Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Wir danken Carlos Oscar Sorzano für die Hilfe bei der Installation von Scipion3 und Kilian Schnelle und Arne Moeller für die Hilfe beim Datentransfer zwischen verschiedenen Verarbeitungsplattformen. Ein Teil dieser Forschung wurde durch den NIH-Zuschuss U24GM129547 unterstützt und am PNCC an der OHSU durchgeführt und über EMSL (grid.436923.9), eine vom Office of Biological and Environmental Research gesponserte DOE Office of Science User Facility, zugänglich gemacht. Diese Studie wurde durch ein Start-up-Stipendium der Rutgers University an Arek Kulczyk unterstützt.

1. Erstellen eines neuen cryoSPARC v3-Projekts und Importieren von Daten
HINWEIS: Die Daten wurden an der Oregon Health and Science University (OHSU) in Portland mit einem 300-kV-Titan Krios-Elektronenmikroskop erfasst, das mit einem Falcon 3-Direktelektronendetektor ausgestattet ist. Die Bilder wurden in einem Zählmodus mit einer Gesamtdosis von 28,38 e−/Å2 über 129 Frames und einem Defokussierungsbereich von -0,5 μm bis -2,5 μm bei einer Pixelgrö?...

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	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

In diesem Artikel stellen wir einen robusten SPA-Workflow für die Kryo-EM-Datenverarbeitung über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen (Abbildung 1). Dieser Workflow ist auf eine Vielzahl von biologischen Makromolekülen anwendbar. Die nachfolgenden Schritte des Protokolls sind in Abbildung 4 dargestellt, einschließlich Filmvorverarbeitung, Partikelkommissionierung und -klassifizierung sowie mehrerer ...

Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglichen die Strukturbestimmung einer Vielzahl von biomolekularen Baugruppen in ihrem hydratisierten Zustand und helfen, die Rolle dieser Makromoleküle im atomaren Detail zu beleuchten. Verbesserungen in der Mikroskopoptik, Computerhardware und Bildverarbeitungssoftware haben es ermöglicht, Strukturen von Biomolekülen mit einer Auflösung von mehr als 2 Å 1,2,3 zu bestimmen. Mehr als 2.300 Kryo-EM-Strukturen wurden 2020 in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegt, verglichen mit 192 Strukturen im Jahr 20144, was darauf hindeutet, dass Kryo-EM für viele Strukturbiologen zur Methode der Wahl geworden ist. Hier beschreiben wir einen Workflow, der drei verschiedene SPA-Programme zur hochauflösenden Strukturfindung kombiniert (Abbildung 1).
Das Ziel von SPA ist es, 3D-Volumina einer Zielprobe aus verrauschten 2D-Bildern zu rekonstruieren, die von einem Mikroskopdetektor aufgenommen wurden. Detektoren sammeln Bilder als Filme mit einzelnen Bildern des gleichen Sichtfeldes. Um die Probe zu erhalten, werden Frames mit einer niedrigen Elektronendosis gesammelt und haben somit ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus kann die Elektronenbelichtung eine Bewegung innerhalb der verglasten Kryo-EM-Gitter induzieren, was zu Bildunschärfe führt. Um diese Probleme zu überwinden, werden die Rahmen so ausgerichtet, dass sie die strahleninduzierte Bewegung korrigieren, und gemittelt, um eine Mikroaufnahme mit einem erhöhten SNR zu erhalten. Diese Mikroaufnahmen werden dann einer CTF-Schätzung (Contrast Transfer Function) unterzogen, um die Auswirkungen von Defokus und Aberrationen, die vom Mikroskop auferlegt werden, zu berücksichtigen. Aus den CTF-korrigierten Mikroaufnahmen werden einzelne Partikel ausgewählt, extrahiert und in 2D-Klassendurchschnitte sortiert, die unterschiedliche Orientierungen der Probe in Glaseis darstellen. Der resultierende homogene Satz von Partikeln wird als Input für die ab initio 3D-Rekonstruktion verwendet, um ein grobes Modell oder Modelle zu erzeugen, die dann iterativ verfeinert werden, um eine oder mehrere hochauflösende Strukturen zu erzeugen. Nach der Rekonstruktion werden strukturelle Verfeinerungen durchgeführt, um die Qualität und Auflösung der Kryo-EM-Karte weiter zu verbessern. Schließlich wird entweder ein Atommodell direkt von der Karte abgeleitet, oder die Karte ist mit atomaren Koordinaten ausgestattet, die an anderer Stelle erhalten wurden.
Verschiedene Softwarepakete sind verfügbar, um die oben beschriebenen Aufgaben zu erfüllen, einschließlich Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 und andere. Während diese Programme ähnlichen Verarbeitungsschritten folgen, verwenden sie verschiedene Algorithmen, um beispielsweise Partikel auszuwählen, anfängliche Modelle zu generieren und Rekonstruktionen zu verfeinern. Darüber hinaus erfordern diese Programme ein unterschiedliches Maß an Benutzerwissen und Eingriffen, da einige von der Feinabstimmung von Parametern abhängen, die als Hürde für neue Benutzer dienen können. Diese Diskrepanzen führen oft zu Karten mit inkonsistenter Qualität und Auflösung auf allen Plattformen14, was viele Forscher dazu veranlasst, mehrere Softwarepakete zu verwenden, um die Ergebnisse zu verfeinern und zu validieren. In diesem Artikel heben wir die Verwendung von cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 hervor, um eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von AAV, einem weit verbreiteten Vektor für die Gentherapie15, zu erhalten. Die oben genannten Softwarepakete sind für akademische Benutzer kostenlos; cryoSPARC v3 und Scipion 3 benötigen Lizenzen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Jüngste Fortschritte sowohl in der Instrumentierung als auch in der Bildverarbeitungssoftware haben die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur bevorzugten Methode für Strukturbiologen gemacht, um hochauflösende Strukturen einer Vielzahl von Makromolekülen zu bestimmen. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnung stehen neue und erfahrene Benutzer mehrere Software-Suiten zur Verfügung, die den gleichen grundlegenden Workflow rationalisieren: Filme, die von den Mikroskopdetektoren aufgenommen wurden, werden für die Schätzung der strahleninduzierten Bewegung und der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) korrigiert. Als nächstes werden Partikelbilder ausgewählt und aus gemittelten Filmbildern für die iterative 2D- und 3D-Klassifizierung extrahiert, gefolgt von 3D-Rekonstruktion, Verfeinerung und Validierung. Da verschiedene Softwarepakete unterschiedliche Algorithmen verwenden und unterschiedliche Fachkenntnisse erfordern, unterscheiden sich die von ihnen generierten 3D-Karten häufig in Qualität und Auflösung. So übertragen Benutzer regelmäßig Daten zwischen einer Vielzahl von Programmen für optimale Ergebnisse. Dieses Dokument bietet eine Anleitung für Benutzer zum Navigieren in einem Workflow durch die gängigen Softwarepakete: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, um eine nahezu atomare Auflösungsstruktur des Adeno-assoziierten Virus (AAV) zu erhalten. Wir haben zunächst eine Bildverarbeitungspipeline mit cryoSPARC v3 detailliert beschrieben, da die effizienten Algorithmen und die benutzerfreundliche GUI es den Benutzern ermöglichen, schnell zu einer 3D-Karte zu gelangen. Im nächsten Schritt verwenden wir PyEM und interne Skripte, um Partikelkoordinaten von der besten 3D-Rekonstruktion in cryoSPARC v3 zu RELION-3 und Scipion 3 zu konvertieren und zu übertragen und 3D-Karten neu zu berechnen. Schließlich skizzieren wir Schritte zur weiteren Verfeinerung und Validierung der resultierenden Strukturen durch die Integration von Algorithmen aus RELION-3 und Scipion 3. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie drei Verarbeitungsplattformen effektiv nutzen können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Datensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Wir haben eine umfassende SPA-Pipeline vorgestellt, um eine hochauflösende Struktur mit drei verschiedenen Verarbeitungsplattformen zu erhalten: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3. Abbildung 1 und Abbildung 4 fassen den allgemeinen Verarbeitungsworkflow zusammen, und in Tabelle 1 sind die Einschränkungsprotokolle aufgeführt. Diese Protokolle wurden bei der Verfeinerung einer 2,3 Å-Struktur von AAV verwendet, wodurch eine nahezu Nyquist-Au...

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie ist die Methode zur strukturierten Bestimmung von Makromolekülen bei nahezu atomarer Auflösung. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnungen stehen mehrere Softwarepakete zur Verfügung, doch das Ergebnis auf 3D-Karten variiert oft in Qualität und Auflösung aufgrund der Unterschiede in den Algorithmen, die bei Berechnungen angewendet werden. Daher ist die Verwendung einer Kombination verschiedener Programme oft von Vorteil, um die optimalen Ergebnisse zu erzielen.Dieses Protokoll führt Benutzer durch die Navigation im Workflow über drei verschiedene Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen: CryoSPARC, RELION und Scipion. Wir werden zeigen, wie man diese Pipeline nutzen kann, um eine hochauflösende Struktur des Adeno-assoziierten Virus zu erhalten, das ein weit verbreiteter Vektor für die Gentherapie ist. Nachdem Sie CryoSPARC v3 in einem Webbrowser geöffnet und den Arbeitsbereich für das Projekt erstellt haben, navigieren Sie zum neuen Arbeitsbereich und öffnen Sie den Job Builder im rechten Bereich.Klicken Sie auf Filme importieren und geben Sie den Filmpfad und den Referenzdateipfad an. Legen Sie dann die Erfassungsparameter fest. Klicken Sie anschließend auf Warteschlange, wählen Sie eine Lane zum Ausführen des Auftrags und einen Arbeitsbereich aus und klicken Sie auf Erstellen.Öffnen Sie die Patch-Bewegungskorrektur und die Auftragskarte zum Importieren von Filmen. Ziehen Sie dann die imported_movies Ausgabe auf den Filmplatzhalter des neuen Auftrags und stellen Sie den Auftrag in eine Warteschlange. Um die Kontrastübertragungsfunktion oder die CTF-Schätzung durchzuführen, öffnen Sie die Patch-CTF-Schätzung.Geben Sie die generierten Mikroaufnahmen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Um die gemittelten und CTF-korrigierten Mikroaufnahmen zu überprüfen und eine Teilmenge für die weitere Verarbeitung auszuwählen, öffnen Sie die kuratierten Belichtungen, geben Sie die aus dem vorherigen Schritt erhaltenen Belichtungen ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Nachdem der Job in den Wartemodus gewechselt ist, klicken Sie auf die interaktive Registerkarte auf der Jobkarte.Passen Sie die Parameterschwellenwerte an und akzeptieren oder lehnen Sie einzelne Mikroaufnahmen zur weiteren Bearbeitung ab. Legen Sie bei der Verarbeitung der aktuellen Daten die obere Schwelle des Astigmatismus auf 400 Angström, die CTF-Anpassungsauflösung auf fünf Angström und die relative Eisdicke auf zwei fest. Klicken Sie dann auf Fertig, um die Mikroaufnahmen für die nachgelagerte Verarbeitung auszuwählen.Öffnen Sie für die manuelle Kommissionierung die manuelle Kommissionierung. Geben Sie die akzeptierten Belichtungen ein und stellen Sie den Auftrag in eine Warteschlange. Klicken Sie dann auf die interaktive Registerkarte, stellen Sie die Boxgröße auf 300 Pixel ein und klicken Sie auf einige hundert Partikel in mehreren Mikroaufnahmen, um überlappende Partikel zu vermeiden.Wenn Sie mit der Auswahl fertig sind, klicken Sie auf Fertig beim Auswählen der Extraktpartikel. Um Vorlagen für die automatisierte Partikelkommissionierung zu erstellen, klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die generierten Partikelpicks ein. Ändern Sie dann die Anzahl der 2D-Klassen in 10 und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.Öffnen Sie als Nächstes ausgewählte 2D-Klassen und geben Sie die im vorherigen Schritt erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein. Klicken Sie dann auf die interaktive Registerkarte, wählen Sie repräsentative 2D-Klassen mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis aus und klicken Sie auf Fertig. Für die vorlagenbasierte Partikelauswahl öffnen Sie die Vorlagenauswahl und geben Sie die ausgewählten 2D-Klassen und Mikroaufnahmen ein.Stellen Sie dann den Partikeldurchmesser auf 220 Angström ein und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Öffnen Sie schließlich den Auszug aus den Mikroaufnahmen und geben Sie die Mikroaufnahmen und Partikel ein, die aus der Inspektion von Partikelpickern gewonnen wurden. Legen Sie dann die extrahierte Boxgröße auf 300 Pixel fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.Für die 2D-Klassifizierung klicken Sie auf 2D-Klassifizierung und geben Sie die extrahierten Partikel ein. Legen Sie dann die Anzahl der 2D-Klassen auf 50 fest und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange. Öffnen Sie als Nächstes ausgewählte 2D-Klassen und geben Sie die erhaltenen Partikel und Klassendurchschnitte ein.Klicken Sie auf die interaktive Registerkarte. Wählen Sie 2D-Klassen basierend auf der Auflösung und der Anzahl der Partikel in der Klasse und klicken Sie auf Fertig. Um ein anfängliches 3D-Volumen zu erzeugen, öffnen Sie die ab-initio-Rekonstruktion und geben Sie die Partikel aus der endgültigen 2D-Klassifizierung ein.Passen Sie dann die Symmetrie an die Ikosaeder an und stellen Sie den Job in die Warteschlange. Als nächstes öffnen Sie die homogene Verfeinerung, geben Sie das Volumen aus dem vorherigen Schritt und Partikel aus der endgültigen 2D-Klassifizierung ein. Ändern Sie dann die Symmetrie und stellen Sie den Auftrag in die Warteschlange.Wenn der Auftrag abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Fourier-Schalenkorrelation oder die FSC-Kurve und laden Sie das Volume herunter, um es in UCSF Chimera zu untersuchen. Öffnen Sie in CryoSPARC v3 die Jobkarte des ausgewählten 2D-Klassenauftrags aus der endgültigen 2D-Klassifizierung. Klicken Sie dann auf der Registerkarte Details auf Auftrag exportieren.Konvertieren Sie mit PyEM die particles_exported. CS-Datei durch Ausführen des angegebenen Befehls in das Sternformat. Nachdem Sie auf Partikelextraktion geklickt haben, geben Sie auf der Registerkarte I / O die CTF-korrigierten Mikroaufnahmen und Koordinaten ein.Klicken Sie dann auf die Registerkarte Extrahieren, ändern Sie die Partikelfeldgröße auf 300 Pixel und führen Sie den Auftrag aus. Verwenden Sie für die 3D-Verfeinerung die in CryoSPARC v3 generierte Karte als erstes Modell in RELION-3. Wählen Sie die Importmethode aus und legen Sie die angegebenen Parameter auf der Registerkarte E/A fest.Wählen Sie dann auf der Registerkarte Andere die CryoSPARC v3-Karte als Eingabedatei aus, ändern Sie den Knotentyp in 3D-Referenz und führen Sie den Auftrag aus. Wählen Sie als Nächstes die automatische 3D-Verfeinerung aus, und legen Sie auf der Registerkarte E/A Eingabebilder als Partikel fest. Stern-Datei aus dem letzten Auswahlauftrag.Verwenden Sie die CryoSPARC v3-Rekonstruktion als Referenzkarte, klicken Sie auf die Registerkarte Referenz und ändern Sie den anfänglichen Tiefpassfilter auf 50 Angström und die Symmetrie auf Ikosaeder. Ändern Sie dann auf der Registerkarte Optimierung den Maskendurchmesser in 280 Angström, und führen Sie den Auftrag aus. Für die Nachbearbeitung klicken Sie auf Nachbearbeitung.Geben Sie auf der Registerkarte E/A die erstellten Halbkarten und die Maske ein und stellen Sie die kalibrierte Pixelgröße auf 1,045 Angström ein. Geben Sie dann auf der Registerkarte "Schärfen" für die automatische Schätzung des B-Faktors ja ein. Für die niedrigste Auflösung für die Auto-B-Anpassung geben Sie 10 ein.Und für die Verwendung Ihres eigenen B-Faktors, Eingabe-Nr. Legen Sie schließlich auf der Registerkarte Filter die Option FSC-Gewichtung überspringen auf no fest, und führen Sie den Auftrag aus. Öffnen Sie für das Poliertraining das Bayessche Polieren.Geben Sie auf der Registerkarte E/A die bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen, Partikel und PostProcess ein. STAR-Datei zuvor erhalten. Klicken Sie auf die Registerkarte Training und setzen Sie die optimalen Parameter des Trainings auf ja, den Anteil der Fourier-Pixel zum Testen auf 0,5 und verwenden Sie diese vielen Partikel auf 5.000.Führen Sie dann den Auftrag aus. Wenn der Schulungsauftrag abgeschlossen ist, klicken Sie auf Bayes'sches Polieren. Legen Sie dann auf der Registerkarte Training die optimalen Parameter des Trainings auf no fest.Wählen Sie die Registerkarte Politur und geben Sie unter Optimierte Parameterdatei den Pfad zum opt_params_all_groups an. txt-Datei aus dem vorherigen Schritt und klicken Sie auf Ausführen. Um Aberrationen höherer Ordnung zu schätzen, öffnen Sie die CTF-Verfeinerung.Wählen Sie auf der Registerkarte E/A unter Partikel den Pfad zur Sterndatei aus, die polierte Partikel aus dem kürzlich verfeinerten 3D-Auftrag enthält. Legen Sie dann unter STAR-Datei nach der Verarbeitung den Pfad zur Ausgabe des letzten Nachbearbeitungsauftrags fest. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Anpassung und legen Sie die anisotrope Vergrößerung schätzen auf Nein fest.CTF-Parameteranpassung an Nr. Schätzen Sie die Strahlneigung auf ja. Schätzen Sie auch Kleeblatt auf ja.Und schätzen Sie Aberrationen vierter Ordnung auf ja. Führen Sie dann den Auftrag aus. Um die RELION-3-Karte weiter zu verfeinern und zu validieren, starten Sie Scipion 3 und erstellen Sie ein neues Projekt.Wählen Sie im linken Protokollbereich das Dropdown-Menü Importe aus und klicken Sie auf Partikel importieren. Ändern Sie die Parameter import von in RELION-3 und star file in postprocess.star. Geben Sie dann die Erfassungsparameter wie zuvor gezeigt an und klicken Sie auf Ausführen.Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü Importe und wählen Sie Importvolumes aus. Geben Sie unter Importieren von den Pfad zur RELION-3-Karte ein, ändern Sie die Abtastrate der Pixelgröße auf 1,045 Angström pro Pixel und führen Sie sie aus. Um eine globale Ausrichtung durchzuführen, wählen Sie das Dropdown-Menü "Verfeinern" aus dem Protokollbereich und klicken Sie auf xmipp3-highres.Geben Sie die importierten Partikel und Volumina aus den vorherigen Schritten als Bilder in voller Größe bzw. Anfangsvolumina ein und setzen Sie die Symmetriegruppe auf ikosaedrisch. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Bildausrichtung unter Winkelzuweisung die Option global aus, legen Sie die maximale Zielauflösung auf drei Angström fest und führen Sie den Auftrag aus. Um eine lokale Ausrichtung durchzuführen, wählen Sie xmipp3-highres global aus, ändern Sie continue from previous run in yes und wählen Sie den vorherigen Job aus.Ändern Sie dann auf der Registerkarte Winkelzuweisung die Bildausrichtung auf lokal und legen Sie die maximale Zielauflösung auf 2,1 Angström fest. Klicken Sie nach Abschluss des Vorgangs im Fenster xmipp3-highres-Ergebnisse auf Diagramme mit Bildschirmauflösung, um zu sehen, wie sich der FSC nach der Verfeinerung geändert hat, und klicken Sie auf Plot-Histogramm mit Winkeländerungen, um zu sehen, ob sich die Euler-Winkelzuweisungen geändert haben. Überprüfen Sie das Volumen in UCSF Chimera.Zoomen Sie hinein und suchen Sie nach hochauflösenden Funktionen. Mikroaufnahmen mit guter CTF-Passform und niedrigem Astigmatismus wurden für die weitere Verarbeitung ausgewählt, während solche mit hohem Astigmatismus und Forfait verworfen wurden. Mittelwerte der 2D-Klasse mit genau definierten Klassen wurden ausgewählt, und solche mit niedriger Auflösung, Rauschen und partiellen Partikeln wurden abgelehnt.Hier sind Bereiche der Kryo-Elektronenmikroskopie-Karte mit atomaren Koordinaten eines adeno-assoziierten Virus dargestellt. Gut definierte EM-Dichten ermöglichen die Anpassung von Seitenketten einzelner Aminosäuren, Wassermoleküle und Magnesiumionen. FSC-Kurven, die mit CryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion berechnet wurden, zeigen eine zunehmende Auflösung im gesamten Workflow, Auflösungsschätzungen in vier verschiedenen Schichten durch die Strukturen und Auflösungshistogramme zeigen die inkrementelle Verbesserung der lokalen Auflösung zwischen den Karten während des gesamten Workflows.Die Kombination von Kryo-EM-Verarbeitungsalgorithmen von CryoSPARC, RELION-3, Scipion und Phoenix führte zu einer Auflösungserhöhung der adenoassoziierten Virusstrukturen von 2,9 auf 2,3 Angström in der gesamten Verarbeitungspipeline. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die in jedem Schritt angegebenen Parameter von Proben und Mikroskopen abhängig sind. Darüber hinaus hängt die Fähigkeit, eine hohe Auflösung zu erreichen, stark von der Qualität der Probe und der Rohdaten ab.In diesem Video stellen wir den robusten SP-Workflow zur Verarbeitung von Kryo-EM-Daten über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor. Mit diesem Ansatz kann man Algorithmen für mehrere Programme implementieren, um Kryostrukturen zu verfeinern und zu validieren. Dieser Workflow kann auf Strukturberechnungen einer Vielzahl von makromolekularen Anordnungen angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...