Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

हम Scipion3 स्थापना और Kilian Schnelle और Arne Moeller विभिन्न प्रसंस्करण प्लेटफार्मों के बीच डेटा हस्तांतरण के साथ मदद के लिए मदद के लिए कार्लोस ऑस्कर Sorzano धन्यवाद. इस शोध का एक हिस्सा एनआईएच अनुदान U24GM129547 द्वारा समर्थित था और OHSU में PNCC में प्रदर्शन किया गया था और EMSL (grid.436923.9) के माध्यम से एक्सेस किया गया था, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय द्वारा प्रायोजित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा का एक डीओई कार्यालय। इस अध्ययन को रटगर्स विश्वविद्यालय से अरेक कुल्जिक को स्टार्ट-अप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

1. एक नया क्रायोस्पार्क v3 परियोजना बनाना और डेटा आयात करना
नोट: पोर्टलैंड में ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी (OHSU) में एक फाल्कन 3 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से सुसज्जित 300 केवी टाइट?...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

इस लेख में, हम उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 1) प्राप्त करने के लिए विभिन्न सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म पर क्रायो-ईएम डेटा प्रोसेसिंग के लिए एक मजबूत एसपीए वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते ह?...

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) और एकल-कण विश्लेषण (एसपीए) अपने हाइड्रेटेड राज्य में विभिन्न प्रकार के बायोमोलेक्यूलर असेंबली की संरचना निर्धारण को सक्षम करते हैं, जिससे परमाणु विस्तार में इन मैक्रोमोलेक्यूल्स की भूमिकाओं को रोशन करने में मदद मिलती है। माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स, कंप्यूटर हार्डवेयर और छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में सुधार ने 2 Å1,2,3 से परे तक पहुंचने वाले रिज़ॉल्यूशन पर बायोमोलेक्यूल्स की संरचनाओं को निर्धारित करना संभव बना दिया है। 20144 में 192 संरचनाओं की तुलना में 2020 में प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में 2,300 से अधिक क्रायो-ईएम संरचनाएं जमा की गई थीं, जो यह दर्शाती हैं कि क्रायो-ईएम कई संरचनात्मक जीवविज्ञानियों के लिए पसंद की विधि बन गई है। यहां, हम उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण (चित्रा 1) के लिए तीन अलग-अलग एसपीए कार्यक्रमों के संयोजन वाले वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं।
एसपीए का लक्ष्य एक माइक्रोस्कोप डिटेक्टर द्वारा दर्ज शोर 2 डी छवियों से एक लक्ष्य नमूने के 3 डी वॉल्यूम का पुनर्निर्माण करना है। डिटेक्टरों को देखने के एक ही क्षेत्र के व्यक्तिगत फ्रेम के साथ फिल्मों के रूप में छवियों को इकट्ठा करते हैं। नमूने को संरक्षित करने के लिए, फ्रेम को कम इलेक्ट्रॉन खुराक के साथ एकत्र किया जाता है और इस प्रकार एक खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) होता है। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रॉन एक्सपोजर विट्रिफाइड क्रायो-ईएम ग्रिड के भीतर गति को प्रेरित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि-धुंधला हो जाती है। इन मुद्दों को दूर करने के लिए, फ्रेम को बीम-प्रेरित गति के लिए सही करने के लिए संरेखित किया जाता है और एक बढ़े हुए एसएनआर के साथ एक माइक्रोग्राफ उत्पन्न करने के लिए औसत किया जाता है। ये माइक्रोग्राफ तब माइक्रोस्कोप द्वारा लगाए गए डिफोकस और विपथन के प्रभावों के लिए खाते में कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) अनुमान से गुजरते हैं। सीटीएफ-सही माइक्रोग्राफ से, व्यक्तिगत कणों का चयन किया जाता है, निकाला जाता है, और 2 डी वर्ग के औसत में क्रमबद्ध किया जाता है जो विट्रियस बर्फ में नमूने द्वारा अपनाए गए विभिन्न झुकावों का प्रतिनिधित्व करता है। कणों के परिणामी सजातीय सेट का उपयोग एक मोटे मॉडल या मॉडल उत्पन्न करने के लिए एब इनिशियो 3 डी पुनर्निर्माण के लिए इनपुट के रूप में किया जाता है, जो तब एक या अधिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए पुनरावर्ती रूप से परिष्कृत होते हैं। पुनर्निर्माण के बाद, क्रायो-ईएम मानचित्र की गुणवत्ता और संकल्प में और सुधार करने के लिए संरचनात्मक शोधन किए जाते हैं। अंत में, या तो एक परमाणु मॉडल सीधे नक्शे से व्युत्पन्न होता है, या मानचित्र को कहीं और प्राप्त परमाणु निर्देशांक के साथ फिट किया जाता है।
विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेज ऊपर उल्लिखित कार्यों को पूरा करने के लिए उपलब्ध हैं, जिनमें Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, और अन्य शामिल हैं। जबकि ये कार्यक्रम समान प्रसंस्करण चरणों का पालन करते हैं, वे विभिन्न एल्गोरिदम को नियोजित करते हैं, उदाहरण के लिए, कणों को चुनने, प्रारंभिक मॉडल उत्पन्न करने और पुनर्निर्माण को परिष्कृत करने के लिए। इसके अतिरिक्त, इन कार्यक्रमों को संचालित करने के लिए उपयोगकर्ता ज्ञान और हस्तक्षेप के एक अलग स्तर की आवश्यकता होती है, क्योंकि कुछ पैरामीटर की ठीक-ट्यूनिंग पर निर्भर करते हैं जो नए उपयोगकर्ताओं के लिए बाधा के रूप में कार्य कर सकते हैं। इन विसंगतियों के परिणामस्वरूप अक्सर प्लेटफ़ॉर्म 14 में असंगत गुणवत्ता और रिज़ॉल्यूशन के साथ नक्शे होते हैं, जिससे कई शोधकर्ताओं को परिणामों को परिष्कृत और मान्य करने के लिए कई सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग करने के लिए प्रेरित किया जाता है। इस लेख में, हम क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 के उपयोग को उजागर करते हैं ताकि AAV के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 D पुनर्निर्माण को प्राप्त किया जा सके, जो जीन थेरेपी 15 के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला वेक्टर है। उपर्युक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज अकादमिक उपयोगकर्ताओं के लिए स्वतंत्र हैं; क्रायोस्पार्क v3 और Scipion 3 को लाइसेंस की आवश्यकता होती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

इंस्ट्रूमेंटेशन और इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर दोनों में हाल की प्रगति ने एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को संरचनात्मक जीवविज्ञानियों के लिए पसंदीदा विधि बना दिया है ताकि मैक्रोमोलेक्यूल्स की एक विस्तृत विविधता की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को निर्धारित किया जा सके। छवि प्रसंस्करण और संरचना गणना के लिए नए और विशेषज्ञ उपयोगकर्ताओं के लिए कई सॉफ़्टवेयर सुइट्स उपलब्ध हैं, जो एक ही मूल वर्कफ़्लो को सुव्यवस्थित करते हैं: माइक्रोस्कोप डिटेक्टरों द्वारा अधिग्रहित फिल्में बीम-प्रेरित गति और कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) अनुमान के लिए सुधार से गुजरती हैं। इसके बाद, कण छवियों का चयन किया जाता है और पुनरावर्ती 2 डी और 3 डी वर्गीकरण के लिए औसत फिल्म फ्रेम से निकाला जाता है, इसके बाद 3 डी पुनर्निर्माण, शोधन और सत्यापन होता है। क्योंकि विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेज विभिन्न एल्गोरिदम को नियोजित करते हैं और संचालित करने के लिए विशेषज्ञता के विभिन्न स्तरों की आवश्यकता होती है, इसलिए वे जो 3 डी मानचित्र उत्पन्न करते हैं, वे अक्सर गुणवत्ता और संकल्प में भिन्न होते हैं। इस प्रकार, उपयोगकर्ता नियमित रूप से इष्टतम परिणामों के लिए विभिन्न प्रकार के कार्यक्रमों के बीच डेटा स्थानांतरित करते हैं। यह पेपर उपयोगकर्ताओं को लोकप्रिय सॉफ़्टवेयर पैकेजों में वर्कफ़्लो नेविगेट करने के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करता है: adeno-संबद्ध वायरस (AAV) की निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3। हम पहले क्रायोस्पार्क वी 3 के साथ एक छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन का विस्तार करते हैं, क्योंकि इसके कुशल एल्गोरिदम और उपयोग में आसान जीयूआई उपयोगकर्ताओं को जल्दी से 3 डी मानचित्र पर पहुंचने की अनुमति देता है। अगले चरण में, हम PyEM और इन-हाउस लिपियों का उपयोग करने के लिए परिवर्तित करने के लिए और cryoSPARC v3 में प्राप्त सबसे अच्छी गुणवत्ता 3 डी पुनर्निर्माण से कण निर्देशांक स्थानांतरित करने के लिए RELION-3 और Scipion 3 और Scipion 3 और recalculate 3 डी नक्शे. अंत में, हम RELION-3 और Scipion 3 से एल्गोरिदम को एकीकृत करके परिणामी संरचनाओं के आगे शोधन और सत्यापन के लिए चरणों की रूपरेखा तैयार करते हैं। इस आलेख में, हम वर्णन करते हैं कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए विभिन्न प्रकार के डेटा सेट पर लागू एकल और मजबूत वर्कफ़्लो बनाने के लिए तीन प्रसंस्करण प्लेटफ़ॉर्म का प्रभावी ढंग से उपयोग कैसे करें.

हमने तीन अलग-अलग प्रसंस्करण प्लेटफार्मों का उपयोग करके एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए एक व्यापक एसपीए पाइपलाइन प्रस्तुत की है: क्रायोस्पार्क वी 3, रेलिओन -3, और स्किपियन 3। चित्र1...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

यह आलेख वर्णन करता है कि तीन क्रायो-ईएम प्रसंस्करण प्लेटफ़ॉर्म, यानी, क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 का प्रभावी ढंग से उपयोग कैसे करें, उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए विभिन्न प्रकार के एकल-कण डेटा सेट पर लागू एकल और मजबूत वर्कफ़्लो बनाने के लिए।

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

क्रायो-ईएम और Scipion के साथ एकल कण विश्लेषण

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: नमूना से संरचना तक

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

मैनुअल धब्बा-और-डुबकी एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की ठंड

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

क्रायो-ईएम के लिए उच्च तापमान नमूना ग्रिड की तैयारी

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचनात्मक निर्धारण के लिए डीएनए मरम्मत कारकों के साथ जटिल न्यूक्लियोसोम कोर कणों की तैयारी

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

लेगिनन का उपयोग करके स्टेज टिल्ट के साथ सिंगल-पार्टिकल क्रायो-ईएम डेटा संग्रह

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...