Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
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Ringraziamo Carlos Oscar Sorzano per l'aiuto con l'installazione di Scipion3 e Kilian Schnelle e Arne Moeller per l'aiuto con il trasferimento dei dati tra diverse piattaforme di elaborazione. Una parte di questa ricerca è stata supportata dalla sovvenzione NIH U24GM129547 ed eseguita presso il PNCC dell'OHSU e accessibile tramite EMSL (grid.436923.9), un DOE Office of Science User Facility sponsorizzato dall'Office of Biological and Environmental Research. Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di start-up della Rutgers University ad Arek Kulczyk.

1. Creazione di un nuovo progetto cryoSPARC v3 e importazione dei dati
NOTA: I dati sono stati acquisiti presso l'Oregon Health and Science University (OHSU) di Portland utilizzando un microscopio elettronico Titan Krios da 300 kV dotato di un rivelatore di elettroni diretti Falcon 3. Le immagini sono state raccolte in modalità di conteggio con una dose totale di 28,38 e−/Å2 frazionata su 129 fotogrammi e un intervallo di sfocatura da -0,5 μm a -2,5 μ...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

In questo articolo, presentiamo un robusto flusso di lavoro SPA per l'elaborazione dei dati crio-EM su varie piattaforme software per ottenere ricostruzioni 3D ad alta risoluzione (Figura 1). Questo flusso di lavoro è applicabile a un'ampia varietà di macromolecole biologiche. I passaggi successivi del protocollo sono descritti nella Figura 4, tra cui la pre-elaborazione dei filmati, il prelievo e la classificazione delle particelle e diversi metodi per il per...

La microscopia crioelettronica (cryo-EM) e l'analisi a singola particella (SPA) consentono la determinazione della struttura di un'ampia varietà di assemblaggi biomolecolari nel loro stato idratato, contribuendo a illuminare i ruoli di queste macromolecole nei dettagli atomici. I miglioramenti nell'ottica del microscopio, nell'hardware del computer e nel software di elaborazione delle immagini hanno permesso di determinare le strutture delle biomolecole con una risoluzione superiore a 2 Å1,2,3. Più di 2.300 strutture crio-EM sono state depositate nella Protein Data Bank (PDB) nel 2020, rispetto alle 192 strutture del 20144, indicando che la crio-EM è diventata il metodo di scelta per molti biologi strutturali. Qui descriviamo un flusso di lavoro che combina tre diversi programmi SPA per la determinazione della struttura ad alta risoluzione (Figura 1).
L'obiettivo di SPA è quello di ricostruire i volumi 3D di un campione bersaglio da immagini 2D rumorose registrate da un rilevatore al microscopio. I rilevatori raccolgono immagini come filmati con singoli fotogrammi dello stesso campo visivo. Al fine di preservare il campione, i fotogrammi vengono raccolti con una bassa dose di elettroni e quindi hanno uno scarso rapporto segnale-rumore (SNR). Inoltre, l'esposizione elettronica può indurre movimento all'interno delle griglie crio-EM vetrificate, con conseguente sfocatura dell'immagine. Per superare questi problemi, i fotogrammi sono allineati per correggere il movimento indotto dal fascio e mediati per produrre una micrografia con un SNR aumentato. Queste micrografie vengono quindi sottoposte a stima della funzione di trasferimento del contrasto (CTF) per tenere conto degli effetti della sfocatura e delle aberrazioni imposte dal microscopio. Dalle micrografie corrette CTF, le singole particelle vengono selezionate, estratte e ordinate in medie di classe 2D che rappresentano diversi orientamenti adottati dal campione nel ghiaccio vitreo. L'insieme omogeneo di particelle risultante viene utilizzato come input per la ricostruzione 3D ab initio per generare uno o più modelli grossolani, che vengono poi perfezionati iterativamente per produrre una o più strutture ad alta risoluzione. Dopo la ricostruzione, vengono eseguiti perfezionamenti strutturali per migliorare ulteriormente la qualità e la risoluzione della mappa crio-EM. Infine, o un modello atomico è direttamente derivato dalla mappa, o la mappa è dotata di coordinate atomiche ottenute altrove.
Sono disponibili diversi pacchetti software per eseguire le attività sopra descritte, tra cui Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 e altri. Mentre questi programmi seguono fasi di elaborazione simili, impiegano algoritmi diversi, ad esempio, per selezionare particelle, generare modelli iniziali e perfezionare le ricostruzioni. Inoltre, questi programmi richiedono un livello variabile di conoscenza e intervento dell'utente per funzionare, in quanto alcuni dipendono dalla messa a punto dei parametri che possono fungere da ostacolo per i nuovi utenti. Queste discrepanze spesso si traducono in mappe con qualità e risoluzione incoerenti tra le piattaforme14, spingendo molti ricercatori a utilizzare più pacchetti software per perfezionare e convalidare i risultati. In questo articolo, evidenziamo l'uso di cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 per ottenere una ricostruzione 3D ad alta risoluzione di AAV, un vettore ampiamente utilizzato per la terapia genica15. I suddetti pacchetti software sono gratuiti per gli utenti accademici; cryoSPARC v3 e Scipion 3 richiedono licenze.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

I recenti progressi sia nella strumentazione che nel software di elaborazione delle immagini hanno reso la microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) il metodo preferito dai biologi strutturali per determinare strutture ad alta risoluzione di un'ampia varietà di macromolecole. Diverse suite software sono disponibili per utenti nuovi ed esperti per l'elaborazione delle immagini e il calcolo della struttura, che semplificano lo stesso flusso di lavoro di base: i filmati acquisiti dai rilevatori al microscopio vengono sottoposti a correzione per la stima del movimento indotto dal fascio e della funzione di trasferimento del contrasto (CTF). Successivamente, le immagini delle particelle vengono selezionate ed estratte dai fotogrammi di filmato medi per la classificazione iterativa 2D e 3D, seguita da ricostruzione, perfezionamento e convalida 3D. Poiché vari pacchetti software impiegano algoritmi diversi e richiedono diversi livelli di esperienza per funzionare, le mappe 3D che generano spesso differiscono per qualità e risoluzione. Pertanto, gli utenti trasferiscono regolarmente i dati tra una varietà di programmi per risultati ottimali. Questo documento fornisce una guida per gli utenti per navigare in un flusso di lavoro attraverso i pacchetti software più diffusi: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 per ottenere una struttura di risoluzione quasi atomica del virus adeno-associato (AAV). Per prima cosa dettagliamo una pipeline di elaborazione delle immagini con cryoSPARC v3, poiché i suoi algoritmi efficienti e la GUI facile da usare consentono agli utenti di arrivare rapidamente a una mappa 3D. Nella fase successiva, utilizziamo PyEM e script interni per convertire e trasferire le coordinate delle particelle dalla migliore qualità di ricostruzione 3D ottenuta in cryoSPARC v3 a RELION-3 e Scipion 3 e ricalcolare le mappe 3D. Infine, delineiamo i passaggi per un ulteriore perfezionamento e convalida delle strutture risultanti integrando algoritmi di RELION-3 e Scipion 3. In questo articolo, descriviamo come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.

Abbiamo presentato una pipeline SPA completa per ottenere una struttura ad alta risoluzione utilizzando tre diverse piattaforme di elaborazione: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. La Figura 1 e la Figura 4 riepilogano il flusso di lavoro di elaborazione generale e nella Tabella 1 vengono descritti in dettaglio i protocolli di perfezionamento. Questi protocolli sono stati utilizzati durante i perfezionamenti di una struttura 2.3 Å di AAV, raggi...

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Questo articolo descrive come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione crio-EM, ovvero cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati a particella singola per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.

Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

La microscopia crioelettronica a singola particella è il metodo per le determinazioni strutturate di macromolecole a risoluzione quasi atomica. Sono disponibili più pacchetti software per l'elaborazione delle immagini e i calcoli della struttura, ma il risultato sulle mappe 3D spesso varia in termini di qualità e risoluzione a causa delle differenze negli algoritmi applicati durante i calcoli. Pertanto, l'utilizzo di una combinazione di diversi programmi è spesso utile per ottenere risultati ottimali.Questo protocollo guida gli utenti a navigare nel flusso di lavoro attraverso tre diverse piattaforme di elaborazione crio-EM: CryoSPARC, RELION e Scipion. Dimostreremo come utilizzare questa pipeline per ottenere una struttura ad alta risoluzione del virus adeno-associato che è un vettore ampiamente utilizzato per la terapia genica. Dopo aver aperto CryoSPARC v3 in un browser Web e aver creato l'area di lavoro per il progetto, passare alla nuova area di lavoro e aprire il generatore di processi nel pannello di destra.Fare clic su Importa filmati e fornire il percorso dei filmati e ottenere il percorso del file di riferimento. Quindi impostare i parametri di acquisizione. Quindi, fai clic su coda, seleziona una corsia per eseguire il processo e un'area di lavoro e fai clic su Crea.Aprire la correzione del movimento della patch e la scheda di lavoro importa filmati. Quindi trascinare l'output imported_movies sul segnaposto dei filmati nel nuovo processo e mettere in coda il processo. Per eseguire la funzione di trasferimento del contrasto o la stima CTF, aprire la stima CTF della patch.Immettere le micrografie generate e mettere in coda il processo. Per ispezionare le micrografie corrette in media e CTF e selezionare un sottoinsieme per ulteriori elaborazioni, aprire le esposizioni curate, inserire le esposizioni ottenute dal passaggio precedente e mettere in coda il lavoro. Dopo che il lavoro è entrato in modalità di attesa, fare clic sulla scheda interattiva sulla scheda del lavoro.Regolare le soglie dei parametri e accettare o rifiutare singole micrografie per un'ulteriore elaborazione. Durante l'elaborazione dei dati attuali, impostare la soglia superiore di astigmatismo a 400 angstrom, CTF adattare la risoluzione a cinque angstrom e lo spessore relativo del ghiaccio a due. Quindi fare clic su fatto per selezionare le micrografie per l'elaborazione a valle.Per il prelievo manuale, aprire il selettore manuale. Immettere le esposizioni accettate e mettere in coda il processo. Quindi fare clic sulla scheda interattiva, impostare la dimensione della casella su 300 pixel e fare clic su alcune centinaia di particelle su più micrografie, evitando particelle sovrapposte.Una volta terminata la selezione, fare clic su Fatto prelievo delle particelle estratte. Successivamente, per generare modelli per il prelievo automatico delle particelle, fare clic sulla classificazione 2D e inserire i prelievi di particelle generati. Quindi modificare il numero di classi 2D in 10 e mettere in coda il processo.Quindi, apri seleziona le classi 2D e inserisci le particelle e le medie di classe ottenute nel passaggio precedente. Quindi fare clic sulla scheda interattiva, selezionare le classi 2D rappresentative con un buon rapporto segnale-rumore e fare clic su fatto. Per il prelievo di particelle basato su modelli, aprire il selettore di modelli e inserire le classi 2D e le micrografie selezionate.Quindi impostare il diametro della particella su 220 angstrom e mettere in coda il lavoro. Infine, aprire l'estratto dalle micrografie e inserire le micrografie e le particelle ottenute dall'ispezione dei prelievi di particelle. Quindi impostare la dimensione della casella estratta su 300 pixel e accodare il processo.Per la classificazione 2D, fare clic su Classificazione 2D e inserire le particelle estratte. Quindi impostare il numero di classi 2D su 50 e mettere in coda il processo. Quindi, apri le classi 2D selezionate e inserisci le particelle ottenute e le medie di classe.Fare clic sulla scheda interattiva. Scegli le classi 2D in base alla risoluzione e al numero di particelle nella classe e fai clic su Fatto. Per generare un volume 3D iniziale, aprire la ricostruzione ab-initio e inserire le particelle dalla classificazione 2D finale.Quindi regolare la simmetria a icosaedrico e mettere in coda il lavoro. Quindi, apri la raffinazione omogenea, inserisci il volume dal passaggio precedente e le particelle dalla classificazione 2D finale. Quindi modificare la simmetria e mettere in coda il processo.Al termine del lavoro, ispezionare la correlazione della shell di Fourier o la curva FSC e scaricare il volume da esaminare in UCSF Chimera. In CryoSPARC v3, aprire la scheda di lavoro del processo di classe 2D selezionato dalla classificazione 2D finale. Quindi, nella scheda dei dettagli, fare clic su Esporta lavoro.Utilizzando PyEM, converti il particles_exported. cs in formato stella eseguendo il comando indicato. Dopo aver fatto clic sull'estrazione delle particelle, nella scheda I/O, inserire le micrografie e le coordinate corrette CTF.Quindi fare clic sulla scheda di estrazione, modificare la dimensione della casella delle particelle a 300 pixel ed eseguire il lavoro. Per il perfezionamento 3D, utilizzare la mappa generata in CryoSPARC v3 come modello iniziale in RELION-3. Selezionare il metodo di importazione e impostare i parametri indicati nella scheda I/O.Quindi, nella scheda Altri, selezionare la mappa CryoSPARC v3 come file di input, modificare il tipo di nodo in riferimento 3D ed eseguire il lavoro. Quindi, selezionare il perfezionamento automatico 3D e nella scheda I / O, impostare le immagini di input come particelle. file a stella dall'ultimo processo di selezione.Utilizzare la ricostruzione CryoSPARC v3 come mappa di riferimento, fare clic sulla scheda di riferimento e modificare il filtro passa-basso iniziale a 50 angstrom e la simmetria in icosaedrico. Quindi, nella scheda ottimizzazione, modificare il diametro della maschera in 280 angstrom ed eseguire il lavoro. Per la post-elaborazione, fare clic su post-elaborazione.E nella scheda I / O, inserisci le mezze mappe e la maschera create e imposta la dimensione dei pixel calibrata su 1.045 angstrom. Quindi sulla scheda nitidezza, per stimare automaticamente il fattore B, immettere sì. Per la risoluzione più bassa per l'adattamento automatico B, input 10.E per usare il tuo fattore B, inserisci no. Infine, nella scheda filtro, impostare Ignora ponderazione FSC su no ed eseguire il processo. Per l'allenamento di lucidatura, lucidatura bayesiana aperta.E nella scheda I/O, inserisci le micrografie, le particelle e il postprocesso corretti per il movimento. file a stella ottenuto in precedenza. Fare clic sulla scheda di allenamento e impostare i parametri ottimali del treno su sì, frazione di pixel di Fourier per il test su 0,5 e utilizzare questo numero di particelle a 5.000.Quindi eseguire il processo. Una volta terminato il lavoro di formazione, fai clic su Lucidatura bayesiana. Quindi, nella scheda allenamento, imposta i parametri ottimali del treno su no.Selezionare la scheda di lucidatura e, nel file dei parametri ottimizzato, specificare il percorso del opt_params_all_groups. txt dal passaggio precedente e fare clic su Esegui. Per stimare le aberrazioni di ordine superiore, aprire il perfezionamento CTF.E nella scheda I/O sotto le particelle, seleziona il percorso del file stellare contenente particelle lucide dal recente lavoro 3D raffinato. Quindi, in file STAR postprocesso, impostare il percorso dell'output dell'ultimo processo di post-elaborazione. Quindi, selezionare la scheda adatta e impostare stimare l'ingrandimento anisotropico su no.Eseguire il fitting del parametro CTF su no. Stimare il beamtilt a sì. Stima anche il trifoglio a sì.E stimare le aberrazioni del quarto ordine a sì. Quindi eseguire il processo. Per perfezionare e convalidare ulteriormente la mappa RELION-3, avviare Scipion 3 e creare un nuovo progetto.Nel pannello dei protocolli di sinistra, seleziona il menu a discesa Importazioni e fai clic su Importa particelle. Modificare l'importazione dei parametri da a RELION-3 e il file star a postprocess.star. Quindi specificare i parametri di acquisizione come dimostrato in precedenza e fare clic su Esegui.Quindi, fai clic sul menu a discesa delle importazioni e seleziona i volumi di importazione. Sotto l'importazione da, dare il percorso alla mappa RELION-3, modificare la frequenza di campionamento delle dimensioni dei pixel a 1,045 angstrom per pixel ed eseguire. Per eseguire un allineamento globale, selezionare il menu a discesa Perfeziona dal pannello protocolli e fare clic su xmipp3-highres.Immettere le particelle e i volumi importati dai passaggi precedenti rispettivamente come immagini a grandezza naturale e volumi iniziali e impostare il gruppo di simmetria su icosaedrico. Quindi, nella scheda di allineamento dell'immagine sotto assegnazione angolare, scegli globale, imposta la risoluzione massima di destinazione su tre angstrom ed esegui il lavoro. Per eseguire un allineamento locale, selezionare xmipp3-highres global, passare da continua esecuzione precedente a sì e selezionare il processo precedente.Quindi, nella scheda di assegnazione angolare, modificare l'allineamento dell'immagine in locale e impostare la risoluzione massima di destinazione su angstrom 2.1. Al termine, nella finestra dei risultati di xmipp3-highres, fare clic sui grafici di risoluzione dello schermo per vedere come è cambiato l'FSC dopo il perfezionamento e fare clic sull'istogramma del grafico con modifiche angolari per vedere se le assegnazioni dell'angolo di Eulero sono cambiate. Ispezionare il volume in UCSF Chimera.Ingrandisci e cerca le funzionalità ad alta risoluzione. Le micrografie con buona vestibilità CTF e basso astigmatismo sono state selezionate per un'ulteriore elaborazione, mentre quelle con alto astigmatismo e forfait sono state scartate. Sono state selezionate medie di classe 2D contenenti classi ben definite e quelle con bassa risoluzione, rumore e particelle parziali sono state respinte.Le regioni della mappa di microscopia crioelettronica dotate di coordinate atomiche di un virus adeno-associato sono mostrate qui. Densità EM ben definite consentono di montare catene laterali di singoli amminoacidi, molecole d'acqua e ioni di magnesio. Le curve FSC calcolate utilizzando CryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion indicano una risoluzione crescente in tutto il flusso di lavoro, stime di risoluzione in quattro diverse sezioni attraverso le strutture e istogrammi di risoluzione dimostrano il miglioramento incrementale della risoluzione locale tra le mappe in tutto il flusso di lavoro.La combinazione degli algoritmi di elaborazione crio-EM di CryoSPARC, RELION-3, Scipion e Phoenix ha portato a un aumento della risoluzione delle strutture virali adeno-associate da 2,9 a 2,3 angstrom attraverso la pipeline di elaborazione. È importante ricordare che i parametri specificati in ogni passaggio sono dipendenti dal campione e dal microscopio. Inoltre, la capacità di raggiungere un'alta risoluzione dipende in gran parte dalla qualità del campione e dei dati grezzi.In questo video, presentiamo il robusto flusso di lavoro SP per l'elaborazione dei dati crio-EM su varie piattaforme software. Utilizzando questo approccio, è possibile implementare algoritmi per più programmi per perfezionare e convalidare le strutture criologiche. Questo flusso di lavoro può essere applicato ai calcoli di struttura di un'ampia varietà di assiemi macromolecolari.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Analisi di particelle singole ad alta risoluzione da immagini elettroniche a cryo-microscopia usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Ricerca

Biochimica

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Crio-EM e analisi a singola particella con Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Congelamento manuale blot-and-plunge di campioni biologici per microscopia elettronica criogenica a particella singola

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Griglie per dirigere il posizionamento delle cellule all'interno dei flussi di lavoro della tomografia crioelettronica a cellule intere

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Raccolta dati Cryo-EM a singola particella con inclinazione dello stadio utilizzando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...