Name: a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

Carlos Oscar Sorzano'ya Scipion3 kurulumundaki yardımları için ve Kilian Schnelle ve Arne Moeller'e farklı işleme platformları arasında veri aktarımı konusunda yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu araştırmanın bir kısmı NIH hibesi U24GM129547 tarafından desteklendi ve OHSU'daki PNCC'de gerçekleştirildi ve Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi tarafından desteklenen bir DOE Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan EMSL (grid.436923.9) aracılığıyla erişildi. Bu çalışma, Rutgers Üniversitesi'nden Arek Kulczyk'e verilen bir start-up hibesi ile desteklenmiştir.

1. Yeni bir cryoSPARC v3 projesi oluşturma ve verileri içe aktarma
NOT: Veriler, Portland'daki Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nde (OHSU), bir Falcon 3 doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 300 kV Titan Krios elektron mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. Görüntüler, 129 kare boyunca kesirlenmiş toplam 28,38 e−/Å2 dozu ve EPU kullanılarak 1,045 şpiksel boyutunda -0,5 μm ila -2,5 μm arasında bir bulanıklaştırma aralı?...

<ol>
	<li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase.">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery.">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A.">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li><li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021)</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMIPP:+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy.">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li><li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+cryo-EM+structures.">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020)</li><li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topaz-Denoise:+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET.">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>. Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019)</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>. MotionCor2 User Manual Available from: <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018)</li><li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li><li>. UCSF PyEM v0.5 Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019)</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li><li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion.">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps.">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li><li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li><li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy.">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li><li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV-DJ)-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution.">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194 (2020).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166 (2018).</li><li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis.">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li></ol>

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için çeşitli yazılım platformlarında kriyo-EM veri işleme için sağlam bir SPA iş akışı sunuyoruz (Şekil 1). Bu iş akışı çok çeşitli biyolojik makromoleküllere uygulanabilir. Protokolün sonraki adımları, film ön işleme, parçacık toplama ve sınıflandırma ve yapı iyileştirmeleri (Tablo 1) ve doğrulama için çoklu yöntemler dahil olmak üzere <strong cl...

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) ve tek parçacık analizi (SPA), hidratlanmış hallerinde çok çeşitli biyomoleküler montajların yapı tayinini sağlayarak bu makromoleküllerin rollerini atomik detaylarda aydınlatmaya yardımcı olur. Mikroskop optiği, bilgisayar donanımı ve görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, biyomoleküllerin yapılarını 2 Å1,2,3'ün ötesine ulaşan çözünürlükte belirlemeyi mümkün kılmıştır. 2020 yılında Protein Veri Bankası'na (PDB) 2.300'den fazla kriyo-EM yapısı yatırılırken, 20144 yılında 192 yapıya kıyasla, kriyo-EM'nin birçok yapısal biyolog için tercih edilen yöntem haline geldiğini göstermektedir. Burada, yüksek çözünürlüklü yapı tayini için üç farklı SPA programını birleştiren bir iş akışını açıklıyoruz (Şekil 1).
SPA'nın amacı, bir mikroskop dedektörü tarafından kaydedilen gürültülü 2D görüntülerden bir hedef numunenin 3D hacimlerini yeniden yapılandırmaktır. Dedektörler, görüntüleri aynı görüş alanına sahip ayrı karelere sahip filmler olarak toplar. Numuneyi korumak için, çerçeveler düşük elektron dozuyla toplanır ve bu nedenle zayıf bir sinyal-gürültü oranına (SNR) sahiptir. Ek olarak, elektron pozlaması vitrifiye kriyo-EM ızgaraları içinde hareketi indükleyebilir ve görüntü bulanıklığına neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çerçeveler ışın kaynaklı hareketi düzeltmek için hizalanır ve artan SNR'ye sahip bir mikrograf üretmek için ortalamaları alınır. Bu mikrograflar daha sonra mikroskop tarafından uygulanan bulanıklaştırma ve sapmaların etkilerini hesaba katmak için Kontrast Transfer Fonksiyonu (CTF) tahminine tabi tutulur. CTF ile düzeltilmiş mikrograflardan, bireysel parçacıklar seçilir, ekstrakte edilir ve vitreus buzdaki numune tarafından benimsenen farklı yönelimleri temsil eden 2D sınıf ortalamalarına ayrılır. Ortaya çıkan homojen parçacık kümesi, kaba bir model veya modeller oluşturmak için ab initio 3D rekonstrüksiyonu için girdi olarak kullanılır ve bunlar daha sonra bir veya daha fazla yüksek çözünürlüklü yapı üretmek için yinelemeli olarak rafine edilir. Rekonstrüksiyondan sonra, kriyo-EM haritasının kalitesini ve çözünürlüğünü daha da iyileştirmek için yapısal iyileştirmeler yapılır. Son olarak, ya bir atomik model doğrudan haritadan türetilir ya da harita başka bir yerde elde edilen atomik koordinatlarla donatılmıştır.
Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 ve diğerleri dahil olmak üzere yukarıda özetlenen görevleri yerine getirmek için farklı yazılım paketleri mevcuttur. Bu programlar benzer işleme adımlarını izlerken, örneğin parçacıkları toplamak, ilk modeller oluşturmak ve rekonstrüksiyonları rafine etmek için farklı algoritmalar kullanırlar. Ek olarak, bu programların çalışması için farklı düzeyde kullanıcı bilgisi ve müdahalesi gerekir, çünkü bazıları yeni kullanıcılar için bir engel teşkil edebilecek parametrelerin ince ayarına bağlıdır. Bu tutarsızlıklar genellikle platformlar arasında tutarsız kalite ve çözünürlüğe sahip haritalara neden olur14 ve birçok araştırmacının sonuçları iyileştirmek ve doğrulamak için birden fazla yazılım paketi kullanmasına neden olur. Bu makalede, gen terapisi için yaygın olarak kullanılan bir vektör olan AAV'nin yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için kriyoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün kullanımını vurguladık15. Yukarıda belirtilen yazılım paketleri akademik kullanıcılar için ücretsizdir; cryoSPARC v3 ve Scipion 3 lisans gerektirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Structura Biotechnology Inc.</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND 4</td>
			<td>Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>UCSF Macromolecular Structure Group</td>
			<td>https://msg.ucsf.edu/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)</td>
			<td>http://www.phenix-online.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyEM</td>
			<td>Univerisity of California, San Francisco</td>
			<td>https://github.com/asarnow/pyem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>MRC Laboratory of Structural Biology</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipion</td>
			<td>Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab</td>
			<td>http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion

Hem enstrümantasyon hem de görüntü işleme yazılımındaki son gelişmeler, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobunu (kriyo-EM), yapısal biyologların çok çeşitli makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için tercih ettikleri yöntem haline getirmiştir. Görüntü işleme ve yapı hesaplaması için yeni ve uzman kullanıcılar tarafından aynı temel iş akışını kolaylaştıran birden fazla yazılım paketi mevcuttur: mikroskop dedektörleri tarafından edinilen filmler, ışın kaynaklı hareket ve kontrast aktarım fonksiyonu (CTF) tahmini için düzeltmeye tabi tutulur. Daha sonra, parçacık görüntüleri yinelemeli 2B ve 3B sınıflandırma için ortalama film karelerinden seçilir ve ayıklanır, ardından 3B yeniden yapılandırma, iyileştirme ve doğrulama yapılır. Çeşitli yazılım paketleri farklı algoritmalar kullandığından ve çalışmak için farklı uzmanlık seviyeleri gerektirdiğinden, ürettikleri 3D haritalar genellikle kalite ve çözünürlük bakımından farklılık gösterir. Böylece, kullanıcılar en iyi sonuçlar için çeşitli programlar arasında düzenli olarak veri aktarırlar. Bu makale, kullanıcıların popüler yazılım paketlerinde bir iş akışında gezinmeleri için bir kılavuz sağlar: adeno ilişkili virüsün (AAV) atomik çözünürlüğe yakın bir yapısını elde etmek için cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. İlk önce cryoSPARC v3 ile bir görüntü işleme boru hattını detaylandırıyoruz, çünkü verimli algoritmaları ve kullanımı kolay GUI'si kullanıcıların bir 3D haritaya hızlı bir şekilde ulaşmalarını sağlıyor. Bir sonraki adımda, parçacık koordinatlarını cryoSPARC v3'te elde edilen en iyi kalitede 3D rekonstrüksiyondan RELION-3 ve Scipion 3'e dönüştürmek ve aktarmak ve 3D haritaları yeniden hesaplamak için PyEM ve şirket içi komut dosyalarını kullanıyoruz. Son olarak, RELION-3 ve Scipion 3'ten algoritmaları entegre ederek ortaya çıkan yapıların daha fazla iyileştirilmesi ve doğrulanması için adımları özetliyoruz. Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak üzere üç işleme platformunun etkili bir şekilde nasıl kullanılacağını açıklayacağız.

Üç farklı işleme platformu kullanarak yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek için kapsamlı bir SPA boru hattı sunduk: cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. Şekil 1 ve Şekil 4, genel işleme iş akışını özetler ve Tablo 1, iyileştirme protokollerini ayrıntılarıyla açıklar. Bu protokoller, AAV'nin 2.3 şyapısının iyileştirilmesi sırasında kullanıldı ve Nyquist çözünürlüğüne yakın bir çözünürlük eld...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion at JoVE.com

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobu, makromoleküllerin atomik çözünürlüğe yakın yapılandırılmış tayinleri için kullanılan yöntemdir. Görüntü işleme ve yapı hesaplamaları için birden fazla yazılım paketi mevcuttur, ancak 3D haritalardaki sonuç, hesaplamalar sırasında uygulanan algoritmalardaki farklılıklar nedeniyle genellikle kalite ve çözünürlükte farklılık gösterir. Bu nedenle, farklı programların bir kombinasyonunu kullanmak, en iyi sonuçları elde etmek için genellikle faydalıdır.Bu protokol, kullanıcıları üç farklı cryo-EM işleme platformunda iş akışında gezinmeye yönlendirir: CryoSPARC, RELION ve Scipion. Gen terapisi için yaygın olarak kullanılan bir vektör olan adeno ilişkili virüsün yüksek çözünürlüklü bir yapısını elde etmek için bu boru hattının nasıl kullanılacağını göstereceğiz. CryoSPARC v3'ü bir web tarayıcısında açtıktan ve proje için çalışma alanını oluşturduktan sonra, yeni çalışma alanına gidin ve sağ paneldeki iş oluşturucuyu açın.Filmleri içe aktar'a tıklayın ve film yolunu sağlayın ve referans dosya yolunu kazanın. Ardından alma parametrelerini ayarlayın. Ardından, kuyruğa tıklayın, işi çalıştırmak için bir şerit ve bir çalışma alanı seçin ve oluştur'a tıklayın.Yama hareket düzeltmesini ve filmleri içe aktarma iş kartını açın. Ardından imported_movies çıktısını yeni işteki filmler yer tutucusuna sürükleyin ve işi kuyruğa alın. Kontrast aktarım işlevini veya CTF tahminini gerçekleştirmek için, CTF tahminini açın.Oluşturulan mikrografları girin ve işi sıraya alın. Ortalama ve CTF düzeltilmiş mikrografları incelemek ve daha sonraki işlemler için bir alt küme seçmek için, pozlamaları açın, önceki adımdan elde edilen pozlamaları girin ve işi sıraya koyun. İş bekleme moduna girdikten sonra, iş kartındaki etkileşimli sekmeye tıklayın.Parametre eşiklerini ayarlayın ve daha sonraki işlemler için tek tek mikrografları kabul edin veya reddedin. Mevcut verileri işlerken, astigmatizmanın üst eşiğini 400 angstroma, CTF uyum çözünürlüğünü beş angstroma ve nispi buz kalınlığını ikiye ayarlayın. Ardından, aşağı akış işleme için mikrografları seçmek üzere bitti'ye tıklayın.Manuel tabanlı toplama için, manuel seçiciyi açın. Kabul edilen pozlamaları girin ve işi kuyruğa alın. Ardından etkileşimli sekmeye tıklayın, kutu boyutunu 300 piksele ayarlayın ve üst üste binen parçacıklardan kaçınarak birden fazla mikrografta birkaç yüz parçacığa tıklayın.Seçim bittiğinde, ekstrakt parçacıklarının toplanması bitti'ye tıklayın. Ardından, otomatik partikül toplama şablonları oluşturmak için, 2B sınıflandırmaya tıklayın ve oluşturulan partikül toplamalarını girin. Ardından 2B sınıf sayısını 10 olarak değiştirin ve işi kuyruğa alın.Ardından, seçilen 2B sınıfları açın ve önceki adımda elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin. Ardından etkileşimli sekmeye tıklayın, iyi bir sinyal-gürültü oranına sahip temsili 2D sınıfları seçin ve bitti'ye tıklayın. Şablon tabanlı parçacık toplama için, şablon seçiciyi açın ve seçilen 2B sınıfları ve mikrografları girin.Ardından parçacık çapını 220 angstrom olarak ayarlayın ve işi sıraya koyun. Son olarak, mikrograflardan ekstraktı açın ve parçacık toplamalarının incelenmesinden elde edilen mikrografları ve parçacıkları girin. Ardından ayıklanan kutu boyutunu 300 piksel olarak ayarlayın ve işi sıraya alın.2B sınıflandırma için, 2B sınıflandırmaya tıklayın ve çıkarılan parçacıkları girin. Ardından 2B sınıf sayısını 50 olarak ayarlayın ve işi kuyruğa alın. Ardından, seçilen 2B sınıfları açın ve elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin.İnteraktif sekmesine tıklayın. Sınıftaki çözünürlüğe ve parçacık sayısına göre 2B sınıfları seçin ve bitti'ye tıklayın. İlk 3B hacim oluşturmak için, ab-initio rekonstrüksiyonunu açın ve parçacıkları son 2B sınıflandırmasından girin.Ardından simetriyi ikosahedral olarak ayarlayın ve işi sıraya koyun. Ardından, homojen arıtmayı açın, önceki adımdan hacmi ve son 2B sınıflandırmadan parçacıkları girin. Ardından simetriyi değiştirin ve işi kuyruğa alın.İş bittiğinde, Fourier kabuk korelasyonunu veya FSC eğrisini inceleyin ve UCSF Chimera'da incelemek üzere birimi indirin. CryoSPARC v3'te, son 2B sınıflandırmadan seçilen 2B sınıf işin iş kartını açın. Ardından ayrıntılar sekmesinde, işi dışa aktar'a tıklayın.PyEM'i kullanarak particles_exported dönüştürün. cs dosyasını yıldız formatına getirerek belirtilen komutu çalıştırır. Parçacık ekstraksiyonuna tıkladıktan sonra, G / Ç sekmesinde, CTF düzeltilmiş mikrografları ve koordinatları girin.Ardından ayıklama sekmesine tıklayın, parçacık kutusu boyutunu 300 piksel olarak değiştirin ve işi çalıştırın. 3B iyileştirme için, CryoSPARC v3'te oluşturulan haritayı RELION-3'te ilk model olarak kullanın. İçe aktarma yöntemini seçin ve G/Ç sekmesinde belirtilen parametreleri ayarlayın.Ardından diğerleri sekmesinde, giriş dosyası olarak CryoSPARC v3 eşlemesini seçin, düğüm türünü 3B başvuru olarak değiştirin ve işi çalıştırın. Ardından, 3B otomatik iyileştirmeyi seçin ve G/Ç sekmesinde, giriş görüntülerini parçacıklar olarak ayarlayın. son seçim işinden yıldız dosyası.CryoSPARC v3 rekonstrüksiyonunu referans harita olarak kullanın, referans sekmesine tıklayın ve ilk düşük geçirgen filtreyi 50 angstrom ve simetriyi icosahedral olarak değiştirin. Ardından optimizasyon sekmesinde, maske çapını 280 angstrom olarak değiştirin ve işi çalıştırın. İşlem sonrası için, işlem sonrasına tıklayın.G/Ç sekmesinde, oluşturulan yarım haritaları ve maskeyi girin ve kalibre edilmiş piksel boyutunu 1.045 angstrom olarak ayarlayın. Ardından, B-faktörünü otomatik olarak tahmin etmek için netleştir sekmesinde evet girin. Otomatik B sığdırma için en düşük çözünürlük için 10 girin.Ve kendi B faktörünüzü kullanmak için, giriş no. Son olarak, filtre sekmesinde, FSC ağırlığını atla'yı hayır olarak ayarlayın ve işi çalıştırın. Parlatma eğitimi için, Bayes parlatma işlemini açın.Ve G/Ç sekmesinde, hareket düzeltilmiş mikrografları, parçacıkları ve PostProcess'i girin. daha önce elde edilen yıldız dosyası. Eğitim sekmesine tıklayın ve train optimal parametrelerini evet, test için Fourier piksellerinin fraksiyonunu 0,5 olarak ayarlayın ve bu kadar parçacığı 5.000'e kullanın.Ardından işi çalıştırın. Eğitim işi bittiğinde, Bayes parlatma üzerine tıklayın. Ardından eğitim sekmesinde, train optimal parametrelerini hayır olarak ayarlayın.Lehçe sekmesini seçin ve optimize edilmiş parametre dosyasında opt_params_all_groups yolunu belirtin. txt dosyasını önceki adımdan alıp çalıştır'a tıklayın. Daha yüksek dereceli sapmaları tahmin etmek için, CTF iyileştirmesini açın.Parçacıkların altındaki G/Ç sekmesinde, son rafine edilmiş 3B işinden cilalı parçacıklar içeren yıldız dosyasının yolunu seçin. Ardından, işlem sonrası STAR dosyası altında, en son işlem sonrası işin çıktısının yolunu ayarlayın. Ardından, sığdır sekmesini seçin ve tahmini anizotropik büyütmeyi hayır olarak ayarlayın.Hayır'a CTF parametresi uydurma işlemini gerçekleştirin. Beamtilt'i evet olarak tahmin edin. Ayrıca trefoil'i evet olarak tahmin edin.Ve dördüncü dereceden sapmaları evet olarak tahmin edin. Ardından işi çalıştırın. RELION-3 haritasını daha da hassaslaştırmak ve doğrulamak için Scipion 3'ü başlatın ve yeni bir proje oluşturun.Sol protokoller panelinde, içe aktarmalar açılır menüsünü seçin ve parçacıkları içe aktar'a tıklayın. İçe aktarma parametrelerini RELION-3'e ve yıldız dosyasını postprocess.star olarak değiştirin. Ardından, daha önce gösterildiği gibi edinme parametrelerini belirtin ve yürüt'e tıklayın.Ardından, içe aktarmalar açılır menüsüne tıklayın ve içe aktarma birimlerini seçin. İçe aktarma altında, RELION-3 haritasının yolunu verin, piksel boyutu örnekleme hızını piksel başına 1,045 angstrom olarak değiştirin ve yürütün. Genel bir hizalama gerçekleştirmek için, protokoller panelinden hassaslaştır açılır menüsünü seçin ve xmipp3-highres'a tıklayın.Önceki adımlardan içe aktarılan parçacıkları ve hacimleri sırasıyla tam boyutlu görüntüler ve başlangıç hacimleri olarak girin ve simetri grubunu ikosahedral olarak ayarlayın. Ardından, açısal atama altındaki görüntü hizalama sekmesinde, genel'i seçin, maksimum hedef çözünürlüğü üç angstroma ayarlayın ve işi çalıştırın. Yerel hizalama gerçekleştirmek için xmipp3-highres global'i seçin, önceki çalıştırmadan devam'ı evet olarak değiştirin ve önceki işi seçin.Ardından açısal atama sekmesinde, görüntü hizalamasını yerel olarak değiştirin ve maksimum hedef çözünürlüğü 2,1 angstrom olarak ayarlayın. İşlemi tamamladıktan sonra, xmipp3-highres sonuçlar penceresinde, FSC'nin iyileştirmeden sonra nasıl değiştiğini görmek için ekran çözünürlüğü grafiklerine tıklayın ve Euler açı atamalarının değişip değişmediğini görmek için açısal değişikliklerle grafik histogramına tıklayın. UCSF Chimera'daki hacmi inceleyin.Yakınlaştırın ve yüksek çözünürlüklü özellikleri arayın. CTF uyumu iyi olan ve düşük astigmatizması olan mikrograflar daha ileri işlemler için seçilirken, yüksek astigmatizma ve kaybedilmesi olanlar atıldı. İyi tanımlanmış sınıfları içeren 2B sınıf ortalamaları seçildi ve düşük çözünürlük, gürültü ve kısmi parçacıklara sahip olanlar reddedildi.Kriyo-elektron mikroskopi haritasının adeno ile ilişkili bir virüsün atomik koordinatlarıyla donatılmış bölgeleri burada gösterilmiştir. İyi tanımlanmış EM yoğunlukları, bireysel amino asitlerin, su moleküllerinin ve magnezyum iyonlarının yan zincirlerinin takılmasına izin verir. CryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion kullanılarak hesaplanan FSC eğrileri, iş akışı genelinde çözünürlüğün arttığını, yapılar aracılığıyla dört farklı dilimde çözünürlük tahminleri ve çözünürlük histogramları, iş akışı boyunca haritalar arasındaki yerel çözünürlükteki artımlı iyileşmeyi gösterir.CryoSPARC, RELION-3, Scipion ve Phoenix'in kriyo-EM işleme algoritmalarını birleştirmek, adeno ile ilişkili virüs yapılarının işleme boru hattı boyunca 2.9'dan 2.3 angstromun çözünürlüğünün artmasına neden oldu. Her adımda belirtilen parametrelerin numuneye ve mikroskopa bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Ek olarak, yüksek çözünürlüğe ulaşma yeteneği büyük ölçüde numunenin ve ham verilerin kalitesine bağlıdır.Bu videoda, çeşitli yazılım platformlarında kriyo-EM verilerinin işlenmesi için sağlam SP iş akışını sunuyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, kriyo yapılarını hassaslaştırmak ve doğrulamak için birden fazla program için algoritmalar uygulanabilir. Bu iş akışı, çok çeşitli makromoleküler montajların yapı hesaplamalarına uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...