Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Agradecemos a Carlos Oscar Sorzano pela ajuda na instalação do Scipion3 e kilian Schnelle e Arne Moeller por ajuda na transferência de dados entre diferentes plataformas de processamento. Parte desta pesquisa foi apoiada pela bolsa NIH U24GM129547 e realizada na PNCC da OHSU e acessada através da EMSL (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental. Este estudo foi apoiado por uma bolsa inicial da Universidade Rutgers para Arek Kulczyk.

1. Criação de um novo projeto crioSPARC v3 e importação de dados
NOTA: Os dados foram adquiridos na Oregon Health and Science University (OHSU) em Portland usando um microscópio eletrônico Titan Krios de 300 kV equipado com um detector de elétrons direto Falcon 3. As imagens foram coletadas em um modo de contagem com uma dose total de 28,38 e−/Å2 fracionados em 129 quadros, e uma faixa de desfocus de -0,5 μm a -2,5 μm, a um tamanho de pixel de 1...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

Neste artigo, apresentamos um fluxo de trabalho ROBUSTO spa para processamento de dados crio-EM em várias plataformas de software para alcançar reconstruções 3D de alta resolução (Figura 1). Este fluxo de trabalho é aplicável a uma grande variedade de macromoléculas biológicas. As etapas subsequentes do protocolo estão descritas na Figura 4, incluindo pré-processamento de filmes, coleta e classificação de partículas e múltiplos métodos para refi...

A microscopia crio-elétron (crio-EM) e a análise de partículas únicas (SPA) permitem a determinação da estrutura de uma grande variedade de conjuntos biomoleculares em seu estado hidratado, ajudando a iluminar os papéis dessas macromoléculas em detalhes atômicos. Melhorias na óptica de microscópio, hardware de computador e software de processamento de imagens tornaram possível determinar estruturas de biomoléculas em resolução que ultrapassassem 2 Å1,2,3. Mais de 2.300 estruturas crio-EM foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) em 2020, em comparação com 192 estruturas em 20144, indicando que o crio-EM tornou-se o método de escolha de muitos biólogos estruturais. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que combina três programas SPA diferentes para determinação da estrutura de alta resolução (Figura 1).
O objetivo da SPA é reconstruir volumes 3D de um espécime alvo a partir de imagens 2D ruidosas registradas por um detector de microscópio. Os detectores coletam imagens como filmes com quadros individuais do mesmo campo de visão. Para preservar a amostra, os quadros são coletados com uma dose eletrônica baixa e, portanto, têm uma má relação sinal-ruído (SNR). Além disso, a exposição a elétrons pode induzir o movimento dentro das grades crio-EM vitrificadas, resultando em desfoque de imagem. Para superar esses problemas, os quadros estão alinhados para corrigir o movimento induzido pelo feixe e médios para produzir um micrografo com um SNR aumentado. Esses micrografos passam então pela estimativa da Função de Transferência de Contraste (CTF) para explicar os efeitos do desfoco e das aberrações impostas pelo microscópio. A partir dos micrografos corrigidos pelo CTF, as partículas individuais são selecionadas, extraídas e classificadas em médias de classe 2D representando diferentes orientações adotadas pelo espécime em gelo vítreo. O conjunto homogêneo resultante de partículas é usado como entrada para a reconstrução 3D ab iniciado para gerar um modelo ou modelos grosseiros, que são então refinados iterativamente para produzir uma ou mais estruturas de alta resolução. Após a reconstrução, são realizados refinamentos estruturais para melhorar ainda mais a qualidade e a resolução do mapa crio-EM. Finalmente, ou um modelo atômico é diretamente derivado do mapa, ou o mapa é equipado com coordenadas atômicas obtidas em outros lugares.
Diferentes pacotes de software estão disponíveis para realizar as tarefas descritas acima, incluindo Appion5, cisTEM6, crioSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, entre outros. Embora esses programas sigam etapas semelhantes de processamento, eles empregam diferentes algoritmos, por exemplo, para colher partículas, gerar modelos iniciais e refinar reconstruções. Além disso, esses programas exigem um nível variado de conhecimento e intervenção do usuário para operar, pois alguns dependem do ajuste fino de parâmetros que podem atuar como um obstáculo para novos usuários. Essas discrepâncias geralmente resultam em mapas com qualidade e resolução inconsistentes em todas as plataformas14, levando muitos pesquisadores a usar vários pacotes de software para refinar e validar resultados. Neste artigo, destacamos o uso de crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma reconstrução 3D de alta resolução do AAV, um vetor amplamente utilizado para terapia genética15. Os pacotes de software acima mencionados são gratuitos para usuários acadêmicos; crioSPARC v3 e Scipion 3 exigem licenças.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Os recentes avanços no software de instrumentação e processamento de imagens tornaram a microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) o método preferido para biólogos estruturais determinarem estruturas de alta resolução de uma grande variedade de macromoléculas. Vários pacotes de software estão disponíveis para usuários novos e experientes para processamento de imagens e cálculo de estrutura, que simplificam o mesmo fluxo de trabalho básico: filmes adquiridos pelos detectores de microscópio passam por correção para estimativa da função de transferência de movimento e contraste (CTF) induzida pelo feixe. Em seguida, as imagens de partículas são selecionadas e extraídas de quadros de filme medianos para classificação iterativa 2D e 3D, seguidas de reconstrução 3D, refinamento e validação. Como vários pacotes de software empregam algoritmos diferentes e exigem diferentes níveis de experiência para operar, os mapas 3D que eles geram muitas vezes diferem em qualidade e resolução. Assim, os usuários transferem regularmente dados entre uma variedade de programas para obter resultados ideais. Este artigo fornece um guia para que os usuários naveguem em um fluxo de trabalho através dos pacotes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma estrutura de resolução quase atômica do vírus associado ao adeno (AAV). Primeiro detalhamos um pipeline de processamento de imagem com o crioSPARC v3, pois seus algoritmos eficientes e gui fácil de usar permitem que os usuários cheguem rapidamente a um mapa 3D. Na etapa seguinte, usamos pyem e scripts internos para converter e transferir coordenadas de partículas da melhor reconstrução 3D de qualidade obtida em crioSPARC v3 para RELION-3 e Scipion 3 e recalcular mapas 3D. Finalmente, delineamos etapas para maior refinamento e validação das estruturas resultantes, integrando algoritmos do RELION-3 e Scipion 3. Neste artigo, descrevemos como utilizar efetivamente três plataformas de processamento para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados para determinação de estrutura de alta resolução.

Apresentamos um pipeline SPA abrangente para obter uma estrutura de alta resolução usando três plataformas de processamento diferentes: crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. As figuras 1 e figura 4 resumem o fluxo de trabalho geral de processamento e a Tabela 1 detalha os protocolos de refinamento. Estes protocolos foram usados durante refinamentos de uma estrutura de 2,3 Å de AAV, alcançando perto da resolução nyquist.
<p class="jove_c...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Microscopia crio-elétron de partículas únicas é o método para determinações estruturadas de macromoléculas em resolução quase atômica. Vários pacotes de software estão disponíveis para processamento de imagens e cálculos de estrutura, mas o resultado em mapas 3D muitas vezes varia em qualidade e resolução devido às diferenças nos algoritmos aplicados durante os cálculos. Assim, usar uma combinação de diferentes programas é muitas vezes benéfico para alcançar os resultados ideais.Este protocolo orienta os usuários a navegar em três diferentes plataformas de processamento crio-EM:CryoSPARC, RELION e Scipion. Vamos demonstrar como usar este pipeline para obter uma estrutura de alta resolução do vírus associado ao adeno, que é um vetor amplamente utilizado para a terapia genética. Depois de abrir o CryoSPARC v3 em um navegador da Web e criar o espaço de trabalho para o projeto, navegue até o novo espaço de trabalho e abra o job builder no painel certo.Clique em importar filmes e forneça o caminho dos filmes e ganhe o caminho do arquivo de referência. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição. Em seguida, clique na fila, selecione uma faixa para executar o trabalho e um espaço de trabalho e clique em criar.Correção de movimento de patch aberto e o cartão de trabalho de filmes de importação. Em seguida, arraste a saída imported_movies para o espaço reservado para os filmes no novo trabalho e faça fila no trabalho. Para executar a função de transferência de contraste ou estimativa ctf, abra a estimativa ctf de patch.Insira os micrografos gerados e faça fila no trabalho. Para inspecionar os micrografos corrigidos por CTF e selecionar um subconjunto para posterior processamento, abra as exposições de cura, insira as exposições obtidas da etapa anterior e faça fila no trabalho. Após o trabalho entrar no modo de espera, clique na aba interativa no cartão de trabalho.Ajuste os limites dos parâmetros e aceite ou rejeite micrografos individuais para posterior processamento. Ao processar os dados atuais, defina o limiar superior do astigmatismo para 400 angstroms, ctf encaixar resolução para cinco angstroms e espessura relativa de gelo para dois. Em seguida, clique em feito para selecionar os micrografos para processamento a jusante.Para escolher manualmente, abra o catador manual. Insira as exposições aceitas e faça fila no trabalho. Em seguida, clique na guia interativa, defina o tamanho da caixa para 300 pixels e clique em algumas centenas de partículas em vários micrografos, evitando partículas sobrepostas.Uma vez terminado com a seleção, clique em fazer a colheita de partículas de extrato. Em seguida, para gerar modelos para a colheita automatizada de partículas, clique na classificação 2D e insira as picaretas de partículas geradas. Em seguida, mude o número de classes 2D para 10 e faça fila no trabalho.Em seguida, abra as classes 2D selecionadas e insira as partículas e as médias de classe obtidas na etapa anterior. Em seguida, clique na guia interativa, selecione classes 2D representativas com uma boa relação sinal-ruído e clique em feito. Para a coleta de partículas baseada em modelos, abra o catador de modelos e insira as classes e micrografias 2D selecionados.Em seguida, defina o diâmetro da partícula para 220 angstroms e faça fila no trabalho. Finalmente, extrato aberto de micrografos e insumo os micrografos e partículas obtidos a partir da inspeção de picaretas de partículas. Em seguida, defina o tamanho da caixa extraída para 300 pixels e faça fila no trabalho.Para classificação 2D, clique na classificação 2D e insira as partículas extraídas. Em seguida, defina o número de classes 2D para 50 e faça fila no trabalho. Em seguida, abra selecionar classes 2D e insira as partículas obtidas e as médias de classe.Clique na aba interativa. Escolha as classes 2D com base na resolução e no número de partículas da classe e clique em feito. Para gerar um volume 3D inicial, abra a reconstrução ab-initio e insira as partículas da classificação 2D final.Em seguida, ajuste a simetria para icosahedral e faça fila no trabalho. Em seguida, abra o refinamento homogêneo, insira o volume da etapa anterior e as partículas da classificação 2D final. Em seguida, mude a simetria e enfie a fila do trabalho.Quando o trabalho estiver concluído, inspecione a correlação da concha Fourier ou a curva FSC e baixe o volume para examinar na Quimera UCSF. No CryoSPARC v3, abra a carteira de trabalho da seletiva classe 2D da classificação final 2D. Em seguida, na guia detalhes, clique em trabalho de exportação.Usando PyEM, converta o particles_exported. cs arquivo para formato estrela executando o comando indicado. Depois de clicar na extração de partículas, na guia I/O, insira os micrografos e coordenadas corrigidos pelo CTF.Em seguida, clique na guia extrato, altere o tamanho da caixa de partículas para 300 pixels e execute o trabalho. Para refinamento 3D, use o mapa gerado no CryoSPARC v3 como modelo inicial em RELION-3. Selecione o método de importação e defina os parâmetros indicados na guia I/O.Em seguida, na guia outros, selecione o mapa CryoSPARC v3 como o arquivo de entrada, altere o tipo de nó para referência 3D e execute o trabalho. Em seguida, selecione o refino automático 3D e na guia I/O, defina imagens de entrada como as partículas. arquivo estrela do último trabalho de seleção.Use a reconstrução cryoSPARC v3 como mapa de referência, clique na guia de referência e altere o filtro inicial de baixo passe para 50 angstroms e simetria para icosaedral. Em seguida, na guia de otimização, altere o diâmetro da máscara para 280 angstroms e execute o trabalho. Para pós-processamento, clique no pós-processamento.E na guia I/O, insira os meios mapas e a máscara criados e defina o tamanho do pixel calibrado para 1.045 angstroms. Em seguida, na aba afiar, para estimar o fator B automaticamente, entrada sim. Para menor resolução para ajuste automático B, entrada 10.E para usar seu próprio fator B, entrada não. Finalmente, na guia do filtro, defina pular a ponderação do FSC para não e executar o trabalho. Para treinamento de polimento, polimento bayesiano aberto.E na guia I/O, insira os micrografos, partículas e PostProcess corrigidos por movimento. arquivo estrela obtido anteriormente. Clique na guia de treinamento e defina os parâmetros ideais do trem para sim, fração de pixels Fourier para testes para 0,5 e use tantas partículas para 5.000.Então corra o trabalho. Uma vez terminado o trabalho de treinamento, clique no polimento bayesiano. Em seguida, na guia de treinamento, defina os parâmetros ideais do trem para não.Selecione a guia polimento e em arquivo de parâmetro otimizado, especifique o caminho para o opt_params_all_groups. arquivo txt da etapa anterior e clique em executar. Para estimar aberrações de ordem mais alta, abra o refinamento ctf aberto.E na guia I/O sob partículas, selecione o caminho para o arquivo estelar contendo partículas polidas do recente trabalho 3D refinado. Em seguida, no arquivo STAR pós-processo, defina o caminho para a saída do trabalho pós-processamento mais recente. Em seguida, selecione a guia de ajuste e defina a ampliação anisotropica estimada para no.Realize o encaixe do parâmetro CTF para não. Estimativa de feixe para sim. Também estimar trefoil para sim.E estimar aberrações de quarta ordem para sim. Então corra o trabalho. Para refinar e validar ainda mais o mapa RELION-3, inicie o Scipion 3 e crie um novo projeto.No painel protocolos esquerdos, selecione a queda das importações e clique em partículas de importação. Altere a importação de parâmetros para RELION-3 e arquivo estrela para postprocess.star. Em seguida, especifique os parâmetros de aquisição como demonstrado anteriormente e clique em executar.Em seguida, clique no dropdown das importações e selecione volumes de importação. Sob importação, dê o caminho para o mapa RELION-3, altere a taxa de amostragem do tamanho do pixel para 1.045 angstroms por pixel e execute. Para realizar um alinhamento global, selecione o menu suspenso de refinar no painel protocolos e clique em xmipp3-highres.Insira as partículas e volumes importados das etapas anteriores como imagens em tamanho real e volumes iniciais, respectivamente, e defina o grupo de simetria para icosaedral. Em seguida, na guia de alinhamento de imagem sob atribuição angular, escolha global, defina a resolução de destino máxima para três angstroms e execute o trabalho. Para realizar um alinhamento local, selecione xmipp3-highres global, mude continue da corrida anterior para sim e selecione o trabalho anterior.Em seguida, na guia de atribuição angular, altere o alinhamento da imagem para local e defina a resolução máxima de destino para 2,1 angstroms. Após o término, na janela de resultados xmipp3-highres, clique em gráficos de resolução de exibição para ver como o FSC mudou após o refinamento e clique no histograma do plot com alterações angulares para ver se as atribuições de ângulo de Euler mudaram. Inspecione o volume na Quimera UCSF.Amplie e procure recursos de alta resolução. Micrografos com bom ajuste ctf e baixo astigmatismo foram selecionados para posterior processamento, enquanto aqueles com alta astigmatismo e desistência foram descartados. Foram selecionadas médias de classe 2D contendo classes bem definidas, e aquelas com baixa resolução, ruído e partículas parciais foram rejeitadas.Regiões do mapa de microscopia crio-elétron equipado com coordenadas atômicas de um vírus associado ao adeno são mostradas aqui. As densidades em bem definidas permitem a montagem de cadeias laterais de aminoácidos individuais, moléculas de água e íons de magnésio. As curvas FSC calculadas usando o CryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion indicam uma resolução crescente em todo o fluxo de trabalho, as estimativas de resolução em quatro fatias diferentes através das estruturas e histogramas de resolução demonstram a melhoria incremental na resolução local entre os mapas ao longo do fluxo de trabalho.A combinação de algoritmos de processamento crio-EM de CryoSPARC, RELION-3, Scipion e Phoenix resultou em um aumento de resolução das estruturas de vírus associadas ao adeno de 2,9 para 2,3 angstroms em todo o pipeline de processamento. É importante lembrar que os parâmetros especificados em cada etapa são amostrais e dependentes de microscópio. Além disso, a capacidade de alcançar alta resolução depende muito da qualidade da amostra e dos dados brutos.Neste vídeo, apresentamos o robusto fluxo de trabalho de SP para processamento de dados crio-EM em várias plataformas de software. Usando essa abordagem, pode-se implementar algoritmos para vários programas para refinar e validar estruturas criogenas. Este fluxo de trabalho pode ser aplicado aos cálculos estruturais de uma grande variedade de conjuntos macromoleculares.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Bioquímica

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparação rápida da grade para microscopia crio-elétron resolvida pelo tempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Crio-EM e Análise de Partículas Únicas com Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Congelamento manual de amostras biológicas para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...