anvendt vektor til genterapi15. De førnævnte softwarepakker er gratis for akademiske brugere; cryoSPARC v3 og Scipion 3 kræver licenser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Nylige fremskridt inden for både instrumentering og billedbehandlingssoftware har gjort enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) til den foretrukne metode for strukturbiologer til at bestemme højopløsningsstrukturer af en lang række makromolekyler. Flere softwarepakker er tilgængelige for nye og ekspertbrugere til billedbehandling og strukturberegning, som strømliner den samme grundlæggende arbejdsgang: film erhvervet af mikroskopdetektorerne gennemgår korrektion for stråleinduceret bevægelse og kontrastoverførselsfunktion (CTF) estimering. Dernæst vælges og ekstraheres partikelbilleder fra gennemsnitlige filmrammer til iterativ 2D- og 3D-klassificering efterfulgt af 3D-rekonstruktion, forfining og validering. Fordi forskellige softwarepakker anvender forskellige algoritmer og kræver forskellige niveauer af ekspertise for at fungere, varierer de 3D-kort, de genererer, ofte i kvalitet og opløsning. Således overfører brugerne regelmæssigt data mellem en række programmer for optimale resultater. Dette papir giver brugerne en vejledning til at navigere i en arbejdsgang på tværs af de populære softwarepakker: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for at opnå en næsten atomisk opløsningsstruktur af den adeno-associerede virus (AAV). Vi beskriver først en billedbehandlingspipeline med cryoSPARC v3, da dens effektive algoritmer og brugervenlige GUI giver brugerne mulighed for hurtigt at nå frem til et 3D-kort. I det næste trin bruger vi PyEM og interne scripts til at konvertere og overføre partikelkoordinater fra 3D-rekonstruktion af bedste kvalitet opnået i cryoSPARC v3 til RELION-3 og Scipion 3 og genberegne 3D-kort. Endelig skitserer vi trin til yderligere forfining og validering af de resulterende strukturer ved at integrere algoritmer fra RELION-3 og Scipion 3. I denne artikel beskriver vi, hvordan man effektivt udnytter tre behandlingsplatforme til at skabe en enkelt og robust arbejdsgang, der gælder for en række datasæt til bestemmelse af struktur i høj opløsning.

Vi har præsenteret en omfattende SPA-pipeline for at opnå en struktur med høj opløsning ved hjælp af tre forskellige behandlingsplatforme: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3. Figur 1 og figur 4 opsummerer den generelle behandlingsarbejdsgang, og tabel 1 beskriver forfiningsprotokoller. Disse protokoller blev brugt under forfininger af en 2,3 Å struktur af AAV, der opnåede nær Nyquist opløsning.
Film blev fø...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Denne artikel beskriver, hvordan man effektivt udnytter tre cryo-EM-behandlingsplatforme, dvs. cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3, til at skabe en enkelt og robust arbejdsgang, der gælder for en række enkeltpartikeldatasæt til bestemmelse af struktur i høj opløsning.

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi er metoden til struktureret bestemmelse af makromolekyler ved nær atomopløsning. Flere softwarepakker er tilgængelige til billedbehandling og strukturberegninger, men resultatet på 3D-kort varierer ofte i kvalitet og opløsning på grund af forskellene i algoritmer, der anvendes under beregningerne. Således er det ofte gavnligt at bruge en kombination af forskellige programmer for at opnå de optimale resultater.Denne protokol guider brugerne til at navigere i arbejdsgangen på tværs af tre forskellige cryo-EM-behandlingsplatforme: CryoSPARC, RELION og Scipion. Vi vil demonstrere, hvordan man bruger denne pipeline til at opnå en højopløsningsstruktur af den adeno-associerede virus, som er en meget anvendt vektor til genterapi. Når du har åbnet CryoSPARC v3 i en webbrowser og oprettet arbejdsområdet til projektet, skal du navigere til det nye arbejdsområde og åbne jobbyggeren i højre panel.Klik på importer film, og angiv filmstien og få referencefilstien. Indstil derefter anskaffelsesparametrene. Klik derefter på kø, vælg en bane for at køre jobbet og et arbejdsområde og klik på Opret.Åbn patchbevægelseskorrektion og jobkortet til importfilm. Træk derefter imported_movies output til filmpladsholderen på det nye job, og sæt jobbet i kø. For at udføre kontrastoverførselsfunktionen eller CTF-estimeringen skal du åbne patch CTF-estimering.Indtast de genererede mikrografer, og sæt jobbet i kø. For at inspicere de gennemsnitlige og CTF-korrigerede mikrografer og vælge en delmængde til videre behandling skal du åbne kurateringseksponeringer, indtaste de eksponeringer, der er opnået fra det foregående trin, og sætte jobbet i kø. Når jobbet er gået i ventetilstand, skal du klikke på den interaktive fane på jobkortet.Juster parametertærsklerne, og accepter eller afvis individuelle mikrografer til videre behandling. Under behandlingen af de aktuelle data skal du indstille den øvre tærskel for astigmatisme til 400 angstroms, CTF passer opløsning til fem angstroms og relativ istykkelse til to. Klik derefter på udført for at vælge mikrograferne til downstream-behandling.Åbn den manuelle plukker for manuel plukning. Indtast de accepterede eksponeringer, og sæt jobbet i kø. Klik derefter på den interaktive fane, indstil boksstørrelsen til 300 pixels og klik på et par hundrede partikler på tværs af flere mikrografer, så du undgår overlappende partikler.Når du er færdig med udvælgelsen, skal du klikke på færdig med at plukke ekstraktpartikler. For at generere skabeloner til automatiseret partikelplukning skal du derefter klikke på 2D-klassificering og indtaste de genererede partikelvalg. Skift derefter antallet af 2D-klasser til 10, og sæt jobbet i kø.Åbn derefter vælg 2D-klasser og indtast partiklerne og klassegennemsnittet opnået i det foregående trin. Klik derefter på den interaktive fane, vælg repræsentative 2D-klasser med et godt signal-støj-forhold, og klik på udført. For skabelonbaseret partikelplukning skal du åbne skabelonvælgeren og indtaste de valgte 2D-klasser og mikrografer.Indstil derefter partikeldiameteren til 220 angstroms og sæt jobbet i kø. Endelig åbnes ekstrakt fra mikrografer og input til mikrografer og partikler opnået ved inspektion af partikelplukker. Indstil derefter den udtrukne boksstørrelse til 300 pixels, og sæt jobbet i kø.For 2D-klassificering skal du klikke på 2D-klassificering og indtaste de ekstraherede partikler. Indstil derefter antallet af 2D-klasser til 50, og sæt jobbet i kø. Åbn derefter vælg 2D-klasser og indtast de opnåede partikler og klassegennemsnit.Klik på den interaktive fane. Vælg 2D-klasser baseret på opløsningen og antallet af partikler i klassen, og klik på udført. For at generere et indledende 3D-volumen skal du åbne ab-initio-rekonstruktion og indtaste partiklerne fra den endelige 2D-klassificering.Juster derefter symmetrien til icosahedral og sæt jobbet i kø. Derefter åbnes homogen forfining, input volumenet fra det foregående trin og partikler fra den endelige 2D-klassificering. Skift derefter symmetrien, og sæt jobbet i kø.Når jobbet er færdigt, skal du inspicere Fourier-skalkorrelationen eller FSC-kurven og downloade lydstyrken for at undersøge i UCSF Chimera. I CryoSPARC v3 skal du åbne jobkortet for det valgte 2D-klassejob fra den endelige 2D-klassificering. Klik derefter på eksportjob på fanen Detaljer.Brug PyEM til at konvertere particles_exported. cs-fil til stjerneformat ved at udføre den angivne kommando. Når du har klikket på partikelekstraktion, skal du i fanen I / O indtaste de CTF-korrigerede mikrografer og koordinater.Klik derefter på fanen Uddrag, skift partikelboksens størrelse til 300 pixels og kør jobbet. Til 3D-forfining skal du bruge det kort, der er genereret i CryoSPARC v3, som en indledende model i RELION-3. Vælg importmetoden, og indstil de angivne parametre under fanen I/O.Vælg derefter CryoSPARC v3-kortet som inputfil på fanen Andre, skift nodetype til 3D-reference og kør jobbet. Vælg derefter 3D-autoraffinering, og indstil inputbilleder som partikler på fanen I / O. stjernefil fra det sidste udvælgelsesjob.Brug CryoSPARC v3-rekonstruktionen som referencekort, klik på referencefanen og skift det indledende lavpasfilter til 50 angstroms og symmetri til icosahedral. På fanen optimering skal du derefter ændre maskediameteren til 280 angstroms og køre jobbet. For efterbehandling skal du klikke på efterbehandling.Og på fanen I /O skal du indtaste de oprettede halve kort og maske og indstille den kalibrerede pixelstørrelse til 1.045 angstroms. Derefter skal du indtaste ja på fanen Skærp for automatisk estimat B-faktor. For at få den laveste opløsning til automatisk B-tilpasning skal du indtaste 10.Og til brug din egen B-faktor, input nr. Til sidst skal du på filterfanen indstille spring FSC-vægtning over til nej og køre jobbet. Til poleringstræning skal du åbne Bayesian polering.Og på fanen I / O skal du indtaste de bevægelseskorrigerede mikrografer, partikler og PostProcess. stjernefil opnået tidligere. Klik på træningsfanen, og indstil træne optimale parametre til ja, brøkdel af Fourier-pixels til test til 0,5 og brug så mange partikler til 5.000.Kør derefter jobbet. Når træningsjobbet er færdigt, skal du klikke på Bayesiansk polering. Indstil derefter togoptimale parametre til nej under fanen træning.Vælg fanen Polering, og angiv stien til opt_params_all_groups i optimeret parameterfil. txt-fil fra det forrige trin, og klik på Kør. For at estimere afvigelser af højere orden skal du åbne CTF-forfining.Og på fanen I/O under partikler skal du vælge vejen til stjernefilen, der indeholder polerede partikler fra det nyligt raffinerede 3D-job. Indstil derefter stien til outputtet fra det seneste efterbehandlingsjob under efterbehandlings-STAR-filen. Vælg derefter fanen Tilpas og indstil estimat anisotrop forstørrelse til Nej.Udfør CTF-parametertilpasning til nej. Anslå beamtilt til ja. Anslå også trefoil til ja.Og anslå fjerde ordens afvigelser til ja. Kør derefter jobbet. For yderligere at forfine og validere RELION-3-kortet skal du starte Scipion 3 og oprette et nyt projekt.I venstre protokolpanel skal du vælge rullemenuen Import og klikke på importpartikler. Skift parametrene import fra til RELION-3 og stjernefil til postprocess.star. Angiv derefter anskaffelsesparametrene som vist tidligere, og klik på udfør.Klik derefter på rullemenuen Import, og vælg importmængder. Under import fra skal du give stien til RELION-3-kortet, ændre samplingshastigheden for pixelstørrelse til 1.045 angstrom pr. Pixel og udføre. For at udføre en global justering skal du vælge rullemenuen Finjuler i protokolpanelet og klikke på xmipp3-highres.Indtast de importerede partikler og volumener fra de foregående trin som henholdsvis billeder i fuld størrelse og indledende volumener, og indstil symmetrigruppen til icosahedral. På fanen Billedjustering under vinkeltildeling skal du derefter vælge global, indstille den maksimale målopløsning til tre angstromer og køre jobbet. Hvis du vil udføre en lokal justering, skal du vælge xmipp3-highres global, ændre fortsæt fra forrige kørsel til ja og vælge det forrige job.På fanen vinkeltildeling skal du derefter ændre billedjustering til lokal og indstille den maksimale målopløsning til 2,1 angstroms. Når du er færdig, skal du i xmipp3-highres-resultatvinduet klikke på skærmopløsningsplots for at se, hvordan FSC har ændret sig efter forfiningen, og klikke på plothistogram med vinkelændringer for at se, om Euler-vinkeltildelingerne er ændret. Undersøg lydstyrken i UCSF Chimera.Zoom ind, og se efter funktioner i høj opløsning. Mikrografer med god CTF-pasform og lav astigmatisme blev udvalgt til videre behandling, mens de med høj astigmatisme og fortabelse blev kasseret. 2D-klassegennemsnit indeholdende veldefinerede klasser blev valgt, og dem med lav opløsning, støj og partielle partikler blev afvist.Områder af kryo-elektronmikroskopikortet udstyret med atomare koordinater for en adeno-associeret virus er vist her. Veldefinerede EM-tætheder giver mulighed for at montere sidekæder af individuelle aminosyrer, vandmolekyler og magnesiumioner. FSC-kurver beregnet ved hjælp af CryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion indikerer stigende opløsning på tværs af arbejdsgangen, opløsningsestimater ved fire forskellige udsnit gennem strukturerne og opløsningshistogrammer viser den trinvise forbedring i lokal opløsning mellem kortene i hele arbejdsgangen.Kombinationen af cryo-EM-behandlingsalgoritmer fra CryoSPARC, RELION-3, Scipion og Phoenix resulterede i en opløsningsforøgelse af de adeno-associerede virusstrukturer fra 2,9 til 2,3 angstroms på tværs af behandlingsrørledningen. Det er vigtigt at huske, at de parametre, der er angivet i hvert trin, er prøve- og mikroskopafhængige. Derudover afhænger evnen til at nå høj opløsning i høj grad af kvaliteten af prøven og af de rå data.I denne video præsenterer vi den robuste SP-arbejdsgang til behandling af cryo-EM-data på tværs af forskellige softwareplatforme. Ved at bruge denne tilgang kan man implementere algoritmer til flere programmer for at forfine og validere kryostrukturer. Denne arbejdsgang kan anvendes til strukturberegninger af en lang række makromolekylære samlinger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hurtig gitterforberedelse til tidstilslutt kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuel blot-og-plunge frysning af biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling af nukleosomkernepartikler kompleksbundet med DNA-reparationsfaktorer til kryo-elektronmikroskopi strukturbestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Enkeltpartikel-kryo-EM-dataindsamling med scenehældning ved hjælp af Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...