Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Vi takker Carlos Oscar Sorzano for hjelp med Scipion3-installasjonen og Kilian Schnelle og Arne Moeller for hjelp med dataoverføring mellom ulike prosessplattformer. En del av denne forskningen ble støttet av NIH grant U24GM129547 og utført ved PNCC ved OHSU og åpnet gjennom EMSL (grid.436923.9), et DOE Office of Science User Facility sponset av Office of Biological and Environmental Research. Denne studien ble støttet av et oppstartsstipend fra Rutgers University til Arek Kulczyk.

1. Opprette et nytt kryoSPARC v3-prosjekt og importere data
MERK: Data ble anskaffet ved Oregon Health and Science University (OHSU) i Portland ved hjelp av et 300 kV Titan Krios elektronmikroskop utstyrt med en Falcon 3 direkte elektrondetektor. Bilder ble samlet inn i tellemodus med en total dose på 28,38 e−/Å2 brøkdelet over 129 bilder, og et defokusområde fra -0,5 μm til -2,5 μm, med en pikselstørrelse på 1,045 Å ved hjelp av EPU. Prøven av ...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

I denne artikkelen presenterer vi en robust SPA-arbeidsflyt for kryo-EM-databehandling på tvers av ulike programvareplattformer for å oppnå høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner (figur 1). Denne arbeidsflyten gjelder for en rekke biologiske makromolekyler. De påfølgende trinnene i protokollen er beskrevet i figur 4, inkludert forhåndsbehandling av filmer, partikkelplukking og klassifisering, og flere metoder for strukturforbedringer (tabell </strong...

Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) og enkeltpartikkelanalyse (SPA) muliggjør strukturbestemmelse av et bredt utvalg av biomolekylære forsamlinger i deres hydrerte tilstand, og bidrar til å belyse rollene til disse makromolekylene i atomdetaljer. Forbedringer i mikroskopoptikk, maskinvare og bildebehandlingsprogramvare har gjort det mulig å bestemme strukturer av biomolekyler ved oppløsning som strekker seg utover 2 Å1,2,3. Mer enn 2300 kryo-EM-strukturer ble deponert i Protein Data Bank (PDB) i 2020, sammenlignet med 192 strukturer i 20144, noe som indikerer at kryo-EM har blitt den valgte metoden for mange strukturelle biologer. Her beskriver vi en arbeidsflyt som kombinerer tre forskjellige SPA-programmer for høyoppløselig strukturbestemmelse (figur 1).
Målet med SPA er å rekonstruere 3D-volumer av en målprøve fra støyende 2D-bilder tatt opp av en mikroskopdetektor. Detektorer samler bilder som filmer med individuelle rammer av samme synsfelt. For å bevare prøven samles rammer med en lav elektrondose og har dermed et dårlig signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg kan elektroneksponering indusere bevegelse i de vitrifiserte kryo-EM-rutenettene, noe som resulterer i uskarphet i bildet. For å løse disse problemene er rammene justert for å korrigere for stråleindusert bevegelse og i gjennomsnitt for å gi en mikrograf med økt SNR. Disse mikrografene gjennomgår deretter CTF-estimering (Contrast Transfer Function) for å redegjøre for effekten av defokus og avvik pålagt av mikroskopet. Fra CTF-korrigerte mikrografer velges, ekstraheres og sorteres individuelle partikler i 2D-klassegjennomsnitt som representerer forskjellige orienteringer vedtatt av prøven i glassaktig is. Det resulterende homogene settet av partikler brukes som inngang for ab initio 3D-rekonstruksjon for å generere en grov modell eller modeller, som deretter er iterativt raffinert for å produsere en eller flere høyoppløselige strukturer. Etter rekonstruksjon utføres strukturelle raffinementer for å forbedre kvaliteten og oppløsningen til cryo-EM-kartet ytterligere. Til slutt er enten en atommodell direkte avledet fra kartet, eller kartet er utstyrt med atomkoordinater oppnådd andre steder.
Ulike programvarepakker er tilgjengelige for å utføre oppgavene som er beskrevet ovenfor, inkludert Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 og andre. Mens disse programmene følger lignende behandlingstrinn, bruker de forskjellige algoritmer, for eksempel for å plukke partikler, generere innledende modeller og finjustere rekonstruksjoner. I tillegg krever disse programmene et varierende nivå av brukerkunnskap og intervensjon for å fungere, da noen er avhengige av finjustering av parametere som kan fungere som et hinder for nye brukere. Disse avvikene resulterer ofte i kart med inkonsekvent kvalitet og oppløsning på tvers av plattformer14, noe som får mange forskere til å bruke flere programvarepakker for å avgrense og validere resultater. I denne artikkelen fremhever vi bruken av kryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for å oppnå en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon av AAV, en mye brukt vektor for genterapi15. De nevnte programvarepakkene er gratis for akademiske brukere; cryoSPARC v3 og Scipion 3 krever lisenser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Nylige fremskritt innen både instrumenterings- og bildebehandlingsprogramvare har gjort enpartikkel cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) til den foretrukne metoden for strukturbiologer for å bestemme høyoppløselige strukturer av et bredt utvalg av makromolekyler. Flere programvarepakker er tilgjengelige for nye og ekspertbrukere for bildebehandling og strukturberegning, noe som effektiviserer den samme grunnleggende arbeidsflyten: filmer anskaffet av mikroskopdetektorene gjennomgår korreksjon for stråleindusert bevegelses- og kontrastoverføringsfunksjon (CTF) estimering. Deretter velges og trekkes partikkelbilder ut fra gjennomsnittlige filmrammer for iterativ 2D- og 3D-klassifisering, etterfulgt av 3D-rekonstruksjon, presisering og validering. Fordi ulike programvarepakker bruker forskjellige algoritmer og krever forskjellige kompetansenivåer for å fungere, varierer 3D-kartene de genererer ofte i kvalitet og oppløsning. Dermed overfører brukere regelmessig data mellom en rekke programmer for optimale resultater. Dette dokumentet inneholder en veiledning for brukere om å navigere i en arbeidsflyt på tvers av de populære programvarepakkene: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for å få en nesten atomisk oppløsningsstruktur for det adeno-tilknyttede viruset (AAV). Vi detaljerer først en bildebehandlingspipeline med cryoSPARC v3, da dens effektive algoritmer og brukervennlige GUI lar brukerne raskt komme til et 3D-kart. I neste trinn bruker vi PyEM og interne skript for å konvertere og overføre partikkelkoordinater fra 3D-rekonstruksjon av beste kvalitet oppnådd i kryoSPARC v3 til RELION-3 og Scipion 3 og omberegne 3D-kart. Til slutt skisserer vi trinn for videre forbedring og validering av de resulterende strukturene ved å integrere algoritmer fra RELION-3 og Scipion 3. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du effektivt bruker tre behandlingsplattformer for å opprette en enkelt og robust arbeidsflyt som gjelder for en rekke datasett for høyoppløselig strukturbestemmelse.

Vi har presentert en omfattende SPA-rørledning for å oppnå en høyoppløselig struktur ved hjelp av tre forskjellige prosesseringsplattformer: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3. Figur 1 og figur 4 oppsummerer den generelle behandlingsarbeidsflyten, og tabell 1 beskriver presiseringsprotokoller. Disse protokollene ble brukt under forbedringer av en 2,3 Å-struktur av AAV, og oppnådde nær Nyquist-oppløsning.
Fil...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Denne artikkelen beskriver hvordan du effektivt bruker tre cryo-EM-prosesseringsplattformer, det vil si cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3, for å lage en enkelt og robust arbeidsflyt som gjelder for en rekke enkeltpartikkeldatasett for høyoppløselig strukturbestemmelse.

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Enpartikkel kryo-elektronmikroskopi er metoden for strukturerte bestemmelse av makromolekyler ved nær atomoppløsning. Flere programvarepakker er tilgjengelige for bildebehandling og strukturberegninger, men resultatet på 3D-kart varierer ofte i kvalitet og oppløsning på grunn av forskjellene i algoritmer som brukes under beregninger. Dermed er det ofte gunstig å bruke en kombinasjon av forskjellige programmer for å oppnå de optimale resultatene.Denne protokollen veileder brukere til å navigere i arbeidsflyten på tvers av tre forskjellige cryo-EM-behandlingsplattformer: CryoSPARC, RELION og Scipion. Vi vil demonstrere hvordan du bruker denne rørledningen for å oppnå en høyoppløselig struktur av det adeno-assosierte viruset som er en mye brukt vektor for genterapi. Etter å ha åpnet CryoSPARC v3 i en nettleser og opprettet arbeidsområdet for prosjektet, navigerer du til det nye arbeidsområdet og åpner jobbbyggeren på høyre panel.Klikk på importer filmer og gi filmene bane og få referansefilbane. Angi deretter anskaffelsesparameterne. Deretter klikker du på kø, velger et kjørefelt for å kjøre jobben og et arbeidsområde og klikker på opprett.Åpne korrigering av oppdateringsbevegelser og jobbkortet for importfilmer. Dra deretter imported_movies utdata til filmplassholderen i den nye jobben, og legg jobben i kø. Hvis du vil utføre funksjonen for kontrastoverføring eller CTF-estimering, åpner du CTF-estimering for oppdatering.Skriv inn de genererte mikrografene, og legg jobben i kø. Hvis du vil inspisere de gjennomsnittlige og CTF-korrigerte mikrografene og velge et delsett for videre behandling, åpner du kurater eksponeringer, legger inn eksponeringene fra forrige trinn og legger jobben i kø. Når jobben har gått inn i ventemodus, klikker du på den interaktive fanen på jobbkortet.Juster parameterterskler og godta eller avvis individuelle mikrografer for videre behandling. Under behandling av gjeldende data, sett den øvre terskelen for astigmatisme til 400 angstrom, CTF passer oppløsning til fem angstrom og relativ istykkelse til to. Klikk deretter på ferdig for å velge mikrografene for nedstrømsbehandling.Åpne den manuelle velgeren for manuell plukking. Skriv inn de godkjente eksponeringene, og legg jobben i kø. Klikk deretter på den interaktive fanen, sett boksstørrelsen til 300 piksler og klikk på noen hundre partikler over flere mikrografer, unngå overlappende partikler.Når du er ferdig med valget, klikker du på ferdig plukkekstraktpartikler. Deretter, for å generere maler for automatisert partikkelplukking, klikk på 2D-klassifisering og skriv inn de genererte partikkelvalgene. Deretter endrer du antall 2D-klasser til 10 og legger jobben i kø.Deretter åpner du utvalgte 2D-klasser og legger inn partiklene og klassegjennomsnittene som ble oppnådd i forrige trinn. Klikk deretter på den interaktive fanen, velg representative 2D-klasser med et godt signal-til-støy-forhold og klikk på ferdig. For malbasert partikkelplukking åpner du malvelgeren og legger inn de valgte 2D-klassene og mikrografene.Sett deretter partikkeldiameteren til 220 angstroms og legg jobben i kø. Til slutt åpner du ekstrakt fra mikrografer og legger inn mikrografer og partikler hentet fra inspeksjon av partikkelplukk. Sett deretter den utpakkede boksstørrelsen til 300 piksler og legg jobben i kø.For 2D-klassifisering, klikk på 2D-klassifisering og skriv inn de ekstraherte partiklene. Sett deretter antall 2D-klasser til 50 og legg jobben i kø. Deretter åpner du utvalgte 2D-klasser og legger inn de oppnådde partiklene og klassegjennomsnittene.Klikk på den interaktive fanen. Velg 2D-klasser basert på oppløsningen og antall partikler i klassen og klikk på ferdig. For å generere et innledende 3D-volum, åpne ab-initio rekonstruksjon og skriv inn partiklene fra den endelige 2D-klassifiseringen.Juster deretter symmetrien til icosahedral og legg jobben i kø. Deretter åpner du homogen raffinement, legger inn volumet fra forrige trinn og partikler fra den endelige 2D-klassifiseringen. Deretter endrer du symmetrien og legger jobben i kø.Når jobben er fullført, inspiserer du Fourier-skallkorrelasjonen eller FSC-kurven og laster ned volumet for å undersøke i UCSF Chimera. Åpne jobbkortet for den valgte 2D-klassejobben fra den endelige 2D-klassifiseringen i CryoSPARC v3. Klikk deretter på eksportjobb i detaljfanen.Bruk PyEM til å konvertere particles_exported. cs-fil til stjerneformat ved å utføre den angitte kommandoen. Etter å ha klikket på partikkelutvinning, i I / O-fanen, skriv inn CTF-korrigerte mikrografer og koordinater.Klikk deretter på ekstraktfanen, endre partikkelboksstørrelsen til 300 piksler og kjør jobben. For 3D-presisering, bruk kartet generert i CryoSPARC v3 som en innledende modell i RELION-3. Velg importmetoden, og angi de angitte parameterne i kategorien I/U .Deretter velger du CryoSPARC v3-kartet som inndatafil i kategorien Andre, endrer nodetype til 3D-referanse og kjører jobben. Deretter velger du 3D-funksjonen for automatisk finjustering, og i kategorien I/U angir du inndatabilder som partikler. stjernefilen fra den siste valgjobben.Bruk CryoSPARC v3-rekonstruksjonen som referansekart, klikk på referansefanen og endre det første lavpassfilteret til 50 angstrom og symmetri til icosahedral. Deretter endrer du maskediameteren til 280 angstrom på optimaliseringsfanen og kjører jobben. For etterbehandling, klikk på etterbehandling.Og i kategorien I/U legger du inn de opprettede halvkartene og masken og setter den kalibrerte pikselstørrelsen til 1,045 angstrom. Deretter skriver du inn ja for estimat B-faktor automatisk i kategorien Gjør skarpere. For laveste oppløsning for automatisk B-tilpasning, inngang 10.Og for bruk din egen B-faktor, inngangsnr. Til slutt, i filterfanen, setter du hopp over FSC-vekting til Nei og kjører jobben. For polering trening, åpne Bayesian polering.Og i kategorien I/U skriver du inn bevegelseskorrigerte mikrografer, partikler og PostProcess. stjernefilen som er hentet tidligere. Klikk på treningsfanen og sett tog optimale parametere til ja, brøkdel av Fourier piksler for testing til 0,5 og bruk så mange partikler til 5,000.Kjør deretter jobben. Når treningsjobben er ferdig, klikker du på Bayesiansk polering. Sett deretter tog optimale parametere til Nei i treningsfanen.Velg kategorien Polsk, og angi banen til opt_params_all_groups i optimalisert parameterfil. txt-filen fra forrige trinn og klikk på kjør. Hvis du vil beregne avvik i høyere rekkefølge, åpner du CTF-presisering.Og i kategorien I/U under partikler velger du banen til stjernefilen som inneholder polerte partikler fra den nylig raffinerte 3D-jobben. Deretter angir du banen til utdataene fra den siste etterbehandlingsjobben under STAR-filen etter prosessen. Deretter velger du tilpasningsfanen og setter anisotrop forstørrelse til Nei.Utfør CTF-parametertilpasning til nei. Beregn stråletilt til ja. Også estimere trefoil til ja.Og anslå fjerde ordens avvik til ja. Kjør deretter jobben. Hvis du vil finjustere og validere RELION-3-kartet ytterligere, starter du Scipion 3 og oppretter et nytt prosjekt.Velg rullegardinmenyen for import på venstre protokollpanel, og klikk på importpartikler. Endre parameterimporten fra til RELION-3 og stjernefilen til postprocess.star. Angi deretter anskaffelsesparameterne som vist tidligere, og klikk på utfør.Deretter klikker du på rullegardinmenyen import og velger importvolumer. Under import fra gir du banen til RELION-3-kartet, endrer samplingsfrekvensen for pikselstørrelse til 1,045 angstrom per piksel og utfører. Hvis du vil utføre en global justering, velger du rullegardinmenyen finjuster fra protokollpanelet og klikker på xmipp3-highres.Skriv inn de importerte partiklene og volumene fra de forrige trinnene som henholdsvis bilder i full størrelse og innledende volumer, og sett symmetrigruppen til icosahedral. Deretter velger du global på bildejusteringsfanen under vinkeltilordning, setter maksimal måloppløsning til tre angstrom og kjører jobben. Hvis du vil utføre en lokal justering, velger du xmipp3-highres global, endringen fortsetter fra forrige kjøring til ja og velger forrige jobb.Deretter endrer du bildejusteringen til lokal i kategorien vinkeltilordning og setter den maksimale måloppløsningen til 2,1 angstrom. Etter å ha fullført, i resultatvinduet xmipp3-highres, klikker du på skjermoppløsningsplott for å se hvordan FSC har endret seg etter raffinementet og klikk på plott histogram med vinkelendringer for å se om Euler-vinkeltilordningene har endret seg. Inspiser volumet i UCSF Chimera.Zoom inn og se etter funksjoner med høy oppløsning. Mikrografer med god CTF-passform og lav astigmatisme ble valgt ut til videre behandling, mens de med høy astigmatisme og tap ble forkastet. 2D-klassegjennomsnitt som inneholder veldefinerte klasser ble valgt, og de med lav oppløsning, støy og delvise partikler ble avvist.Regioner i kryo-elektronmikroskopikartet utstyrt med atomkoordinater av et adeno-assosiert virus er vist her. Veldefinerte EM-tettheter gir mulighet for montering av sidekjeder av individuelle aminosyrer, vannmolekyler og magnesiumioner. FSC-kurver beregnet ved hjelp av CryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion indikerer økende oppløsning på tvers av arbeidsflyten, oppløsningsestimater ved fire forskjellige stykker gjennom strukturene og oppløsnings histogrammer viser den trinnvise forbedringen i lokal oppløsning mellom kartene gjennom hele arbeidsflyten.Ved å kombinere kryo-EM-prosesseringsalgoritmer av CryoSPARC, RELION-3, Scipion og Phoenix resulterte det i en oppløsningsøkning av de adeno-tilknyttede virusstrukturene fra 2,9 til 2,3 angstrom over prosessrørledningen. Det er viktig å huske at parametrene som er angitt i hvert trinn, er prøve- og mikroskopavhengige. I tillegg avhenger muligheten til å nå høy oppløsning sterkt av kvaliteten på prøven og rådataene.I denne videoen presenterer vi den robuste SP-arbeidsflyten for behandling av cryo-EM-data på tvers av forskjellige programvareplattformer. Ved å bruke denne tilnærmingen kan man implementere algoritmer for flere programmer for å avgrense og validere kryostrukturer. Denne arbeidsflyten kan brukes til å strukturere beregninger av en rekke makromolekylære samlinger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell flekk-og-dypfrysing av biologiske prøver for kryogen elektronmikroskopi med én partikkel

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling av nukleosomkjernepartikler kompleksert med DNA-reparasjonsfaktorer for kryo-elektronmikroskopi strukturell bestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Kryo-EM-datainnsamling med enkeltpartikler med scenetilt ved bruk av Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...