Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

We bedanken Carlos Oscar Sorzano voor hulp bij de installatie van Scipion3 en Kilian Schnelle en Arne Moeller voor hulp bij gegevensoverdracht tussen verschillende verwerkingsplatforms. Een deel van dit onderzoek werd ondersteund door NIH-subsidie U24GM129547 en uitgevoerd bij de PNCC bij OHSU en toegankelijk via EMSL (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research. Deze studie werd ondersteund door een start-up grant van Rutgers University aan Arek Kulczyk.

1. Een nieuw cryoSPARC v3-project maken en gegevens importeren
OPMERKING: Gegevens werden verkregen aan de Oregon Health and Science University (OHSU) in Portland met behulp van een 300 kV Titan Krios elektronenmicroscoop uitgerust met een Falcon 3 directe elektronendetector. Beelden werden verzameld in een telmodus met een totale dosis van 28,38 e−/Å2 gefractioneerd over 129 frames en een onscherptebereik van -0,5 μm tot -2,5 μm, bij een pixelgrootte ...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

In dit artikel presenteren we een robuuste SPA-workflow voor cryo-EM-gegevensverwerking op verschillende softwareplatforms om 3D-reconstructies met hoge resolutie te bereiken (figuur 1). Deze workflow is toepasbaar op een breed scala aan biologische macromoleculen. De volgende stappen van het protocol worden beschreven in figuur 4, inclusief filmvoorbewerking, deeltjesverzameling en -classificatie en meerdere methoden voor structuurverfijningen (tabel </...

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) en single-particle analysis (SPA) maken structuurbepaling mogelijk van een breed scala aan biomoleculaire assemblages in hun gehydrateerde toestand, waardoor de rollen van deze macromoleculen in atomair detail worden verlicht. Verbeteringen in microscoopoptiek, computerhardware en beeldverwerkingssoftware hebben het mogelijk gemaakt om structuren van biomoleculen te bepalen met een resolutie die verder reikt dan 2 Å1,2,3. Meer dan 2.300 cryo-EM-structuren werden in 2020 in de Protein Data Bank (PDB) gedeponeerd, vergeleken met 192 structuren in 20144, wat aangeeft dat cryo-EM de voorkeursmethode is geworden voor veel structuurbiologen. Hier beschrijven we een workflow die drie verschillende SPA-programma's combineert voor structuurbepaling met hoge resolutie (figuur 1).
Het doel van SPA is om 3D-volumes van een doelmonster te reconstrueren uit luidruchtige 2D-beelden die zijn vastgelegd door een microscoopdetector. Detectoren verzamelen beelden als films met individuele frames van hetzelfde gezichtsveld. Om het monster te behouden, worden frames verzameld met een lage elektronendosis en hebben ze dus een slechte signaal-ruisverhouding (SNR). Bovendien kan blootstelling aan elektronen beweging induceren binnen de verglaasde cryo-EM-rasters, wat resulteert in beeldvervaging. Om deze problemen op te lossen, worden frames uitgelijnd om te corrigeren voor door stralen geïnduceerde beweging en gemiddeld om een micrograaf met een verhoogde SNR op te leveren. Deze micrografieën ondergaan vervolgens een CTF-schatting (Contrast Transfer Function) om rekening te houden met de effecten van onscherpte en aberraties die door de microscoop worden opgelegd. Uit de CTF-gecorrigeerde micrografieën worden individuele deeltjes geselecteerd, geëxtraheerd en gesorteerd in 2D-klassegemiddelden die verschillende oriëntaties vertegenwoordigen die door het monster in glasachtig ijs worden aangenomen. De resulterende homogene verzameling deeltjes wordt gebruikt als input voor ab initio 3D-reconstructie om een grof model of modellen te genereren, die vervolgens iteratief worden verfijnd om een of meer structuren met hoge resolutie te produceren. Na de reconstructie worden structurele verfijningen uitgevoerd om de kwaliteit en resolutie van de cryo-EM-kaart verder te verbeteren. Ten slotte wordt ofwel een atoommodel rechtstreeks afgeleid van de kaart, ofwel is de kaart uitgerust met atoomcoördinaten die elders zijn verkregen.
Er zijn verschillende softwarepakketten beschikbaar om de hierboven beschreven taken uit te voeren, waaronder Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 en andere. Hoewel deze programma's vergelijkbare verwerkingsstappen volgen, gebruiken ze verschillende algoritmen, bijvoorbeeld om deeltjes te selecteren, initiële modellen te genereren en reconstructies te verfijnen. Bovendien vereisen deze programma's een variërend niveau van gebruikerskennis en interventie om te werken, omdat sommige afhankelijk zijn van de fijnafstelling van parameters die als een hindernis voor nieuwe gebruikers kunnen fungeren. Deze discrepanties resulteren vaak in kaarten met inconsistente kwaliteit en resolutie op verschillende platforms14, waardoor veel onderzoekers ertoe worden aangezet meerdere softwarepakketten te gebruiken om resultaten te verfijnen en te valideren. In dit artikel belichten we het gebruik van cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een hoge resolutie 3D-reconstructie te verkrijgen van AAV, een veelgebruikte vector voor gentherapie15. De bovengenoemde softwarepakketten zijn gratis voor academische gebruikers; cryoSPARC v3 en Scipion 3 vereisen licenties.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie- als beeldverwerkingssoftware hebben cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) tot de voorkeursmethode gemaakt voor structuurbiologen om structuren met hoge resolutie van een breed scala aan macromoleculen te bepalen. Meerdere softwaresuites zijn beschikbaar voor nieuwe en deskundige gebruikers voor beeldverwerking en structuurberekening, die dezelfde basisworkflow stroomlijnen: films die door de microscoopdetectoren zijn verkregen, ondergaan correctie voor beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) schatting. Vervolgens worden deeltjesafbeeldingen geselecteerd en geëxtraheerd uit gemiddelde filmframes voor iteratieve 2D- en 3D-classificatie, gevolgd door 3D-reconstructie, verfijning en validatie. Omdat verschillende softwarepakketten verschillende algoritmen gebruiken en verschillende niveaus van expertise vereisen om te werken, verschillen de 3D-kaarten die ze genereren vaak in kwaliteit en resolutie. Gebruikers dragen dus regelmatig gegevens over tussen verschillende programma's voor optimale resultaten. Dit artikel biedt een handleiding voor gebruikers om door een workflow te navigeren in de populaire softwarepakketten: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een bijna atomaire resolutiestructuur van het adeno-geassocieerde virus (AAV) te verkrijgen. We beschrijven eerst een beeldverwerkingspijplijn met cryoSPARC v3, omdat de efficiënte algoritmen en gebruiksvriendelijke GUI gebruikers in staat stellen om snel tot een 3D-kaart te komen. In de volgende stap gebruiken we PyEM en interne scripts om deeltjescoördinaten van de beste kwaliteit 3D-reconstructie verkregen in cryoSPARC v3 naar RELION-3 en Scipion 3 te converteren en over te dragen en 3D-kaarten opnieuw te berekenen. Ten slotte schetsen we stappen voor verdere verfijning en validatie van de resulterende structuren door algoritmen van RELION-3 en Scipion 3 te integreren. In dit artikel beschrijven we hoe u drie verwerkingsplatforms effectief kunt gebruiken om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets voor het bepalen van de structuur met hoge resolutie.

We hebben een uitgebreide SPA-pijplijn gepresenteerd om een structuur met hoge resolutie te verkrijgen met behulp van drie verschillende verwerkingsplatforms: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3. Figuur 1 en figuur 4 geven een overzicht van de algemene verwerkingsworkflow en tabel 1 geeft details over verfijningsprotocollen. Deze protocollen werden gebruikt tijdens verfijningen van een 2,3 Å-structuur van AAV, waardoor een resolutie in de buurt...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje is de methode voor gestructureerde bepalingen van macromoleculen met een bijna atomaire resolutie. Er zijn meerdere softwarepakketten beschikbaar voor beeldverwerking en structuurberekeningen, maar het resultaat op 3D-kaarten varieert vaak in kwaliteit en resolutie vanwege de verschillen in algoritmen die tijdens berekeningen worden toegepast. Het gebruik van een combinatie van verschillende programma's is dus vaak gunstig om de optimale resultaten te bereiken.Dit protocol begeleidt gebruikers bij het navigeren door de workflow op drie verschillende cryo-EM-verwerkingsplatforms: CryoSPARC, RELION en Scipion. We zullen demonstreren hoe we deze pijplijn kunnen gebruiken om een hoge resolutiestructuur van het adeno-geassocieerde virus te verkrijgen, een veelgebruikte vector voor gentherapie. Nadat u CryoSPARC v3 in een webbrowser hebt geopend en de werkruimte voor het project hebt gemaakt, navigeert u naar de nieuwe werkruimte en opent u de taakbouwer in het rechterdeelvenster.Klik op films importeren en geef het filmpad op en het pad naar het referentiebestand. Stel vervolgens de acquisitieparameters in. Klik vervolgens op wachtrij, selecteer een rijstrook om de taak en een werkruimte uit te voeren en klik op maken.Open de bewegingscorrectie van de patch en de taakkaart voor het importeren van films. Sleep vervolgens de imported_movies uitvoer naar de tijdelijke aanduiding voor films voor de nieuwe taak en zet de taak in de wachtrij. Om de contrastoverdrachtfunctie of CTF-schatting uit te voeren, opent u ctf-schatting van de patch.Voer de gegenereerde micrografieën in en zet de taak in de wachtrij. Om de gemiddelde en CTF gecorrigeerde micrografieën te inspecteren en een subset te selecteren voor verdere verwerking, opent u curate exposures, voert u de belichtingen in die zijn verkregen uit de vorige stap en plaatst u de taak in de wachtrij. Nadat de taak in de wachtmodus is gegaan, klikt u op het interactieve tabblad op de taakkaart.Pas de parameterdrempels aan en accepteer of verwerp individuele micrografieën voor verdere verwerking. Stel tijdens het verwerken van de huidige gegevens de bovengrens van astigmatisme in op 400 angstroms, CTF-pasvormresolutie op vijf angstroms en relatieve ijsdikte op twee. Klik vervolgens op gereed om de micrografieën voor downstream-verwerking te selecteren.Voor handmatige picking opent u de handmatige kiezer. Voer de geaccepteerde belichtingen in en zet de taak in de wachtrij. Klik vervolgens op het interactieve tabblad, stel de doosgrootte in op 300 pixels en klik op een paar honderd deeltjes over meerdere micrografieën, waarbij overlappende deeltjes worden vermeden.Zodra u klaar bent met de selectie, klikt u op klaar met het plukken van extractdeeltjes. Om vervolgens sjablonen voor geautomatiseerde deeltjesverzameling te genereren, klikt u op 2D-classificatie en voert u de gegenereerde deeltjesprikkels in. Wijzig vervolgens het aantal 2D-klassen in 10 en zet de taak in de wachtrij.Open vervolgens 2D-klassen en voer de deeltjes en klassegemiddelden in die in de vorige stap zijn verkregen. Klik vervolgens op het interactieve tabblad, selecteer representatieve 2D-klassen met een goede signaal-ruisverhouding en klik op gereed. Voor op sjablonen gebaseerde deeltjesverzameling opent u de sjabloonkiezer en voert u de geselecteerde 2D-klassen en micrografieën in.Stel vervolgens de deeltjesdiameter in op 220 angstroms en zet de taak in de wachtrij. Ten slotte opent u het extract van micrografieën en voert u de micrografieën en deeltjes in die zijn verkregen door het inspecteren van deeltjesprikkers. Stel vervolgens de grootte van de geëxtraheerde doos in op 300 pixels en zet de taak in de wachtrij.Voor 2D-classificatie klikt u op 2D-classificatie en voert u de geëxtraheerde deeltjes in. Stel vervolgens het aantal 2D-klassen in op 50 en zet de taak in de wachtrij. Open vervolgens geselecteerde 2D-klassen en voer de verkregen deeltjes en klassegemiddelden in.Klik op het interactieve tabblad. Kies 2D-klassen op basis van de resolutie en het aantal deeltjes in de klasse en klik op gereed. Om een initieel 3D-volume te genereren, opent u ab-initio reconstructie en voert u de deeltjes uit de uiteindelijke 2D-classificatie in.Pas vervolgens de symmetrie aan op icosaëderaal en zet de taak in de wachtrij. Open vervolgens homogene verfijning, voer het volume van de vorige stap en deeltjes uit de uiteindelijke 2D-classificatie in. Wijzig vervolgens de symmetrie en zet de taak in de wachtrij.Wanneer de taak is voltooid, inspecteert u de Fourier-shellcorrelatie of FSC-curve en downloadt u het volume om te onderzoeken in UCSF Chimera. Open in CryoSPARC v3 de taakkaart van de geselecteerde 2D-klassetaak uit de uiteindelijke 2D-classificatie. Klik vervolgens op het tabblad Details op taak exporteren.Converteer de particles_exported met PyEM. cs-bestand naar sterformaat door het aangegeven commando uit te voeren. Nadat u op deeltjesextractie hebt geklikt, voert u op het tabblad I/O de ctf-gecorrigeerde micrografieën en coördinaten in.Klik vervolgens op het tabblad Extract, wijzig de grootte van de deeltjesdoos in 300 pixels en voer de taak uit. Voor 3D-verfijning gebruikt u de kaart die is gegenereerd in CryoSPARC v3 als een eerste model in RELION-3. Selecteer de importmethode en stel de aangegeven parameters in op het tabblad I/O.Selecteer vervolgens op het tabblad Anderen de CryoSPARC v3-kaart als invoerbestand, wijzig het knooppunttype in 3D-verwijzing en voer de taak uit. Selecteer vervolgens de automatische 3D-verfijning en stel op het tabblad I/O invoerafbeeldingen in als de deeltjes. sterbestand van de laatste selectietaak.Gebruik de CryoSPARC v3 reconstructie als referentiekaart, klik op het referentietabblad en wijzig het initiële laagdoorlaatfilter naar 50 angstroms en symmetrie naar icosaëderaal. Wijzig vervolgens op het tabblad Optimalisatie de maskerdiameter in 280 angstroms en voer de taak uit. Voor nabewerking klikt u op nabewerking.En voer op het tabblad I/O de gemaakte halve kaarten en masker in en stel de gekalibreerde pixelgrootte in op 1,045 angstroms. Dan op het tabblad verscherpen, voor schatting B-factor automatisch, voer ja in. Voor de laagste resolutie voor auto-B fit, voer 10 in.En voor het gebruik van je eigen B-factor, voer nee in. Stel ten slotte op het filtertabblad FSC-weging overslaan in op nee en voer de taak uit. Voor polijsttraining, open Bayesian polijsten.En voer op het tabblad I/O de bewegingsgecorrigeerde micrografieën, deeltjes en PostProcess in. sterbestand eerder verkregen. Klik op het tabblad training en stel de optimale parameters voor trainen in op ja, fractie van Fourier-pixels voor testen tot 0,5 en gebruik zoveel deeltjes tot 5.000.Voer vervolgens de taak uit. Zodra de trainingstaak is voltooid, klikt u op Bayesiaans polijsten. Stel vervolgens op het tabblad Training optimale parameters trainen in op nee.Selecteer het poolse tabblad en geef in het geoptimaliseerde parameterbestand het pad naar de opt_params_all_groups op. txt-bestand uit de vorige stap en klik op uitvoeren. Om aberraties van hogere orde te schatten, opent u CTF-verfijning.En selecteer op het tabblad I/O onder deeltjes het pad naar het sterbestand met gepolijste deeltjes uit de recente verfijnde 3D-taak. Stel vervolgens onder STAR-bestand na verwerking het pad in naar de uitvoer van de nieuwste nabewerkingstaak. Selecteer vervolgens het tabblad Aanpassen en stel schatting anisotrope vergroting in op nee.Voer CTF-parameteraanpassing uit op nee. Schat beamtilt op ja. Schat ook klaverblad op ja.En schat vierde orde aberraties op ja. Voer vervolgens de taak uit. Om de RELION-3 kaart verder te verfijnen en te valideren, start u Scipion 3 en maakt u een nieuw project.Selecteer in het linkerprotocollenpaneel de vervolgkeuzelijst importeren en klik op deeltjes importeren. Wijzig de parameters importeren van naar RELION-3 en star bestand naar postprocess.star. Geef vervolgens de acquisitieparameters op zoals eerder gedemonstreerd en klik op uitvoeren.Klik vervolgens op de vervolgkeuzelijst importeren en selecteer importvolumes. Geef onder importeren van het pad naar de RELION-3-kaart, wijzig de bemonsteringsfrequentie van de pixelgrootte in 1,045 angstroms per pixel en voer uit. Als u een globale uitlijning wilt uitvoeren, selecteert u het vervolgkeuzemenu Verfijnen in het deelvenster Protocollen en klikt u op xmipp3-highres.Voer de geïmporteerde deeltjes en volumes uit de vorige stappen in als respectievelijk afbeeldingen op ware grootte en initiële volumes en stel de symmetriegroep in op icosaëdraal. Kies vervolgens op het tabblad afbeeldingsuitlijning onder hoektoewijzing globaal, stel de maximale doelresolutie in op drie angstroms en voer de taak uit. Als u een lokale uitlijning wilt uitvoeren, selecteert u xmipp3-highres globaal, wijzigt u doorgaan van vorige uitvoering in ja en selecteert u de vorige taak.Wijzig vervolgens op het tabblad Hoektoewijzing de afbeeldingsuitlijning in lokaal en stel de maximale doelresolutie in op 2,1 angstroms. Klik na het voltooien in het resultatenvenster xmipp3-highres op weergaveresolutieplots om te zien hoe de FSC is veranderd na de verfijning en klik op plot histogram met hoekige wijzigingen om te zien of de Euler-hoektoewijzingen zijn gewijzigd. Inspecteer het volume in UCSF Chimera.Zoom in en zoek naar functies met een hoge resolutie. Microfoto's met een goede CTF-pasvorm en een laag astigmatisme werden geselecteerd voor verdere verwerking, terwijl die met een hoog astigmatisme en forfait werden weggegooid. 2D-klassegemiddelden met goed gedefinieerde klassen werden geselecteerd en die met lage resolutie, ruis en partiële deeltjes werden afgewezen.Regio's van de cryo-elektronenmicroscopiekaart uitgerust met atoomcoördinaten van een adeno-geassocieerd virus worden hier weergegeven. Goed gedefinieerde EM-dichtheden maken het mogelijk om zijketens van individuele aminozuren, watermoleculen en magnesiumionen aan te passen. FSC-curven berekend met CryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion geven een toenemende resolutie aan in de workflow, resolutieschattingen op vier verschillende segmenten door de structuren en resolutiehistogrammen tonen de incrementele verbetering van de lokale resolutie tussen de kaarten in de workflow.Het combineren van cryo-EM-verwerkingsalgoritmen van CryoSPARC, RELION-3, Scipion en Phoenix resulteerde in een resolutieverhoging van de adeno-geassocieerde virusstructuren van 2,9 naar 2,3 angstroms in de verwerkingspijplijn. Het is belangrijk om te onthouden dat de parameters die in elke stap worden gespecificeerd, afhankelijk zijn van monsters en microscoop. Bovendien hangt de mogelijkheid om een hoge resolutie te bereiken sterk af van de kwaliteit van het monster en van de onbewerkte gegevens.In deze video presenteren we de robuuste SP-workflow voor de verwerking van cryo-EM-gegevens op verschillende softwareplatforms. Door deze aanpak te gebruiken, kan men algoritmen implementeren voor meerdere programma's om cryostructuren te verfijnen en te valideren. Deze workflow kan worden toegepast op structuurberekeningen van een breed scala aan macromoleculaire assemblages.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...