Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Scipion3 설치에 도움을 주신 Carlos Oscar Shorzano와 Kilian Schnelle과 Arne Moeller에게 서로 다른 처리 플랫폼 간의 데이터 전송에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구의 일부는 NIH 보조금 U24GM129547에 의해 지원되었으며 OHSU의 PNCC에서 수행되었으며 생물 및 환경 연구 사무소가 후원하는 DOE 과학 사용자 시설 사무소 인 EMSL (grid.436923.9)을 통해 액세스했습니다. 이 연구는 Rutgers University에서 Arek Kulczyk에 대한 창업 보조금으로 지원되었습니다.

1. 새로운 cryoSPARC v3 프로젝트 만들기 및 데이터 가져오기
참고 : 데이터는 포틀랜드의 오레곤 보건 과학 대학 (OHSU)에서 팔콘 3 직접 전자 검출기가 장착 된 300kV Titan Krios 전자 현미경을 사용하여 획득되었습니다. 이미지는 129개의 프레임에 걸쳐 28.38 e-/Å2의 총 투여량과 -0.5 μm 내지 -2.5 μm의 디포커스 범위, EPU를 사용하여 1.045 Å의 픽셀 크기로 카운?...

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	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

이 기사에서는 고해상도 3D 재구성을 달성하기 위해 다양한 소프트웨어 플랫폼에서 cryo-EM 데이터 처리를 위한 강력한 SPA 워크플로우를 제시합니다(그림 1). 이 워크플로우는 다양한 생물학적 거대분자에 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 단계는 무비 전처리, 입자 채집 및 분류, 구조 미세화를 위한 여러 방법(표 1) 및 검증을 포함하여 <strong class=...

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) 및 single-particle analysis (SPA)는 수화 상태에서 다양한 생체 분자 어셈블리의 구조 결정을 가능하게하여 원자 세부 사항에서 이러한 거대 분자의 역할을 조명하는 데 도움이됩니다. 현미경 광학, 컴퓨터 하드웨어 및 이미지 처리 소프트웨어의 개선으로 2 Å1,2,3 이상의 해상도에서 생체 분자의 구조를 결정할 수있었습니다. 2020년에 2,300개 이상의 cryo-EM 구조물이 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 기탁되었으며, 이는 20144년의 192개 구조물과 비교하여, cryo-EM이 많은 구조 생물학자들이 선택하는 방법이 되었음을 나타냅니다. 여기서는 고해상도 구조 결정을 위해 세 가지 SPA 프로그램을 결합하는 워크플로에 대해 설명합니다(그림 1).
SPA의 목표는 현미경 검출기로 기록된 시끄러운 2D 이미지에서 대상 시편의 3D 볼륨을 재구성하는 것입니다. 탐지기는 동일한 시야각의 개별 프레임을 가진 동영상으로 이미지를 수집합니다. 샘플을 보존하기 위해, 프레임은 낮은 전자 선량으로 수집되고, 따라서 불량한 신호 대 잡음비(SNR)를 갖는다. 추가적으로, 전자 노출은 유리화된 cryo-EM 격자 내의 움직임을 유도할 수 있고, 이로 인해 이미지 블러링이 발생할 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해 프레임은 빔 유도 모션을 보정하도록 정렬되고 평균화되어 SNR이 증가한 현미경 사진을 생성합니다. 이 현미경은 현미경에 의해 부과 된 초점 저하 및 수차의 효과를 설명하기 위해 대비 전달 함수 (CTF) 추정을 거칩니다. CTF 보정 현미경 사진에서 개별 입자를 선택, 추출 및 유리체 얼음에서 시편에 채택 된 다양한 방향을 나타내는 2D 클래스 평균으로 분류됩니다. 결과적인 균질 입자 세트는 거친 모델 또는 모델을 생성하기 위해 ab initio 3D 재구성을 위한 입력으로 사용되며, 이 패턴은 하나 이상의 고해상도 구조를 생성하기 위해 반복적으로 정제됩니다. 재구성 후, cryo-EM 맵의 품질과 해상도를 더욱 향상시키기 위해 구조 개선이 수행됩니다. 마지막으로, 원자 모델이 맵에서 직접 파생되거나 맵에 다른 곳에서 얻은 원자 좌표가 장착되어 있습니다.
Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 등을 포함하여 위에서 설명한 작업을 수행하기 위해 다양한 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. 이러한 프로그램은 유사한 처리 단계를 따르지만 입자를 선택하고, 초기 모델을 생성하고, 재구성을 구체화하는 등 다양한 알고리즘을 사용합니다. 또한 이러한 프로그램은 작동하기 위해 다양한 수준의 사용자 지식과 개입이 필요하며, 일부는 새로운 사용자에게 장애물 역할을 할 수있는 매개 변수의 미세 조정에 달려 있습니다. 이러한 불일치로 인해 플랫폼 전반에 걸쳐 품질과 해상도가 일관되지 않은 맵이 생기는 경우가 많으며14, 많은 연구자가 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 개선하고 검증해야 합니다. 이 기사에서는 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3을 사용하여 유전자 치료에 널리 사용되는 벡터 인 AAV의 고해상도 3D 재구성을 얻습니다15. 앞서 언급 한 소프트웨어 패키지는 학술 사용자에게 무료입니다. cryoSPARC v3 및 Scipion 3에는 라이선스가 필요합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

계측 및 이미지 처리 소프트웨어의 최근 발전으로 인해 단일 입자 냉동 전자 현미경 (cryo-EM)은 구조 생물 학자들이 다양한 거대 분자의 고해상도 구조를 결정하는 데 선호되는 방법이되었습니다. 이미지 처리 및 구조 계산을 위해 신규 및 전문 사용자가 여러 소프트웨어 제품군을 사용할 수 있으며, 이는 동일한 기본 워크플로우를 간소화합니다: 현미경 검출기로 획득한 동영상은 빔 유도 동작 및 콘트라스트 전달 기능(CTF) 추정을 위해 보정을 거칩니다. 다음으로, 반복적인 2D 및 3D 분류를 위해 평균화된 무비 프레임에서 파티클 이미지를 선택하고 추출한 다음, 3D 재구성, 구체화 및 검증이 이어집니다. 다양한 소프트웨어 패키지가 서로 다른 알고리즘을 사용하고 작동하려면 다양한 수준의 전문 지식이 필요하기 때문에 생성되는 3D 맵은 종종 품질과 해상도가 다릅니다. 따라서 사용자는 최적의 결과를 위해 다양한 프로그램간에 정기적으로 데이터를 전송합니다. 이 백서에서는 사용자가 널리 사용되는 소프트웨어 패키지인 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3에서 워크플로를 탐색하여 아데노 관련 바이러스(AAV)의 거의 원자 분해능 구조를 얻을 수 있는 가이드를 제공합니다. 먼저 cryoSPARC v3를 사용하여 이미지 처리 파이프라인을 자세히 설명하는데, 효율적인 알고리즘과 사용하기 쉬운 GUI를 통해 사용자가 3D 맵에 빠르게 도착할 수 있기 때문입니다. 다음 단계에서는 PyEM 및 사내 스크립트를 사용하여 cryoSPARC v3에서 얻은 최고 품질의 3D 재구성에서 RELION-3 및 Scipion 3으로 입자 좌표를 변환 및 전송하고 3D 맵을 다시 계산합니다. 마지막으로, RELION-3 및 Scipion 3의 알고리즘을 통합하여 결과 구조를 더욱 구체화하고 검증하기 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 이 기사에서는 세 가지 처리 플랫폼을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위해 다양한 데이터 세트에 적용 할 수있는 강력하고 강력한 단일 워크 플로우를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

우리는 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3의 세 가지 처리 플랫폼을 사용하여 고해상도 구조를 얻기 위해 포괄적 인 SPA 파이프 라인을 제시했습니다. 그림 1과 그림 4는 일반적인 처리 워크플로를 요약하고 표 1에서는 구체화 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 AAV의 2.3 Å 구조를 개선하는 동안 사용되어 Nyquist 해상도에 근접했습니다.<...

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사는 원자 분해능에 가까운 거대 분자의 구조화 된 결정을위한 방법입니다. 이미지 처리 및 구조 계산에 여러 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있지만 3D 맵의 결과는 계산 중에 적용되는 알고리즘의 차이로 인해 품질과 해상도가 달라지는 경우가 많습니다. 따라서, 상이한 프로그램들의 조합을 사용하는 것은 종종 최적의 결과를 달성하는 데 유익하다.이 프로토콜은 사용자가 CryoSPARC, RELION 및 Scipion의 세 가지 cryo-EM 처리 플랫폼에서 워크플로를 탐색하도록 안내합니다. 우리는이 파이프 라인을 사용하여 유전자 치료에 널리 사용되는 벡터 인 아데노 관련 바이러스의 고해상도 구조를 얻는 방법을 시연 할 것입니다. 웹 브라우저에서 CryoSPARC v3을 열고 프로젝트의 작업 영역을 만든 후 새 작업 영역으로 이동하여 오른쪽 패널에서 작업 작성기를 엽니다.동영상 가져 오기를 클릭하고 동영상 경로를 제공하고 참조 파일 경로를 얻으십시오. 그런 다음 획득 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 대기열을 클릭하고 작업 영역과 작업 공간을 실행할 차선을 선택하고 생성을 클릭하십시오.패치 동작 수정 및 가져오기 동영상 작업 카드를 엽니다. 그런 다음 imported_movies 출력을 새 작업의 동영상 자리 표시자로 드래그하고 작업을 대기열에 넣습니다. 콘트라스트 전달 기능 또는 CTF 추정을 수행하려면 패치 CTF 추정을 엽니다.생성된 현미경 사진을 입력하고 작업을 큐에 넣습니다. 평균 및 CTF 보정된 현미경 사진을 검사하고 추가 처리를 위한 하위 집합을 선택하려면 큐레이트 노출을 열고 이전 단계에서 얻은 노출을 입력하고 작업을 큐에 넣습니다. 작업이 대기 모드로 전환되면 작업 카드의 대화식 탭을 클릭합니다.파라미터 임계값을 조정하고 추가 처리를 위해 개별 현미경 사진을 수락하거나 거부합니다. 현재 데이터를 처리하는 동안 난시의 상한치를 400 옹스트롬으로 설정하고, CTF 적합 분해능을 다섯 옹스트롬으로, 상대 얼음 두께를 두 개로 설정하십시오. 그런 다음 완료를 클릭하여 다운스트림 처리를위한 현미경 사진을 선택하십시오.수동 기반 선택의 경우 수동 선택기를 엽니다. 허용된 노출을 입력하고 작업을 큐에 넣습니다. 그런 다음 대화 형 탭을 클릭하고 상자 크기를 300 픽셀로 설정 한 다음 여러 현미경 사진에서 수백 개의 입자를 클릭하여 겹치는 입자를 피하십시오.선택이 끝나면 추출 입자 선택 완료를 클릭하십시오. 다음으로, 자동화된 입자 채취를 위한 템플릿을 생성하려면 2D 분류를 클릭하고 생성된 파티클 픽을 입력합니다. 그런 다음 2D 클래스 수를 10으로 변경하고 작업을 큐에 넣습니다.그런 다음 선택 2D 클래스를 열고 이전 단계에서 얻은 파티클 및 클래스 평균을 입력합니다. 그런 다음 대화 형 탭을 클릭하고 신호 대 잡음비가 좋은 대표적인 2D 클래스를 선택하고 완료를 클릭하십시오. 템플릿 기반 파티클 피킹의 경우 템플릿 선택기를 열고 선택한 2D 클래스 및 현미경 사진을 입력합니다.그런 다음 입자 직경을 220 옹스트롬으로 설정하고 작업을 대기열에 넣습니다. 마지막으로, 현미경 사진에서 추출을 열고 입자 선택을 검사하여 얻은 현미경 사진 및 입자를 입력하십시오. 그런 다음 추출된 상자 크기를 300픽셀로 설정하고 작업을 큐에 넣습니다.2D 분류의 경우 2D 분류를 클릭하고 추출된 입자를 입력합니다. 그런 다음 2D 클래스 수를 50으로 설정하고 작업을 큐에 넣습니다. 그런 다음 선택 2D 클래스를 열고 얻은 파티클과 클래스 평균을 입력하십시오.대화식 탭을 클릭합니다. 해상도와 클래스의 입자 수에 따라 2D 클래스를 선택하고 완료를 클릭하십시오. 초기 3D 볼륨을 생성하려면 ab-initio 재구성을 열고 최종 2D 분류에서 파티클을 입력합니다.그런 다음 대칭을 icosahedral로 조정하고 작업을 대기열에 넣습니다. 다음으로, 균질 정제를 열고, 이전 단계로부터의 부피와 최종 2D 분류로부터의 입자를 입력한다. 그런 다음 대칭을 변경하고 작업을 큐에 넣습니다.작업이 완료되면 푸리에 쉘 상관 관계 또는 FSC 곡선을 검사하고 볼륨을 다운로드하여 UCSF 키메라에서 검사합니다. CryoSPARC v3에서 최종 2D 분류에서 선택한 2D 클래스 작업의 작업 카드를 엽니다. 그런 다음 세부 정보 탭에서 내보내기 작업을 클릭하십시오.PyEM을 사용하여 particles_exported를 변환하십시오. cs 파일을 표시된 명령을 실행하여 별표 형식으로 지정합니다. 입자 추출을 클릭 한 후 I / O 탭에서 CTF 보정 된 현미경 사진 및 좌표를 입력하십시오.그런 다음 추출 탭을 클릭하고 입자 상자 크기를 300 픽셀로 변경하고 작업을 실행하십시오. 3D 구체화를 위해 CryoSPARC v3에서 생성된 맵을 RELION-3의 초기 모델로 사용합니다. 가져오기 방법을 선택하고 I/O 탭에서 표시된 매개 변수를 설정합니다.그런 다음 다른 탭에서 CryoSPARC v3 맵을 입력 파일로 선택하고 노드 유형을 3D 참조로 변경하고 작업을 실행합니다. 그런 다음 3D 자동 구체화를 선택하고 I/O 탭에서 입력 이미지를 파티클로 설정합니다. 마지막 선택 작업의 별 파일CryoSPARC v3 재구성을 참조 맵으로 사용하고 참조 탭을 클릭하고 초기 저역 통과 필터를 50 옹스트롬으로 변경하고 대칭을 icosahedral으로 변경하십시오. 그런 다음 최적화 탭에서 마스크 직경을 280 옹스트롬으로 변경하고 작업을 실행하십시오. 사후 처리를 위해 사후 처리를 클릭하십시오.그리고 I/O 탭에서 생성된 절반 맵과 마스크를 입력하고 보정된 픽셀 크기를 1.045 옹스트롬으로 설정합니다. 그런 다음 선명하게 탭에서 B 계수를 자동으로 추정하려면 yes를 입력하십시오. 자동 B 피팅의 최저 해상도의 경우 10을 입력합니다.그리고 자신의 B 팩터를 사용하려면 no를 입력하십시오. 마지막으로 필터 탭에서 FSC 가중치 건너뛰기를 no로 설정하고 작업을 실행합니다. 연마 훈련을 위해서는 베이지안 연마를 엽니 다.I/O 탭에 모션 보정된 현미경 사진, 파티클 및 포스트프로세스를 입력합니다. 이전에 얻은 별 파일. 학습 탭을 클릭하고 테스트를 위한 푸리에 픽셀의 일부인 예(yes)로 최적의 매개 변수를 설정하고, 이 많은 파티클을 5, 000으로 사용합니다.그런 다음 작업을 실행합니다. 교육 작업이 완료되면 베이지안 연마를 클릭하십시오. 그런 다음 학습 탭에서 학습 최적 매개 변수를 no로 설정합니다.폴란드어 탭을 선택하고 최적화된 매개변수 파일에서 opt_params_all_groups의 경로를 지정합니다. 이전 단계의 txt 파일을 클릭하고 실행을 클릭하십시오. 더 높은 차수 수차를 추정하려면 CTF 구체화를 엽니다.파티클 아래의 I/O 탭에서 최근에 정제된 3D 작업에서 연마된 파티클이 포함된 스타 파일의 경로를 선택합니다. 그런 다음 사후 처리 STAR 파일에서 최신 후처리 작업의 출력 경로를 설정합니다. 그런 다음 적합 탭을 선택하고 추정 이방성 배율을 no로 설정합니다.CTF 매개변수 피팅을 no로 수행합니다. 빔틸트를 예로 추정합니다. 또한 trefoil을 yes로 추정하십시오.그리고 네 번째 순서 수차를 예로 추정하십시오. 그런 다음 작업을 실행합니다. RELION-3 맵을 더욱 구체화하고 검증하려면 Scipion 3을 시작하고 새 프로젝트를 만듭니다.왼쪽 프로토콜 패널에서 가져오기 드롭다운을 선택하고 가져오기 파티클을 클릭합니다. 매개 변수 가져오기를 RELION-3으로 변경하고 별 파일을 postprocess.star로 변경합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 획득 매개 변수를 지정하고 실행을 클릭합니다.그런 다음 가져 오기 드롭 다운을 클릭하고 가져 오기 볼륨을 선택하십시오. 가져오기에서 RELION-3 맵에 대한 경로를 지정하고 픽셀 크기 샘플링 속도를 픽셀당 1.045 옹스트롬으로 변경하고 실행합니다. 전역 정렬을 수행하려면 프로토콜 패널에서 세분화 드롭다운 메뉴를 선택하고 xmipp3-highres를 클릭합니다.이전 단계에서 가져온 파티클과 볼륨을 각각 전체 크기 이미지와 초기 볼륨으로 입력하고 대칭 그룹을 icosahedral으로 설정합니다. 그런 다음 각도 할당 아래의 이미지 정렬 탭에서 전역을 선택하고 최대 대상 해상도를 세 개의 옹스트롬으로 설정하고 작업을 실행합니다. 로컬 정렬을 수행하려면 xmipp3-highres 전역을 선택하고 이전 실행에서 계속을 예로 변경하고 이전 작업을 선택합니다.그런 다음 각도 할당 탭에서 이미지 정렬을 로컬로 변경하고 최대 대상 해상도를 2.1 옹스트롬으로 설정합니다. 완료 후 xmipp3 고해상도 결과 창에서 디스플레이 해상도 플롯을 클릭하여 구체화 후 FSC가 어떻게 변경되었는지 확인하고 각도가 변경된 플롯 히스토그램을 클릭하여 오일러 각도 할당이 변경되었는지 확인합니다. UCSF 키메라의 볼륨을 검사합니다.확대하여 고해상도 기능을 찾습니다. 좋은 CTF 적합성과 낮은 난시를 가진 현미경 사진은 추가 처리를 위해 선택되었으며, 난시와 몰수가 높은 현미경 사진은 폐기되었습니다. 잘 정의된 클래스를 포함하는 2D 클래스 평균이 선택되었고, 분해능, 잡음 및 부분 파티클이 낮은 클래스가 있는 클래스가 거부되었습니다.아데노-관련 바이러스의 원자 좌표가 장착된 냉동 전자 현미경 지도의 영역이 여기에 도시되어 있다. 잘 정의 된 EM 밀도는 개별 아미노산, 물 분자 및 마그네슘 이온의 측쇄를 피팅 할 수 있습니다. CryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion을 사용하여 계산된 FSC 곡선은 워크플로우 전반에서 해상도가 증가함을 나타내며, 구조 및 해상도 히스토그램을 통해 네 개의 서로 다른 슬라이스에서의 해상도 추정치는 워크플로우 전체에서 맵 간의 로컬 해상도가 점진적으로 향상되었음을 보여줍니다.CryoSPARC, RELION-3, Scipion 및 Phoenix의 cryo-EM 처리 알고리즘을 결합하면 처리 파이프 라인에서 아데노 관련 바이러스 구조의 해상도가 2.9에서 2.3 옹스트롬으로 증가했습니다. 각 단계에 지정된 매개 변수는 샘플 및 현미경에 따라 다르다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 고해상도에 도달하는 능력은 샘플 및 원시 데이터의 품질에 따라 크게 달라집니다.이 비디오에서는 다양한 소프트웨어 플랫폼에서 cryo-EM 데이터를 처리하기 위한 강력한 SP 워크플로우를 제시합니다. 이 방법을 사용하면 여러 프로그램에 대한 알고리즘을 구현하여 냉동 구조를 개선하고 검증 할 수 있습니다. 이 워크플로우는 다양한 거대분자 어셈블리의 구조 계산에 적용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

연구

생화학

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

시간 해결 된 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 빠른 그리드 준비

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

초저온 전자 현미경 구조 결정을 위한 DNA 복구 인자와 복합체화된 뉴클레오솜 코어 입자의 준비

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...