Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

אנו מודים לקרלוס אוסקר סורזאנו על העזרה בהתקנת Scipion3 וקיליאן שנלה וארנה מולר על העזרה בהעברת נתונים בין פלטפורמות עיבוד שונות. חלק ממחקר זה נתמך על ידי מענק NIH U24GM129547 ובוצע ב- PNCC ב- OHSU ונגיש באמצעות EMSL (רשת.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדע בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי. מחקר זה נתמך על ידי מענק סטארט-אפ מאוניברסיטת ראטגרס לארק קולצ'יק.

1. יצירת פרויקט v3 קריוSPARC חדש וייבוא נתונים
הערה: הנתונים נרכשו באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (OHSU) בפורטלנד באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים טיטאן Krios 300 kV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר פלקון 3. התמונות נאספו במצב ספירה עם מינון כולל של 28.38 e−/Å2 מחולק על פני 129 מ?...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

במאמר זה, אנו מציגים זרימת עבודה חזקה של SPA לעיבוד נתונים Cryo-EM בפלטפורמות תוכנה שונות כדי להשיג שחזורי תלת-ממד ברזולוציה גבוהה (איור 1). זרימת עבודה זו חלה על מגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות. השלבים הבאים של הפרוטוקול מפורטים באיור 4, כולל טרום עיבוד סרט, ק...

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) וניתוח חלקיקים בודדים (SPA) מאפשרים קביעת מבנה של מגוון רחב של מכלולים ביו-מולקולריים במצבם הלחותי, ומסייעים להאיר את תפקידיהם של מקרומולקולות אלה בפירוט אטומי. שיפורים במיקרוסקופ אופטיקה, חומרת מחשב, ותוכנה לעיבוד תמונה אפשרו לקבוע מבנים של ביומולקולות ברזולוציה להגיע מעבר 2 Å1,2,3. יותר מ-2,300 מבני קריו-EM הופקדו במאגר נתוני החלבון (PDB) ב-2020, לעומת 192 מבנים ב-2014, מה שמצביע על כך שהקפאה-EM הפכה לשיטת הבחירה של ביולוגים מבניים רבים. כאן אנו מתארים זרימת עבודה המשלבת שלוש תוכניות ספא שונות לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה (איור 1).
המטרה של SPA היא לשחזר אמצעי אחסון תלת-ממדיים של דגימת יעד מתמונות דו-ממדיות רועשות שנרשמו על ידי גלאי מיקרוסקופ. גלאים אוספים תמונות כסרטים עם מסגרות בודדות של אותו שדה ראייה. על מנת לשמר את המדגם, מסגרות נאספים עם מינון אלקטרונים נמוך ולכן יש יחס אות לרעש גרוע (SNR). בנוסף, חשיפה לאלקטרונים יכולה לגרום לתנועה בתוך רשתות ההקפאה-EM המיובשות, וכתוצאה מכך טשטוש תמונה. כדי להתגבר על בעיות אלה, מסגרות מיושרות כדי לתקן עבור תנועה הנגרמת על ידי קרן וממוצע להניב מיקרוגרף עם SNR מוגבר. מיקרוגרפים אלה עוברים הערכה של פונקציית העברת ניגודיות (CTF) כדי להסביר את ההשפעות של דפוקוס וסטיות שהוטלו על ידי המיקרוסקופ. מהמיקרוגרפים המתוקנים של CTF, חלקיקים בודדים נבחרים, מופקים ומוינים לממוצעים דו-ממדיים המייצגים אוריינטציות שונות שאומצו על ידי הדגימה בקרח זגוגי. קבוצת החלקיקים ההומוגנית שנוצרת משמשת כקלט לשחזור תלת-ממדי ab initio כדי ליצור מודל או מודלים גסים, אשר לאחר מכן מעודנים באופן איטרטיבי כדי לייצר מבנה אחד או יותר ברזולוציה גבוהה. לאחר השחזור, שיפורים מבניים מבוצעים כדי לשפר עוד יותר את האיכות והרזולוציה של מפת cryo-EM. לבסוף, מודל אטומי נגזר ישירות מהמפה, או שהמפה מצוידת בקואורדינטות אטומיות המתקבלות במקום אחר.
חבילות תוכנה שונות זמינות כדי להשלים את המשימות המתוארות לעיל, כולל Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, ואחרים. בעוד שתוכניות אלה מבצעות שלבי עיבוד דומים, הן משתמשות באלגוריתמים שונים, לדוגמה, כדי לבחור חלקיקים, ליצור מודלים ראשוניים ולמקד שחזורים. בנוסף, תוכניות אלה דורשות רמה משתנה של ידע משתמש והתערבות לפעול, כמו כמה תלויים כוונון עדין של פרמטרים שיכולים לשמש משוכה עבור משתמשים חדשים. אי-התאמות אלה גורמות לעתים קרובות למפות עם איכות ורזולוציה לא עקביות בפלטפורמות14, מה שגורם לחוקרים רבים להשתמש בחבילות תוכנה מרובות כדי למקד ולאמת תוצאות. במאמר זה, אנו מדגישים את השימוש של cryoSPARC v3, RELION-3, ו Scipion 3 כדי לקבל שחזור 3D ברזולוציה גבוהה של AAV, וקטור נפוץ לטיפול גנטי15. חבילות התוכנה הנ"ל הן בחינם למשתמשים אקדמיים; cryoSPARC v3 ו Scipion 3 דורשים רישיונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

ההתפתחויות האחרונות הן בתוכנות מכשור והן בתוכנת עיבוד תמונה הפכו מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון של חלקיק יחיד (קריו-EM) לשיטה המועדפת על ביולוגים מבניים לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של מגוון רחב של מקרומולקולות. חבילות תוכנה מרובות זמינות למשתמשים חדשים ומומחים לעיבוד תמונה וחישוב מבנה, המייעלים את אותה זרימת עבודה בסיסית: סרטים שנרכשו על ידי גלאי המיקרוסקופ עוברים תיקון להערכת תנועה והעברת ניגודיות (CTF) הנגרמת על ידי קרן. לאחר מכן, תמונות חלקיקים נבחרות ומופקות ממסגרות סרט ממוצעות לסיווג דו-ממדי ותלת-ממדי איטראטיבי, ולאחר מכן שחזור, עידון ואימות תלת-ממדיים. מכיוון שחבילות תוכנה שונות משתמשות באלגוריתמים שונים ודורשות רמות שונות של מומחיות כדי לפעול, המפות התלת-ממדיות שהן מייצרות שונות לעתים קרובות באיכות וברזולוציה. לכן, משתמשים באופן קבוע להעביר נתונים בין מגוון רחב של תוכניות לקבלת תוצאות אופטימליות. מאמר זה מספק מדריך למשתמשים לנווט בזרימת עבודה על פני חבילות התוכנה הפופולריות: cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3 כדי לקבל מבנה רזולוציה כמעט אטומית של הווירוס הקשור לאדנו (AAV). אנו מפרטים תחילה צינור עיבוד תמונה עם cryoSPARC v3, שכן האלגוריתמים היעילים שלו ו- GUI קל לשימוש מאפשרים למשתמשים להגיע במהירות למפה תלת-ממדית. בשלב הבא, אנו משתמשים ב- PyEM ובסקריפטים פנימיים כדי להמיר ולהעביר קואורדינטות חלקיקים מהשחזור התלת-ממדי האיכותי ביותר המתקבל ב- cryoSPARC v3 ל- RELION-3 ו- Scipion 3 ולחשב מחדש מפות תלת-ממדיות. לבסוף, אנו מתארים שלבים לעידון נוסף ואימות של המבנים המתקבלים על ידי שילוב אלגוריתמים מ- RELION-3 ו- Scipion 3. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.

הצגנו צינור ספא מקיף כדי לקבל מבנה ברזולוציה גבוהה באמצעות שלוש פלטפורמות עיבוד שונות: cryoSPARC v3, RELION-3, ו Scipion 3. איור 1 ואיור 4 מסכמים את זרימת העבודה הכללית של העיבוד, וטבלה 1 מפרטת פרוטוקולי עידון. פרוטוקולים אלה שימשו במהלך עידון של מבנה 2.3 Å של AAV, השג?...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

מאמר זה מתאר כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד קריו-EM, כלומר, cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3, כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים של חלקיקים בודדים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון חד-חלקיקית היא השיטה לקביעת קביעות מובנות של מקרומולקולות ברזולוציה אטומית קרובה. חבילות תוכנה מרובות זמינות לעיבוד תמונה וחישובי מבנה, אך התוצאה במפות תלת-ממדיות משתנה לעתים קרובות באיכות וברזולוציה בשל ההבדלים באלגוריתמים המוחלים במהלך חישובים. לכן, באמצעות שילוב של תוכניות שונות הוא לעתים קרובות מועיל כדי להשיג את התוצאות האופטימליות.פרוטוקול זה מנחה משתמשים לנווט בזרימת עבודה בשלוש פלטפורמות עיבוד שונות של cryo-EM:CryoSPARC, RELION ו- Scipion. אנו נדגים כיצד להשתמש בצינור זה כדי להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה של הנגיף הקשור לאדנו שהוא וקטור נפוץ לטיפול גנטי. לאחר פתיחת CryoSPARC v3 בדפדפן אינטרנט ויצירת סביבת העבודה עבור הפרוייקט, נווט לסביבת העבודה החדשה ופתח את בונה המשימות בחלונית הימנית.לחץ על ייבוא סרטים וספק את נתיב הסרטים וקבל נתיב קובץ הפניה. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הרכישה. לאחר מכן, לחץ על התור, בחר נתיב להפעלת המשימה וסביבת העבודה ולחץ על צור.פתח את תיקון תנועת התיקון ואת כרטיס העבודה של ייבוא סרטים. לאחר מכן גרור את הפלט imported_movies למציין המיקום של הסרטים במשימה החדשה ועמד בתור למשימה. כדי לבצע את פונקציית העברת הניגודיות או את הערכת CTF, פתח את הערכת CTF של תיקון.הזן את המיקרוגרפים שנוצרו והעמד את המשימה בתור. כדי לבדוק את המיקרוגרפים המתוקנים הממוצעים וה- CTF ולבחור קבוצת משנה לעיבוד נוסף, פתח חשיפות אוצרות, הזן את החשיפות שהושגו מהשלב הקודם ועמד בתור את המשימה. לאחר שהעבודה נכנסת למצב המתנה, לחץ על הכרטיסיה האינטראקטיבית בכרטיס העבודה.התאם את סף הפרמטרים וקבל או דחה מיקרוגרפים בודדים לצורך עיבוד נוסף. בעת עיבוד הנתונים הנוכחיים, הגדר את הסף העליון של אסטיגמציה ל 400 אנגסטרום, CTF להתאים רזולוציה לחמישה אנגסטרום ועובי קרח יחסי לשניים. לאחר מכן לחץ על נעשה כדי לבחור את המיקרוגרפים לעיבוד במורד הזרם.לאיסוף ידני, פתח את הבורר הידני. הזן את החשיפות המקובלות והעמד את המשימה בתור. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה האינטראקטיבית, הגדר את גודל התיבה ל -300 פיקסלים ולחץ על כמה מאות חלקיקים על פני מיקרוגרפים מרובים, תוך הימנעות מחלקיקים חופפים.לאחר סיום עם הבחירה, לחץ על עשה לקטוף חלקיקי תמצית. לאחר מכן, כדי ליצור תבניות לקטיף חלקיקים אוטומטי, לחץ על סיווג דו-ממדי והזן את בחירות החלקיקים שנוצרו. לאחר מכן שנה את מספר המחלקות הדו-ממדיות ל- 10 והעמד את המשימה בתור.לאחר מכן, פתחו בחר מחלקות דו-ממדיות והזן את החלקיקים ואת ממוצעי המחלקות שהושגו בשלב הקודם. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה האינטראקטיבית, בחר מחלקות דו-ממדיות מייצגות עם יחס אות לרעש טוב ולחץ על סיום. לאיסוף חלקיקים מבוסס תבנית, פתחו את בורר התבניות והאזינו את המחלקות והמיקרוגרפים הדו-ממדיים שנבחרו.לאחר מכן הגדר את קוטר החלקיקים ל-220 אנגסטרום ותעמוד בתור למשימה. לבסוף, פתחו תמצית ממיקרוגרפים והכניסו את המיקרוגרפים והחלקיקים המתקבלים מבדיקת בחירות חלקיקים. לאחר מכן הגדר את גודל התיבה שחולצה ל- 300 פיקסלים ועמד בתור למשימה.לסיווג דו-ממדי, לחצו על סיווג דו-ממדי והכניסו את החלקיקים שחולצו. לאחר מכן הגדר את מספר המחלקות הדו-ממדיות ל- 50 והגדר את המשימה בתור. לאחר מכן, פתחו בחר מחלקות דו-ממדיות והזן את החלקיקים המתקבלים ואת ממוצעי המחלקות.לחץ על הכרטיסיה האינטראקטיבית. בחרו מחלקות דו-ממדיות בהתבסס על הרזולוציה ומספר החלקיקים במחלקה ולחצו על 'בוצע'. כדי ליצור נפח תלת-ממדי ראשוני, פתחו את שחזור ab-initio והזן את החלקיקים מהסיווג הדו-ממדי הסופי.לאחר מכן התאם את הסימטריה לאיקוסהדרל ועמד בתור למשימה. לאחר מכן, פתח עידון הומוגני, הזן את עוצמת הקול מהשלב הקודם וחלקיקים מהסיווג הדו-ממדי הסופי. לאחר מכן שנה את הסימטריה והעמיד את המשימה בתור בתור.לאחר סיום המשימה, בדוק את המתאם של מעטפת פורייה או את עקומת FSC והורד את אמצעי האחסון לבדיקה בכימרה של UCSF. ב- CryoSPARC v3, פתח את כרטיס העבודה של משימת המחלקה הדו-ממדית שנבחרה מהסיווג הדו-ממדי הסופי. לאחר מכן, בכרטיסיה פרטים, לחץ על משימת ייצוא.באמצעות PyEM, המר את particles_exported. תבנית cs file to star על-ידי ביצוע הפקודה שצוינה. לאחר לחיצה על מיצוי חלקיקים, בכרטיסיית הקלט/פלט, הזן את המיקרוגרפים והקואורדינטות המתוקנות של CTF.לאחר מכן לחץ על כרטיסיית החילוץ, שנה את גודל תיבת החלקיקים ל-300 פיקסלים והפעל את המשימה. עבור עידון תלת-ממדי, השתמש במפה שנוצרה ב- CryoSPARC v3 כמודל ראשוני ב- RELION-3. בחר את שיטת הייבוא והגדר את הפרמטרים שצוינו בכרטיסיה קלט/פלט.לאחר מכן, בכרטיסיה אחרים, בחר את מפת v3 CryoSPARC כקובץ הקלט, שנה את סוג הצומת להפניה תלת-ממדית והפעל את המשימה. לאחר מכן, בחרו בעידון האוטומטי התלת-ממדי ובכרטיסיית הקלט/פלט, הגדר תמונות קלט כחלקיקים. קובץ כוכב ממשימת הבחירה האחרונה.השתמש בשחזור v3 CryoSPARC כמפת הייחוס, לחץ על כרטיסיית ההפניה ושנה את מסנן המעבר הנמוך הראשוני ל -50 אנגסטרום וסימטריה לאיקוסהדרל. לאחר מכן, בכרטיסיית המיטוב, שנה את קוטר המסיכה ל- 280 אנגסטרום והפעל את המשימה. לעיבוד פוסט, לחץ על לאחר העיבוד.ובכרטיסיית הקלט/פלט, הזן את חצאי המפות והמסיכה שנוצרו והגדר את גודל הפיקסלים המכויל ל- 1.045 אנגסטרום. לאחר מכן, בכרטיסיית החידוד, עבור גורם B הערכה באופן אוטומטי, קלט כן. לקבלת הרזולוציה הנמוכה ביותר להתאמת B אוטומטית, קלט 10.ולשימוש ב-פקטור B משלך, קלט לא. לבסוף, בכרטיסיית המסנן, הגדר דילוג על שקלול FSC ל-לא והפעל את המשימה. לאימוני ליטוש, פתחו את הליטוש הבייסיאני.ובכרטיסיית הקלט/פלט, הזן את המיקרוגרפים, החלקיקים והפוסט-תהליך המתוקנים בתנועה. קובץ כוכב שהושג בעבר. לחץ על כרטיסיית האימון והגדר את הפרמטרים האופטימליים של הרכבת ל- yes, שבר של פיקסלים של Fourier לבדיקה ל- 0.5 והשתמש בחלקיקים רבים אלה עד 5, 000.אז תנהל את העבודה. לאחר סיום עבודת האימון, לחץ על ליטוש בייסיאני. לאחר מכן, בכרטיסיית האימון, הגדר את הפרמטרים האופטימליים של הרכבת ל- No.בחר בכרטיסיית הלק ובקובץ פרמטר ממוטב, ציין את הנתיב opt_params_all_groups. txt קובץ מהשלב הקודם ולחץ על הפעל. כדי להעריך סטיות סדר גבוהות יותר, פתח את עידון CTF.ובכרטיסיה קלט/פלט תחת חלקיקים, בחר את הנתיב לקובץ הכוכב המכיל חלקיקים מלוטשים ממשימת התלת-ממד המעודנת האחרונה. לאחר מכן, תחת קובץ STAR לאחר תהליך, הגדר את הנתיב לפלט ממשימת הפוסט-עיבוד האחרונה. לאחר מכן, בחר בכרטיסיה התאמה והגדר את ההגדלה האניסוטרופית של הערכה ל'לא'.בצע התאמת פרמטר CTF ל- No. הערכת beamtilt ל כן. גם להעריך trefoil ל כן.ולהעריך סטיות מסדר רביעי לכן. אז תנהל את העבודה. כדי למקד ולאמת עוד יותר את מפת RELION-3, הפעל את Scipion 3 וצור פרוייקט חדש.בחלונית הפרוטוקולים הימנית, בחרו ברשימה הנפתחת 'יבוא' ולחצו על חלקיקי יבוא. שנה את הפרמטרים המיובאים מ- RELION-3 וקובץ כוכב ל- postprocess.star. לאחר מכן ציין את פרמטרי הרכישה כפי שהוכח קודם לכן ולחץ על ביצוע.לאחר מכן, לחץ על הרשימה הנפתחת של היבוא ובחר אמצעי אחסון לייבוא. תחת ייבוא מ, תן את הנתיב למפת RELION-3, שנה את קצב הדגימה בגודל פיקסל ל- 1.045 אנגסטרום לפיקסל ובצע. כדי לבצע יישור כללי, בחרו בתפריט הנפתח 'מקד' מהחלונית 'פרוטוקולים' ולחצו על xmipp3-highres.הזן את החלקיקים והנפחים המיובאים מהשלבים הקודמים כתמונות בגודל מלא ובאמצעי אחסון ראשוניים בהתאמה והגדר את קבוצת הסימטריה לאיקוסהדרל. לאחר מכן, בכרטיסיה יישור תמונה תחת הקצאה זוויתית, בחר כללי, הגדר את רזולוציית היעד המרבית לשלושה אנגסטרום והפעל את המשימה. כדי לבצע יישור מקומי, בחר xmipp3-highres כללי, שנה המשך מההפעלה הקודמת ל- yes ובחר את המשימה הקודמת.לאחר מכן, בכרטיסיה הקצאה זוויתית, שנה את יישור התמונה למקומי והגדר את רזולוציית היעד המרבית ל- 2.1 אנגסטרום. לאחר סיום, בחלון התוצאות xmipp3-highres, לחץ על התוויות רזולוציית תצוגה כדי לראות כיצד ה- FSC השתנה לאחר עידון ולחץ על התוויית היסטוגרמה עם שינויים זוויתיים כדי לראות אם הקצאות הזווית של אוילר השתנו. בדוק את עוצמת הקול בכימרה UCSF.הגדל את התצוגה וחפש תכונות ברזולוציה גבוהה. מיקרוגרפים עם התאמה טובה CTF ואסטיגמציה נמוכה נבחרו לעיבוד נוסף, בעוד אלה עם אסטיגמציה גבוהה והפסד הושלכו. נבחרו ממוצעי מחלקות דו-ממדיים המכילים מחלקות מוגדרות היטב, ואלה עם רזולוציה נמוכה, רעש וחלקיקים חלקיים נדחו.אזורים במפת המיקרוסקופיה של קריו-אלקטרון המצוידים בקואורדינטות אטומיות של וירוס הקשור לאדנו מוצגים כאן. צפיפות EM מוגדרת היטב מאפשרת שרשראות צד מתאימות של חומצות אמינו בודדות, מולקולות מים ויוני מגנזיום. עקומות FSC שחושבו באמצעות CryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion מצביעות על רזולוציה הולכת וגוברת לאורך זרימת העבודה, הערכות רזולוציה בארבע פרוסות שונות דרך המבנים והיסטוגרמה של הרזולוציה ממחישות את השיפור המצטבר ברזולוציה המקומית בין המפות לאורך זרימת העבודה.שילוב של אלגוריתמי עיבוד קריו-EM של CryoSPARC, RELION-3, Scipion ו- Phoenix הביא לעלייה ברזולוציה של מבני הווירוסים הקשורים לאדנו מ-2.9 ל-2.3 אנגסטרום על פני צינור העיבוד. חשוב לזכור כי הפרמטרים שצוינו בכל שלב הם מדגם ותלוי מיקרוסקופ. בנוסף, היכולת להגיע לרזולוציה גבוהה תלויה מאוד באיכות המדגם ובנתונים הגולמיים.בסרטון וידאו זה, אנו מציגים את זרימת העבודה החזקה SP לעיבוד נתוני קריו-EM בפלטפורמות תוכנה שונות. באמצעות גישה זו, ניתן ליישם אלגוריתמים עבור תוכניות מרובות כדי לחדד ולאמת מבני קריו. ניתן להחיל זרימת עבודה זו על חישובי מבנה של מגוון רחב של הרכבות מקרומולקולריות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...