Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Мы благодарим Карлоса Оскара Сорцано за помощь в установке Scipion3 и Килиана Шнелле и Арне Мёллера за помощь в передаче данных между различными платформами обработки. Часть этого исследования была поддержана грантом NIH U24GM129547 и выполнена в PNCC в OHSU и доступна через EMSL (grid.436923.9), Пользовательский объект Управления науки Министерства энергетики США, спонсируемый Управлением биологических и экологических исследований. Это исследование было поддержано грантом стартапа от Ратгерского университета Ареку Кульчику.

1. Создание нового проекта cryoSPARC v3 и импорт данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были получены в Орегонском университете здоровья и науки (OHSU) в Портленде с использованием электронного микроскопа Titan Krios 300 кВ, оснащенного прямым электронным детектором Falcon 3. Изображения собир...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

В этой статье мы представляем надежный рабочий процесс SPA для обработки крио-EM данных на различных программных платформах для достижения 3D-реконструкций с высоким разрешением (рисунок 1). Этот рабочий процесс применим к широкому спектру биологических макромолекул. Посл...

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и анализ одной частицы (SPA) позволяют определять структуру широкого спектра биомолекулярных сборок в их гидратированном состоянии, помогая осветить роль этих макромолекул в атомных деталях. Усовершенствования в оптике микроскопа, компьютерном оборудовании и программном обеспечении для обработки изображений позволили определить структуры биомолекул с разрешением, превышающим 2 Å1,2,3. Более 2 300 крио-ЭМ-структур были депонированы в Банке данных белка (PDB) в 2020 году по сравнению со 192 структурами в 20144 году, что указывает на то, что крио-ЭМ стал методом выбора для многих структурных биологов. Здесь мы описываем рабочий процесс, объединяющий три различные программы SPA для определения структуры с высоким разрешением (рисунок 1).
Целью SPA является реконструкция 3D-объемов целевого образца из шумных 2D-изображений, записанных детектором микроскопа. Детекторы собирают изображения в виде фильмов с отдельными кадрами одного поля зрения. Чтобы сохранить образец, кадры собираются с низкой дозой электронов и, таким образом, имеют плохое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, воздействие электронов может индуцировать движение внутри остеклованных крио-ЭМ-сеток, что приводит к размытию изображения. Чтобы преодолеть эти проблемы, кадры выравниваются для корректировки движения, вызванного лучом, и усредняются, чтобы получить микрофотографию с увеличенным SNR. Эти микроснимки затем проходят оценку функции переноса контраста (CTF) для учета эффектов расфокусировки и аберраций, наложенных микроскопом. Из микроснимков, скорректированных CTF, отдельные частицы отбираются, извлекаются и сортируются в средние значения 2D-класса, представляющие различные ориентации, принятые образцом в стекловидном льду. Результирующее однородное множество частиц используется в качестве входных данных для ab initio 3D-реконструкции для создания грубой модели или моделей, которые затем итеративно уточняются для получения одной или нескольких структур с высоким разрешением. После реконструкции выполняются структурные доработки для дальнейшего улучшения качества и разрешения крио-ЭМ карты. Наконец, либо атомная модель непосредственно выводится из карты, либо карта снабжена атомными координатами, полученными в другом месте.
Для выполнения описанных выше задач доступны различные пакеты программного обеспечения, включая Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 и другие. Хотя эти программы следуют аналогичным этапам обработки, они используют разные алгоритмы, например, для выбора частиц, создания начальных моделей и уточнения реконструкций. Кроме того, эти программы требуют различного уровня пользовательских знаний и вмешательства для работы, так как некоторые из них зависят от тонкой настройки параметров, которые могут выступать в качестве препятствия для новых пользователей. Эти расхождения часто приводят к картам с несогласованным качеством и разрешением на разных платформах14, что побуждает многих исследователей использовать несколько пакетов программного обеспечения для уточнения и проверки результатов. В этой статье мы освещаем использование cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения 3D-реконструкции AAV с высоким разрешением, широко используемого вектора для генной терапии15. Вышеупомянутые пакеты программного обеспечения бесплатны для академических пользователей; cryoSPARC v3 и Scipion 3 требуют лицензий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Последние достижения в области как приборов, так и программного обеспечения для обработки изображений сделали криоэлектронную микроскопию одной частицы (крио-ЭМ) предпочтительным методом для структурных биологов для определения структур высокого разрешения широкого спектра макромолекул. Для новых и опытных пользователей доступно несколько пакетов программного обеспечения для обработки изображений и расчета структуры, которые оптимизируют один и тот же базовый рабочий процесс: фильмы, полученные детекторами микроскопа, проходят коррекцию для оценки движения и контрастной функции передачи луча (CTF). Затем изображения частиц выбираются и извлекаются из усредненных кадров фильма для итеративной 2D- и 3D-классификации, за которой следует 3D-реконструкция, уточнение и проверка. Поскольку различные программные пакеты используют разные алгоритмы и требуют разного уровня знаний для работы, 3D-карты, которые они генерируют, часто различаются по качеству и разрешению. Таким образом, пользователи регулярно передают данные между различными программами для достижения оптимальных результатов. Этот документ содержит руководство для пользователей по навигации по рабочему процессу в популярных программных пакетах: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения структуры, близкой к атомному разрешению аденоассоциированного вируса (AAV). Сначала мы подробно описываем конвейер обработки изображений с помощью cryoSPARC v3, поскольку его эффективные алгоритмы и простой в использовании графический интерфейс позволяют пользователям быстро получить 3D-карту. На следующем этапе мы используем PyEM и собственные скрипты для преобразования и передачи координат частиц из 3D-реконструкции наилучшего качества, полученной в cryoSPARC v3, в RELION-3 и Scipion 3 и пересчитывают 3D-карты. Наконец, мы намечаем шаги для дальнейшего уточнения и валидации результирующих структур путем интеграции алгоритмов из RELION-3 и Scipion 3. В этой статье мы расскажем, как эффективно использовать три платформы обработки для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных для определения структуры с высоким разрешением.

Мы представили комплексный конвейер SPA для получения структуры высокого разрешения с использованием трех различных платформ обработки: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3. На рисунках 1 и 4 обобщен общий рабочий процесс обработки, а в таблице 1 подробно описаны ...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

В этой статье описывается, как эффективно использовать три платформы обработки крио-ЭМ, т.е. cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных с одной частицей для определения структуры с высоким разрешением.

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Одночастичная криоэлектронная микроскопия — метод структурированных определений макромолекул с разрешением, близким к атомному. Для обработки изображений и расчета структуры доступно несколько пакетов программного обеспечения, но результат на 3D-картах часто различается по качеству и разрешению из-за различий в алгоритмах, применяемых во время вычислений. Таким образом, использование комбинации различных программ часто полезно для достижения оптимальных результатов.Этот протокол помогает пользователям перемещаться по трем различным платформам обработки крио-ЭМ: CryoSPARC, RELION и Scipion. Мы продемонстрируем, как использовать этот конвейер для получения структуры с высоким разрешением аденоассоциированного вируса, который является широко используемым вектором для генной терапии. После открытия CryoSPARC v3 в веб-браузере и создания рабочей области для проекта перейдите к новой рабочей области и откройте конструктор заданий на правой панели.Нажмите на импорт фильмов и укажите путь к фильмам и путь к файлу ссылки. Затем задайте параметры сбора. Затем щелкните очередь, выберите полосу для запуска задания и рабочую область и нажмите кнопку создать.Откройте исправление движения патча и карточку заданий импорта фильмов. Затем перетащите выходные данные imported_movies в заполнитель movies на новом задании и поставьте задание в очередь. Для выполнения функции переноса контраста или оценки CTF откройте патч CTF оценки.Введите сгенерированные микроснимки и поставьте задание в очередь. Чтобы проверить усредненные и ctF скорректированные микроснимки и выбрать подмножество для дальнейшей обработки, откройте кураторские экспозиции, введите экспозиции, полученные на предыдущем шаге, и поставьте задание в очередь. После того, как задание перейдет в режим ожидания, перейдите на интерактивную вкладку в карточке задания.Настройте пороговые значения параметров и принимайте или отклоняйте отдельные микроснимки для дальнейшей обработки. При обработке текущих данных установили верхний порог астигматизма в 400 ангстрем, CTF подогнали разрешение до пяти ангстрем, а относительную толщину льда до двух. Затем нажмите «Готово», чтобы выбрать микроснимки для последующей обработки.Для ручного выбора откройте средство выбора вручную. Введите принятые экспозиции и поставьте задание в очередь. Затем нажмите на интерактивную вкладку, установите размер коробки на 300 пикселей и нажмите на несколько сотен частиц на нескольких микрофотографиях, избегая перекрывающихся частиц.Закончив с выбором, нажмите на готовые частицы экстракта. Затем, чтобы сгенерировать шаблоны для автоматического отбора частиц, нажмите на 2D-классификацию и введите сгенерированные пики частиц. Затем измените число 2D-классов на 10 и поставьте задание в очередь.Затем откройте выбранные 2D-классы и введите частицы и средние значения классов, полученные на предыдущем шаге. Затем нажмите на интерактивную вкладку, выберите репрезентативные 2D-классы с хорошим соотношением сигнал/шум и нажмите готово. Для выбора частиц на основе шаблона откройте средство выбора шаблонов и введите выбранные 2D-классы и микроснимки.Затем установите диаметр частиц в 220 ангстрем и поставьте задание в очередь. Наконец, откройте извлечение из микроснимков и введите микроснимки и частицы, полученные в результате проверки частиц. Затем установите размер извлеченного поля равным 300 пикселям и поставьте задание в очередь.Для 2D-классификации нажмите на 2D-классификацию и введите извлеченные частицы. Затем установите число 2D-классов равным 50 и поставьте задание в очередь. Далее откройте выбранные 2D классы и введите полученные частицы и средние классы.Перейдите на интерактивную вкладку. Выберите 2D-классы на основе разрешения и количества частиц в классе и нажмите «Готово». Чтобы сгенерировать начальный 3D-объем, откройте ab-initio реконструкцию и введите частицы из окончательной 2D-классификации.Затем настройте симметрию на икосаэдрическую и поставьте задание в очередь. Затем откройте однородную очистку, введите объем с предыдущего шага и частицы из окончательной 2D-классификации. Затем измените симметрию и поставьте задание в очередь.Когда задание будет завершено, проверьте корреляцию оболочки Фурье или кривую FSC и загрузите том для изучения в UCSF Chimera. В CryoSPARC v3 откройте карточку заданий выбранного задания 2D-класса из окончательной 2D-классификации. Затем на вкладке подробностей нажмите на задание экспорта.Используя PyEM, преобразуйте particles_exported. cs файл в звездный формат путем выполнения указанной команды. После нажатия на извлечение частиц на вкладке Ввода-вывода введите скорректированные CTF микроснимки и координаты.Затем перейдите на вкладку извлечения, измените размер поля частиц на 300 пикселей и запустите задание. Для 3D-уточнения используйте карту, сгенерированную в CryoSPARC v3, в качестве исходной модели в RELION-3. Выберите метод импорта и задайте указанные параметры на вкладке Ввод-вывод.Затем на вкладке другие выберите карту CryoSPARC v3 в качестве входного файла, измените тип узла на 3D-ссылку и запустите задание. Затем выберите автообработку 3D и на вкладке Ввод-вывод установите входные изображения в качестве частиц. звездный файл из последнего задания выбора.Используйте реконструкцию CryoSPARC v3 в качестве эталонной карты, нажмите на вкладку ссылки и измените начальный фильтр нижних частот на 50 ангстрем, а симметрию на икосаэдрический. Затем на вкладке оптимизации измените диаметр маски на 280 ангстрем и запустите задание. Для постобработки нажмите на постобработку.А на вкладке ввода-вывода введите созданные полукарты и маску и установите калиброванный размер пикселя равным 1,045 ангстрема. Затем на вкладке «Резкость» для автоматической оценки B-фактора введите «Да». Для минимального разрешения для автоматической подгонки B введите 10.А для использования собственного B-фактора, ввода нет. Наконец, на вкладке фильтра установите для параметра пропустить взвешивание FSC значение no и запустите задание. Для обучения полировке откройте байесовскую полировку.А на вкладке «Ввод-вывод» введите микроснимки с поправкой на движение, частицы и PostProcess. звездный файл, полученный ранее. Перейдите на вкладку обучения и установите оптимальные параметры обучения да, долю пикселей Фурье для тестирования в 0,5 и используйте это количество частиц в 5 000.Затем запустите задание. Как только учебная работа будет завершена, нажмите на байесовскую полировку. Затем во вкладке «Обучение» установите оптимальные параметры тренировки на «Нет».Выберите вкладку polish и в файле оптимизированных параметров укажите путь к opt_params_all_groups. txt файл из предыдущего шага и нажмите на запуск. Чтобы оценить аберрации более высокого порядка, откройте уточнение CTF.А на вкладке «Ввод-вывод» в разделе «Частицы» выберите путь к звездному файлу, содержащему отполированные частицы из недавнего усовершенствованного 3D-задания. Затем в postprocess-файле STAR задайте путь к выходным данным последнего задания постобработки. Затем выберите вкладку «Подгонка» и установите для параметра «Оценка анизотропного увеличения» значение «Нет».Выполните подгонку параметра CTF к no. Оцените ширину до да. Также оцените трилистник на да.И оцените аберрации четвертого порядка до да. Затем запустите задание. Для дальнейшего уточнения и проверки карты RELION-3 запустите Scipion 3 и создайте новый проект.На левой панели протоколов выберите выпадающий список импорта и нажмите на импорт частиц. Измените импорт параметров из RELION-3 и звездочку в postprocess.star. Затем укажите параметры сбора, как показано ранее, и нажмите «Выполнить».Затем нажмите на раскрывающийся список импорта и выберите тома импорта. При импорте из укажите путь к карте RELION-3, измените частоту дискретизации размера пикселя до 1,045 ангстрем на пиксель и выполните. Чтобы выполнить глобальное выравнивание, выберите раскрывающееся меню уточнения на панели протоколов и щелкните xmipp3-highres.Введите импортированные частицы и объемы из предыдущих шагов в виде полноразмерных изображений и начальных объемов соответственно и установите группу симметрии в икосаэдрическое. Затем на вкладке выравнивания изображения в разделе угловое назначение выберите глобальный, установите максимальное целевое разрешение в три ангстрема и запустите задание. Чтобы выполнить локальное выравнивание, выберите xmipp3-highres global, измените продолжить с предыдущего запуска на yes и выберите предыдущее задание.Затем на вкладке углового назначения измените выравнивание изображения на локальное и установите максимальное целевое разрешение равным 2,1 ангстрема. После завершения в окне результатов xmipp3-highres нажмите на графики разрешения дисплея, чтобы увидеть, как изменился FSC после уточнения, и нажмите на гистограмму графика с угловыми изменениями, чтобы увидеть, изменились ли назначения углов Эйлера. Проверьте объем в Химере UCSF.Увеличьте масштаб и найдите функции с высоким разрешением. Микроснимки с хорошей посадкой CTF и низким астигматизмом были отобраны для дальнейшей обработки, в то время как снимки с высоким астигматизмом и форфейтом были отброшены. Были выбраны средние значения 2D-классов, содержащие четко определенные классы, а также классы с низким разрешением, шумом и частичными частицами.Здесь показаны области криоэлектронной микроскопической карты, снабженные атомными координатами аденоассоциированного вируса. Четко определенные плотности ЭМ позволяют подгонять боковые цепи отдельных аминокислот, молекул воды и ионов магния. Кривые FSC, рассчитанные с использованием CryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion, указывают на увеличение разрешения в рабочем процессе, оценки разрешения на четырех различных срезах через структуры и гистограммы разрешения демонстрируют постепенное улучшение локального разрешения между картами на протяжении всего рабочего процесса.Объединение алгоритмов крио-ЭМ обработки CryoSPARC, RELION-3, Scipion и Phoenix привело к увеличению разрешения аденоассоциированных вирусных структур с 2,9 до 2,3 ангстрем по всему технологическому конвейеру. Важно помнить, что параметры, указанные на каждом этапе, зависят от образца и микроскопа. Кроме того, способность достичь высокого разрешения в значительной степени зависит от качества выборки и необработанных данных.В этом видео мы представляем надежный рабочий процесс SP для обработки крио-EM данных на различных программных платформах. Используя этот подход, можно реализовать алгоритмы для нескольких программ для уточнения и проверки криоструктур. Этот рабочий процесс может быть применен к расчетам структуры широкого спектра макромолекулярных сборок.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Получение частиц ядра нуклеосом в комплексе с факторами репарации ДНК для определения структуры криоэлектронной микроскопии

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...