Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Vi tackar Carlos Oscar Sorzano för hjälp med Scipion3 installation och Kilian Schnelle och Arne Moeller för hjälp med dataöverföring mellan olika bearbetningsplattformar. En del av denna forskning stöddes av NIH-anslaget U24GM129547 och utfördes vid PNCC vid OHSU och nås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsrad av Office of Biological and Environmental Research. Denna studie stöddes av ett startbidrag från Rutgers University till Arek Kulczyk.

1. Skapa ett nytt cryoSPARC v3-projekt och importera data
OBS: Data förvärvades vid Oregon Health and Science University (OHSU) i Portland med hjälp av ett 300 kV Titan Krios elektronmikroskop utrustat med en Falcon 3 direkt elektrondetektor. Bilderna samlades in i ett räkneläge med en total dos på 28,38 e−/Å2 fraktionerad över 129 bildrutor och ett defokusområde från -0,5 μm till -2,5 μm, vid en pixelstorlek på 1,045 Å med EPU. Provet av AA...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

I den här artikeln presenterar vi ett robust SPA-arbetsflöde för kryo-EM-databehandling över olika mjukvaruplattformar för att uppnå högupplösta 3D-rekonstruktioner (Figur 1). Detta arbetsflöde är tillämpligt på en mängd olika biologiska makromolekyler. De efterföljande stegen i protokollet beskrivs i figur 4, inklusive förbehandling av film, partikelplockning och klassificering samt flera metoder för strukturförfining (tabell <...

Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) och enpartikelanalys (SPA) möjliggör strukturbestämning av en mängd olika biomolekylära sammansättningar i deras hydratiserade tillstånd, vilket hjälper till att belysa dessa makromolekylers roller i atomdetaljer. Förbättringar av mikroskopoptik, datorhårdvara och bildbehandlingsprogramvara har gjort det möjligt att bestämma strukturer för biomolekyler med upplösning som når bortom 2 Å1,2,3. Mer än 2 300 kryo-EM-strukturer deponerades i Protein Data Bank (PDB) 2020, jämfört med 192 strukturer 20144, vilket indikerar att kryo-EM har blivit den valda metoden för många strukturbiologer. Här beskriver vi ett arbetsflöde som kombinerar tre olika SPA-program för högupplöst strukturbestämning (Figur 1).
Målet med SPA är att rekonstruera 3D-volymer av ett målprov från bullriga 2D-bilder som spelats in av en mikroskopdetektor. Detektorer samlar in bilder som filmer med enskilda bildrutor med samma synfält. För att bevara provet samlas ramar in med en låg elektrondos och har därmed ett dåligt signal-brusförhållande (SNR). Dessutom kan elektronexponering inducera rörelse inom de förglasade kryo-EM-rutnäten, vilket resulterar i bildsuddning. För att övervinna dessa problem justeras ramarna för att korrigera för strålinducerad rörelse och i genomsnitt för att ge en mikrograf med en ökad SNR. Dessa mikrografer genomgår sedan uppskattning av kontrastöverföringsfunktionen (CTF) för att ta hänsyn till effekterna av defokus och avvikelser som mikroskopet påför. Från de CTF-korrigerade mikrograferna väljs, extraheras och sorteras enskilda partiklar i 2D-klassmedelvärde som representerar olika orienteringar som antas av provet i glasis. Den resulterande homogena uppsättningen partiklar används som ingång för ab initio 3D-rekonstruktion för att generera en grov modell eller modeller, som sedan iterativt förfinas för att producera en eller flera högupplösta strukturer. Efter rekonstruktion utförs strukturella förfiningar för att ytterligare förbättra kryo-EM-kartans kvalitet och upplösning. Slutligen är antingen en atommodell direkt härledd från kartan, eller kartan är utrustad med atomkoordinater som erhållits någon annanstans.
Olika mjukvarupaket är tillgängliga för att utföra de uppgifter som beskrivs ovan, inklusive Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 och andra. Medan dessa program följer liknande bearbetningssteg använder de olika algoritmer, till exempel för att plocka partiklar, generera initiala modeller och förfina rekonstruktioner. Dessutom kräver dessa program en varierande nivå av användarkunskap och ingripande för att fungera, eftersom vissa är beroende av finjustering av parametrar som kan fungera som ett hinder för nya användare. Dessa avvikelser resulterar ofta i kartor med inkonsekvent kvalitet och upplösning över plattformar14, vilket får många forskare att använda flera mjukvarupaket för att förfina och validera resultat. I den här artikeln belyser vi användningen av cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att få en högupplöst 3D-rekonstruktion av AAV, en allmänt använd vektor för genterapi15. De ovannämnda mjukvarupaketen är gratis för akademiska användare; cryoSPARC v3 och Scipion 3 kräver licenser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Nya framsteg inom både instrumentering och bildbehandlingsprogramvara har gjort kryoelektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) till den föredragna metoden för strukturbiologer att bestämma högupplösta strukturer av en mängd olika makromolekyler. Flera programvarusviter är tillgängliga för nya och expertanvändare för bildbehandling och strukturberäkning, vilket effektiviserar samma grundläggande arbetsflöde: filmer som förvärvas av mikroskopdetektorerna genomgår korrigering för uppskattning av strålinducerad rörelse och kontrastöverföringsfunktion (CTF). Därefter väljs partikelbilder och extraheras från genomsnittliga filmramar för iterativ 2D- och 3D-klassificering, följt av 3D-rekonstruktion, förfining och validering. Eftersom olika mjukvarupaket använder olika algoritmer och kräver olika kompetensnivåer för att fungera, skiljer sig de 3D-kartor de genererar ofta i kvalitet och upplösning. Således överför användare regelbundet data mellan en mängd olika program för optimala resultat. Detta dokument ger en guide för användare att navigera i ett arbetsflöde över de populära mjukvarupaketen: cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att få en nära atomupplösningsstruktur för det adenoassocierade viruset (AAV). Vi beskriver först en bildbehandlingspipeline med cryoSPARC v3, eftersom dess effektiva algoritmer och lättanvända GUI gör det möjligt för användare att snabbt komma fram till en 3D-karta. I nästa steg använder vi PyEM och interna skript för att konvertera och överföra partikelkoordinater från 3D-rekonstruktion av bästa kvalitet som erhållits i cryoSPARC v3 till RELION-3 och Scipion 3 och beräkna om 3D-kartor. Slutligen beskriver vi steg för ytterligare förfining och validering av de resulterande strukturerna genom att integrera algoritmer från RELION-3 och Scipion 3. I den här artikeln beskriver vi hur du effektivt använder tre bearbetningsplattformar för att skapa ett enda och robust arbetsflöde som är tillämpligt på en mängd olika datauppsättningar för högupplöst strukturbestämning.

Vi har presenterat en omfattande SPA-pipeline för att få en högupplöst struktur med hjälp av tre olika bearbetningsplattformar: cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3. Figur 1 och figur 4 sammanfattar det allmänna bearbetningsarbetsflödet och tabell 1 beskriver förfiningsprotokoll. Dessa protokoll användes vid förfining av en 2,3 Å-struktur av AAV, vilket uppnådde nära Nyquist-upplösning.
Filmer importerad...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Den här artikeln beskriver hur man effektivt använder tre kryo-EM-bearbetningsplattformar, dvs. cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3, för att skapa ett enda och robust arbetsflöde som är tillämpligt på en mängd olika enpartikeldatauppsättningar för högupplöst strukturbestämning.

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Kryoelektronmikroskopi med en partikel är metoden för strukturerade bestämningar av makromolekyler vid nära atomupplösning. Flera mjukvarupaket finns tillgängliga för bildbehandling och strukturberäkningar, men resultatet på 3D-kartor varierar ofta i kvalitet och upplösning på grund av skillnaderna i algoritmer som tillämpas under beräkningarna. Således är det ofta fördelaktigt att använda en kombination av olika program för att uppnå optimala resultat.Detta protokoll guidar användare att navigera i arbetsflödet över tre olika kryo-EM-bearbetningsplattformar: CryoSPARC, RELION och Scipion. Vi kommer att visa hur man använder denna pipeline för att erhålla en högupplöst struktur av det adenoassocierade viruset som är en allmänt använd vektor för genterapi. När du har öppnat CryoSPARC v3 i en webbläsare och skapat arbetsytan för projektet navigerar du till den nya arbetsytan och öppnar jobbbyggaren på den högra panelen.Klicka på importera filmer och ange filmens sökväg och få referensfilsökväg. Ställ sedan in förvärvsparametrarna. Klicka sedan på kö, välj en körfält för att köra jobbet och en arbetsyta och klicka på skapa.Öppna patchrörelsekorrigering och jobbkortet för importfilmer. Dra sedan imported_movies utdata till filmplatshållaren för det nya jobbet och köa jobbet. För att utföra kontrastöverföringsfunktionen eller CTF-uppskattningen, öppna patch CTF-uppskattning.Ange de genererade mikrograferna och köa jobbet. För att inspektera de genomsnittliga och CTF-korrigerade mikrograferna och välja en delmängd för vidare bearbetning, öppna kuratexponeringar, mata in exponeringarna som erhållits från föregående steg och köa jobbet. När jobbet går in i vänteläge klickar du på den interaktiva fliken på jobbkortet.Justera parametertrösklarna och acceptera eller avvisa enskilda mikrografer för vidare bearbetning. När du bearbetar aktuella data, ställ in den övre tröskeln för astigmatism till 400 ångström, CTF passar upplösningen till fem ångström och relativ istjocklek till två. Klicka sedan på klar för att välja mikrografer för nedströms bearbetning.För manuell plockning öppnar du den manuella plockaren. Ange de godkända exponeringarna och köa jobbet. Klicka sedan på den interaktiva fliken, ställ in lådans storlek till 300 pixlar och klicka på några hundra partiklar över flera mikrografer och undvik överlappande partiklar.När du är klar med valet klickar du på klar med att plocka extraktpartiklar. För att generera mallar för automatiserad partikelplockning klickar du sedan på 2D-klassificering och matar in de genererade partikelvalen. Ändra sedan antalet 2D-klasser till 10 och köa jobbet.Öppna sedan välj 2D-klasser och mata in partiklarna och klassmedelvärdet som erhållits i föregående steg. Klicka sedan på den interaktiva fliken, välj representativa 2D-klasser med ett bra signal-brusförhållande och klicka på klar. För mallbaserad partikelplockning öppnar du mallväljaren och matar in de valda 2D-klasserna och mikrograferna.Ställ sedan in partikeldiametern på 220 ångström och köa jobbet. Slutligen öppna extrakt från mikrografer och mata in mikrografer och partiklar som erhållits genom att inspektera partikelplockningar. Ställ sedan in den extraherade rutans storlek på 300 pixlar och köa jobbet.För 2D-klassificering, klicka på 2D-klassificering och mata in de extraherade partiklarna. Ange sedan antalet 2D-klasser till 50 och köa jobbet. Öppna sedan välj 2D-klasser och mata in de erhållna partiklarna och klassmedelvärdet.Klicka på den interaktiva fliken. Välj 2D-klasser baserat på upplösningen och antalet partiklar i klassen och klicka på klar. För att generera en initial 3D-volym, öppna ab-initio-rekonstruktion och mata in partiklarna från den slutliga 2D-klassificeringen.Justera sedan symmetrin till icosahedral och köa jobbet. Därefter öppnar homogen förfining, matar in volymen från föregående steg och partiklar från den slutliga 2D-klassificeringen. Ändra sedan symmetrin och köa jobbet.När jobbet är klart, inspektera Fourier-skalkorrelationen eller FSC-kurvan och ladda ner volymen för att undersöka i UCSF Chimera. I CryoSPARC v3 öppnar du jobbkortet för det valda 2D-klassjobbet från den slutliga 2D-klassificeringen. Klicka sedan på exportjobb på fliken Detaljer.Konvertera particles_exported med PyEM. cs-fil till stjärnformat genom att utföra det angivna kommandot. Efter att ha klickat på partikelextraktion, på fliken I / O, mata in CTF-korrigerade mikrografer och koordinater.Klicka sedan på fliken Extrahera, ändra partikelboxens storlek till 300 pixlar och kör jobbet. För 3D-förfining, använd kartan som genereras i CryoSPARC v3 som en initial modell i RELION-3. Välj importmetod och ställ in de angivna parametrarna på fliken I/O.På fliken Andra väljer du sedan CryoSPARC v3-kartan som indatafil, ändrar nodtyp till 3D-referens och kör jobbet. Välj sedan 3D-autoförfining och på fliken I / O ställer du in inmatningsbilder som partiklar. stjärnfil från det senaste urvalsjobbet.Använd CryoSPARC v3-rekonstruktionen som referenskarta, klicka på referensfliken och ändra initialt lågpassfilter till 50 ångström och symmetri till icosahedral. Ändra sedan maskdiametern till 280 ångström på optimeringsfliken och kör jobbet. För efterbehandling, klicka på efterbehandling.Och på fliken I / O, mata in de skapade halvkartorna och masken och ställ in den kalibrerade pixelstorleken till 1.045 ångström. Sedan på fliken skärpa, för uppskattning B-faktor automatiskt, mata in ja. För lägsta upplösning för automatisk B-passform, ingång 10.Och för användning din egen B-faktor, ingång nr. Slutligen anger du hoppa över FSC-viktning till nej på filterfliken och kör jobbet. För poleringsträning, öppna Bayesiansk polering.Och på fliken I/O anger du rörelsekorrigerade mikrografer, partiklar och PostProcess. star-fil som erhållits tidigare. Klicka på fliken Träning och ställ in träna optimala parametrar till ja, bråkdel av Fourierpixlar för testning till 0,5 och använd så många partiklar till 5 000.Kör sedan jobbet. När träningsjobbet är klart klickar du på Bayesiansk polering. På fliken Träning ställer du sedan in träna optimala parametrar på nej.Välj fliken Polering och ange sökvägen till opt_params_all_groups i optimerad parameterfil. txt-fil från föregående steg och klicka på kör. Om du vill uppskatta högre ordningsavvikelser öppnar du CTF-förfining.Och på fliken I/O under partiklar väljer du sökvägen till stjärnfilen som innehåller polerade partiklar från det senaste förfinade 3D-jobbet. Under STAR-filen efter processen anger du sedan sökvägen till utdata från det senaste efterbearbetningsjobbet. Välj sedan fliken Passform och ställ in uppskattnings anisotrop förstoring till nej.Utför CTF-parameteranpassning till nr. Uppskatta beamtilt till ja. Uppskatta också trefoil till ja.Och uppskatta fjärde ordningens avvikelser till ja. Kör sedan jobbet. För att ytterligare förfina och validera RELION-3-kartan, starta Scipion 3 och skapa ett nytt projekt.På den vänstra protokollpanelen väljer du rullgardinsmenyn import och klickar på importera partiklar. Ändra parametrarna importera från till RELION-3 och star-filen till postprocess.star. Ange sedan förvärvsparametrarna som visats tidigare och klicka på kör.Klicka sedan på rullgardinsmenyn importer och välj importera volymer. Under importera från anger du sökvägen till RELION-3-kartan, ändrar samplingsfrekvensen för pixelstorleken till 1,045 ångström per pixel och kör. För att utföra en global justering, välj rullgardinsmenyn Förfina från protokollpanelen och klicka på xmipp3-highres.Mata in de importerade partiklarna och volymerna från föregående steg som bilder i full storlek respektive initialvolymer och ställ in symmetrigruppen till icosahedral. På fliken Bildjustering under vinkeltilldelning väljer du sedan global, anger den maximala målupplösningen till tre ångström och kör jobbet. Om du vill utföra en lokal justering väljer du xmipp3-highres global, ändrar fortsätt från föregående körning till ja och väljer föregående jobb.På fliken vinkeltilldelning ändrar du sedan bildjusteringen till lokal och ställer in den maximala målupplösningen till 2,1 ångström. Efter avslutad, i xmipp3-highres resultatfönstret, klicka på skärmupplösningsdiagram för att se hur FSC har förändrats efter förfiningen och klicka på plott histogram med vinkeländringar för att se om Euler-vinkeltilldelningarna har ändrats. Kontrollera volymen i UCSF Chimera.Zooma in och leta efter högupplösta funktioner. Mikrografer med god CTF-passform och låg astigmatism valdes ut för vidare bearbetning, medan de med hög astigmatism och förlust kasserades. 2D-klassmedelvärde som innehöll väldefinierade klasser valdes, och de med låg upplösning, brus och partiella partiklar avvisades.Regioner i kryoelektronmikroskopikartan utrustad med atomkoordinater för ett adenoassocierat virus visas här. Väldefinierade EM-densiteter möjliggör montering av sidokedjor av enskilda aminosyror, vattenmolekyler och magnesiumjoner. FSC-kurvor beräknade med CryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion indikerar ökad upplösning i hela arbetsflödet, upplösningsuppskattningar vid fyra olika skivor genom strukturerna och upplösnings histogrammen visar den inkrementella förbättringen av lokal upplösning mellan kartorna i hela arbetsflödet.Kombinationen av kryo-EM-bearbetningsalgoritmer för CryoSPARC, RELION-3, Scipion och Phoenix resulterade i en upplösningsökning av de adenoassocierade virusstrukturerna från 2,9 till 2,3 ångström över bearbetningsrörledningen. Det är viktigt att komma ihåg att parametrarna som anges i varje steg är prov- och mikroskopberoende. Dessutom beror förmågan att nå hög upplösning i hög grad på provets kvalitet och rådata.I den här videon presenterar vi det robusta SP-arbetsflödet för bearbetning av kryo-EM-data på olika mjukvaruplattformar. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan man implementera algoritmer för flera program för att förfina och validera kryostrukturer. Detta arbetsflöde kan tillämpas på strukturberäkningar av en mängd olika makromolekylära sammansättningar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell Blot-and-Plunge frysning av biologiska exemplar för enpartikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Beredning av nukleosomkärnpartiklar komplexerade med DNA-reparationsfaktorer för kryoelektronmikroskopi Strukturell bestämning

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM-datainsamling med steglutning med Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...