Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
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Agradecemos a Carlos Oscar Sorzano por su ayuda con la instalación de Scipion3 y a Kilian Schnelle y Arne Moeller por su ayuda con la transferencia de datos entre diferentes plataformas de procesamiento. Una parte de esta investigación fue apoyada por la subvención U24GM129547 de los NIH y realizada en el PNCC en OHSU y se accedió a través de EMSL (grid.436923.9), una Instalación de Usuario de la Oficina de Ciencia del DOE patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental. Este estudio fue apoyado por una subvención inicial de la Universidad de Rutgers a Arek Kulczyk.

1. Creación de un nuevo proyecto cryoSPARC v3 e importación de datos
NOTA: Los datos se adquirieron en la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón (OHSU) en Portland utilizando un microscopio electrónico Titan Krios de 300 kV equipado con un detector de electrones directo Falcon 3. Las imágenes se recogieron en un modo de conteo con una dosis total de 28,38 e−/Å2 fraccionadas en 129 fotogramas, y un rango de desenfoque de -0,5 μm a -2,5 μm, a un t...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

En este artículo, presentamos un sólido flujo de trabajo SPA para el procesamiento de datos crio-EM en varias plataformas de software para lograr reconstrucciones 3D de alta resolución (Figura 1). Este flujo de trabajo es aplicable a una amplia variedad de macromoléculas biológicas. Los pasos posteriores del protocolo se describen en la Figura 4, incluido el preprocesamiento de películas, la selección y clasificación de partículas y múltiples métodos ...

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) y el análisis de partículas individuales (SPA) permiten la determinación de la estructura de una amplia variedad de conjuntos biomoleculares en su estado hidratado, ayudando a iluminar el papel de estas macromoléculas en detalle atómico. Las mejoras en la óptica del microscopio, el hardware informático y el software de procesamiento de imágenes han permitido determinar estructuras de biomoléculas a una resolución que supera los 2 Å1,2,3. Más de 2.300 estructuras crio-EM se depositaron en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) en 2020, en comparación con 192 estructuras en 20144, lo que indica que la crio-EM se ha convertido en el método de elección para muchos biólogos estructurales. Aquí, describimos un flujo de trabajo que combina tres programas SPA diferentes para la determinación de estructuras de alta resolución (Figura 1).
El objetivo de SPA es reconstruir volúmenes 3D de un espécimen objetivo a partir de imágenes 2D ruidosas grabadas por un detector de microscopio. Los detectores recopilan imágenes como películas con fotogramas individuales del mismo campo de visión. Para preservar la muestra, los fotogramas se recogen con una dosis baja de electrones y, por lo tanto, tienen una mala relación señal-ruido (SNR). Además, la exposición a electrones puede inducir movimiento dentro de las rejillas crio-EM vitrificadas, lo que resulta en el desenfoque de la imagen. Para superar estos problemas, los fotogramas se alinean para corregir el movimiento inducido por el haz y se promedian para producir una micrografía con un SNR aumentado. Estas micrografías luego se someten a una estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) para tener en cuenta los efectos del desenfoque y las aberraciones impuestas por el microscopio. A partir de las micrografías corregidas por CTF, las partículas individuales se seleccionan, extraen y clasifican en promedios de clase 2D que representan diferentes orientaciones adoptadas por la muestra en hielo vítreo. El conjunto homogéneo resultante de partículas se utiliza como entrada para la reconstrucción 3D ab initio para generar un modelo o modelos gruesos, que luego se refinan iterativamente para producir una o más estructuras de alta resolución. Después de la reconstrucción, se realizan refinamientos estructurales para mejorar aún más la calidad y la resolución del mapa crio-EM. Finalmente, un modelo atómico se deriva directamente del mapa, o el mapa está equipado con coordenadas atómicas obtenidas en otro lugar.
Hay diferentes paquetes de software disponibles para realizar las tareas descritas anteriormente, incluidos Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 y otros. Si bien estos programas siguen pasos de procesamiento similares, emplean diferentes algoritmos, por ejemplo, para recoger partículas, generar modelos iniciales y refinar reconstrucciones. Además, estos programas requieren un nivel variable de conocimiento e intervención del usuario para operar, ya que algunos dependen del ajuste fino de los parámetros que pueden actuar como un obstáculo para los nuevos usuarios. Estas discrepancias a menudo resultan en mapas con calidad y resolución inconsistentes en todas las plataformas14, lo que lleva a muchos investigadores a usar múltiples paquetes de software para refinar y validar los resultados. En este artículo destacamos el uso de cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3 para obtener una reconstrucción 3D de alta resolución de AAV, un vector ampliamente utilizado para la terapia génica15. Los paquetes de software antes mencionados son gratuitos para los usuarios académicos; cryoSPARC v3 y Scipion 3 requieren licencias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Los avances recientes tanto en instrumentación como en software de procesamiento de imágenes han hecho que la microscopía crioelectrónica de una sola partícula (cryo-EM) sea el método preferido por los biólogos estructurales para determinar estructuras de alta resolución de una amplia variedad de macromoléculas. Múltiples suites de software están disponibles para usuarios nuevos y expertos para el procesamiento de imágenes y el cálculo de estructuras, que agilizan el mismo flujo de trabajo básico: las películas adquiridas por los detectores de microscopio se someten a corrección para la estimación de la función de transferencia de contraste y movimiento inducida por haz (CTF). A continuación, las imágenes de partículas se seleccionan y extraen de fotogramas de película promediados para la clasificación iterativa 2D y 3D, seguida de la reconstrucción, el refinamiento y la validación en 3D. Debido a que varios paquetes de software emplean diferentes algoritmos y requieren diferentes niveles de experiencia para operar, los mapas 3D que generan a menudo difieren en calidad y resolución. Por lo tanto, los usuarios transfieren datos regularmente entre una variedad de programas para obtener resultados óptimos. Este documento proporciona una guía para que los usuarios naveguen por un flujo de trabajo a través de los paquetes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3 para obtener una estructura de resolución casi atómica del virus adenoasociado (AAV). Primero detallamos una canalización de procesamiento de imágenes con cryoSPARC v3, ya que sus algoritmos eficientes y su GUI fácil de usar permiten a los usuarios llegar rápidamente a un mapa 3D. En el siguiente paso, utilizamos PyEM y scripts internos para convertir y transferir coordenadas de partículas de la reconstrucción 3D de mejor calidad obtenida en cryoSPARC v3 a RELION-3 y Scipion 3 y recalcular mapas 3D. Finalmente, describimos los pasos para un mayor refinamiento y validación de las estructuras resultantes mediante la integración de algoritmos de RELION-3 y Scipion 3. En este artículo, describimos cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos para la determinación de estructuras de alta resolución.

Hemos presentado una completa cartera de SPA para obtener una estructura de alta resolución utilizando tres plataformas de procesamiento diferentes: cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3. La Figura 1 y la Figura 4 resumen el flujo de trabajo de procesamiento general, y la Tabla 1 detalla los protocolos de refinamiento. Estos protocolos se utilizaron durante los refinamientos de una estructura de 2.3 Å de AAV, logrando una resolución cercana a Ny...

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Este artículo describe cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento crio-EM, es decir, cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3, para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos de una sola partícula para la determinación de estructuras de alta resolución.

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

La criomicroscopía electrónica de una sola partícula es el método para determinaciones estructuradas de macromoléculas a una resolución casi atómica. Múltiples paquetes de software están disponibles para el procesamiento de imágenes y cálculos de estructuras, sin embargo, el resultado en los mapas 3D a menudo varía en calidad y resolución debido a las diferencias en los algoritmos aplicados durante los cálculos. Por lo tanto, el uso de una combinación de diferentes programas a menudo es beneficioso para lograr los resultados óptimos.Este protocolo guía a los usuarios a navegar por el flujo de trabajo a través de tres plataformas de procesamiento crio-EM diferentes: CryoSPARC, RELION y Scipion. Demostraremos cómo utilizar esta tubería para obtener una estructura de alta resolución del virus adenoasociado, que es un vector ampliamente utilizado para la terapia génica. Después de abrir CryoSPARC v3 en un navegador web y crear el espacio de trabajo para el proyecto, navegue hasta el nuevo espacio de trabajo y abra el generador de trabajos en el panel derecho.Haga clic en importar películas y proporcione la ruta de las películas y obtenga la ruta del archivo de referencia. A continuación, establezca los parámetros de adquisición. A continuación, haga clic en la cola, seleccione un carril para ejecutar el trabajo y un espacio de trabajo y haga clic en crear.Abra la corrección de movimiento del parche y la tarjeta de trabajo de importación de películas. A continuación, arrastre la salida de imported_movies al marcador de posición de películas en el nuevo trabajo y ponga en cola el trabajo. Para realizar la función de transferencia de contraste o la estimación de CTF, abra el parche CTF estimation.Introduzca las micrografías generadas y ponga en cola el trabajo. Para inspeccionar las micrografías promediadas y corregidas por CTF y seleccionar un subconjunto para su posterior procesamiento, abra exposiciones de curación, ingrese las exposiciones obtenidas del paso anterior y ponga en cola el trabajo. Después de que el trabajo entre en modo de espera, haga clic en la pestaña interactiva en la tarjeta de trabajo.Ajuste los umbrales de los parámetros y acepte o rechace micrografías individuales para su posterior procesamiento. Mientras procesa los datos actuales, establezca el umbral superior de astigmatismo en 400 angstroms, la resolución de ajuste CTF en cinco angstroms y el espesor relativo del hielo en dos. Luego haga clic en listo para seleccionar las micrografías para el procesamiento posterior.Para la recolección manual, abra el selector manual. Introduzca las exposiciones aceptadas y ponga en cola el trabajo. Luego haga clic en la pestaña interactiva, establezca el tamaño de la caja en 300 píxeles y haga clic en unos pocos cientos de partículas en múltiples micrografías, evitando la superposición de partículas.Una vez que haya terminado con la selección, haga clic en listo recoger las partículas de extracto. A continuación, para generar plantillas para la selección automatizada de partículas, haga clic en clasificación 2D e ingrese las selecciones de partículas generadas. A continuación, cambie el número de clases 2D a 10 y ponga en cola el trabajo.A continuación, abra las clases 2D seleccionadas e ingrese las partículas y los promedios de clase obtenidos en el paso anterior. Luego haga clic en la pestaña interactiva, seleccione clases 2D representativas con una buena relación señal-ruido y haga clic en listo. Para la selección de partículas basada en plantillas, abra el selector de plantillas e introduzca las clases y micrografías 2D seleccionadas.A continuación, establezca el diámetro de partícula en 220 angstroms y ponga en cola el trabajo. Finalmente, abra el extracto de las micrografías e ingrese las micrografías y partículas obtenidas de la inspección de las selecciones de partículas. A continuación, establezca el tamaño de la caja extraída en 300 píxeles y ponga en cola el trabajo.Para la clasificación 2D, haga clic en clasificación 2D e ingrese las partículas extraídas. A continuación, establezca el número de clases 2D en 50 y ponga en cola el trabajo. A continuación, abra las clases 2D seleccionadas e ingrese las partículas obtenidas y los promedios de clase.Haga clic en la pestaña interactiva. Elija clases 2D en función de la resolución y el número de partículas en la clase y haga clic en listo. Para generar un volumen 3D inicial, abra la reconstrucción ab-initio e ingrese las partículas de la clasificación 2D final.A continuación, ajuste la simetría a icosaédrico y ponga en cola el trabajo. A continuación, abra el refinamiento homogéneo, ingrese el volumen del paso anterior y las partículas de la clasificación 2D final. A continuación, cambie la simetría y ponga en cola el trabajo.Cuando termine el trabajo, inspeccione la correlación de la cáscara de Fourier o la curva FSC y descargue el volumen para examinarlo en UCSF Chimera. En CryoSPARC v3, abra la tarjeta de trabajo del trabajo de clase 2D seleccionado de la clasificación 2D final. Luego, en la pestaña de detalles, haga clic en exportar trabajo.Con PyEM, convierta el particles_exported. cs a formato estrella ejecutando el comando indicado. Después de hacer clic en la extracción de partículas, en la pestaña E/S, ingrese las micrografías y coordenadas corregidas por CTF.Luego haga clic en la pestaña de extracción, cambie el tamaño del cuadro de partículas a 300 píxeles y ejecute el trabajo. Para el refinamiento 3D, utilice el mapa generado en CryoSPARC v3 como modelo inicial en RELION-3. Seleccione el método de importación y establezca los parámetros indicados en la ficha E/S.Luego, en la pestaña otros, seleccione el mapa CryoSPARC v3 como archivo de entrada, cambie el tipo de nodo a referencia 3D y ejecute el trabajo. A continuación, seleccione el refinamiento automático 3D y, en la pestaña E/S, establezca las imágenes de entrada como partículas. archivo estrella del último trabajo de selección.Utilice la reconstrucción CryoSPARC v3 como mapa de referencia, haga clic en la pestaña de referencia y cambie el filtro inicial de paso bajo a 50 angstroms y la simetría a icosaédrica. Luego, en la pestaña de optimización, cambie el diámetro de la máscara a 280 angstroms y ejecute el trabajo. Para el procesamiento posterior, haga clic en el procesamiento posterior.Y en la pestaña E/S, ingrese los medios mapas y la máscara creados y establezca el tamaño de píxel calibrado en 1.045 angstroms. Luego, en la pestaña de nitidez, para estimar el factor B automáticamente, ingrese sí. Para obtener la resolución más baja para el ajuste automático B, ingrese 10.Y para usar su propio factor B, ingrese no. Finalmente, en la pestaña filtro, establezca omitir la ponderación FSC en no y ejecute el trabajo. Para el entrenamiento de pulido, abra el pulido bayesiano.Y en la pestaña E/S, ingrese las micrografías, partículas y PostProcess corregidos por movimiento. archivo estrella obtenido anteriormente. Haga clic en la pestaña de entrenamiento y establezca los parámetros óptimos del tren en sí, fracción de píxeles de Fourier para probar a 0.5 y use esta cantidad de partículas a 5, 000.A continuación, ejecute el trabajo. Una vez finalizado el trabajo de capacitación, haga clic en Pulido bayesiano. Luego, en la pestaña de entrenamiento, establezca los parámetros óptimos del tren en no.Seleccione la pestaña de pulido y, en el archivo de parámetros optimizados, especifique la ruta a la opt_params_all_groups. txt del paso anterior y haga clic en ejecutar. Para estimar aberraciones de orden superior, abra el refinamiento de CTF.Y en la pestaña E/S debajo de partículas, seleccione la ruta al archivo estrella que contiene partículas pulidas del reciente trabajo 3D refinado. Luego, en el archivo STAR de posproceso, establezca la ruta a la salida del último trabajo de posprocesamiento. A continuación, seleccione la pestaña de ajuste y establezca la ampliación anisotrópica estimada en no.Realice la ajuste del parámetro CTF a no. Estime beamtilt a sí. También estime el trébol a sí.Y estimar las aberraciones de cuarto orden en sí. A continuación, ejecute el trabajo. Para refinar y validar aún más el mapa RELION-3, inicie Scipion 3 y cree un nuevo proyecto.En el panel de protocolos de la izquierda, seleccione el menú desplegable de importaciones y haga clic en importar partículas. Cambie la importación de parámetros de a RELION-3 y el archivo en estrella a postprocess.star. A continuación, especifique los parámetros de adquisición como se demostró anteriormente y haga clic en ejecutar.A continuación, haga clic en el menú desplegable de importaciones y seleccione importar volúmenes. En importar desde, proporcione la ruta al mapa RELION-3, cambie la frecuencia de muestreo del tamaño de píxel a 1,045 angstroms por píxel y ejecútelo. Para realizar una alineación global, seleccione el menú desplegable refinar en el panel de protocolos y haga clic en xmipp3-highres.Ingrese las partículas y volúmenes importados de los pasos anteriores como imágenes de tamaño completo y volúmenes iniciales respectivamente y establezca el grupo de simetría en icosaédrico. Luego, en la pestaña de alineación de imágenes en asignación angular, elija global, establezca la resolución máxima del objetivo en tres angstroms y ejecute el trabajo. Para realizar una alineación local, seleccione xmipp3-highres global, cambie continuar de la ejecución anterior a yes y seleccione el trabajo anterior.Luego, en la pestaña de asignación angular, cambie la alineación de la imagen a local y establezca la resolución máxima del objetivo en 2.1 angstroms. Después de terminar, en la ventana de resultados de xmipp3-highres, haga clic en los gráficos de resolución de pantalla para ver cómo ha cambiado el FSC después del refinamiento y haga clic en el histograma de gráfico con cambios angulares para ver si las asignaciones de ángulo de Euler han cambiado. Inspeccione el volumen en UCSF Chimera.Amplíe y busque funciones de alta resolución. Se seleccionaron micrografías con buen ajuste CTF y bajo astigmatismo para su posterior procesamiento, mientras que aquellas con alto astigmatismo y pérdida se descartaron. Se seleccionaron promedios de clase 2D que contenían clases bien definidas, y se rechazaron aquellos con baja resolución, ruido y partículas parciales.Aquí se muestran las regiones del mapa de microscopía crioelectrónica equipadas con coordenadas atómicas de un virus adenoasociado. Las densidades EM bien definidas permiten ajustar cadenas laterales de aminoácidos individuales, moléculas de agua e iones de magnesio. Las curvas FSC calculadas con CryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion indican una resolución creciente en todo el flujo de trabajo, las estimaciones de resolución en cuatro segmentos diferentes a través de las estructuras y los histogramas de resolución demuestran la mejora incremental en la resolución local entre los mapas a lo largo del flujo de trabajo.La combinación de algoritmos de procesamiento crio-EM de CryoSPARC, RELION-3, Scipion y Phoenix dio como resultado un aumento de la resolución de las estructuras de virus adenoasociadas de 2.9 a 2.3 angstroms en toda la tubería de procesamiento. Es importante recordar que los parámetros especificados en cada paso dependen de la muestra y del microscopio. Además, la capacidad de alcanzar una alta resolución depende en gran medida de la calidad de la muestra y de los datos en bruto.En este video, presentamos el robusto flujo de trabajo de SP para el procesamiento de datos cryo-EM en varias plataformas de software. Mediante el uso de este enfoque, se pueden implementar algoritmos para múltiples programas para refinar y validar las estructuras criogénicas. Este flujo de trabajo se puede aplicar a los cálculos de estructura de una amplia variedad de conjuntos macromoleculares.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Investigación

Bioquímica

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Análisis crio-EM y de partículas individuales con Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparación de partículas de núcleo de nucleosomas complejadas con factores de reparación de ADN para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...