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August 10th, 2022
DOI :
August 10th, 2022
•0:04
Introduction
1:24
Formation of Naive PSC Aggregates
4:57
Blastoid Development
5:49
Formation of Blastoids in 96-well Ultra-low Attachment Microplates
7:05
Formation of Trophospheres
8:05
Results: Blastoid and Trophospheres Derived from Aggregates of Naïve hPSC
11:20
Conclusion
Transcript
मानव भ्रूण पर अनुसंधान उनकी कम उपलब्धता और नैतिक चिंताओं से सीमित है, इस प्रकार व्यक्तिगत मॉडल प्राप्त करना जो ईमानदारी से प्रारंभिक मानव विकास को दोहराते हैं, वैज्ञानिक और चिकित्सा प्रगति का समर्थन करेंगे। मानव विकास की भविष्यवाणी करने के लिए इस तकनीक की क्षमता विकास अनुक्रम और गति के अनुसार, ब्लास्टोसिस्ट सेलुलर दृढ़ संकल्प और मॉर्फोजेनेसिस के अनुक्रमों को प्रभावी ढंग से पुन: पेश करने की अपनी क्षमता पर निर्भर करती है, और इस तरह के मॉडलिंग कोशिकाओं के गठन को सुनिश्चित करेगी जो वास्तव में ब्लास्टोसिस्ट चरण को दर्शाती हैं। भविष्य में, मानव ब्लास्टोइड्स का उपयोग चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और पूर्व-नैदानिक मॉडलिंग में योगदान करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, इन विट्रो निषेचन माध्यम में सुधार करने के लिए, या गैर-हार्मोनल गर्भ निरोधकों को विकसित करने के लिए।
प्रक्रिया का प्रदर्शन हारुनोबू कागावा, आलोक जावली, हीदर हेदरी खोई, थेरेसा मारिया सोमर और जियोवानी सेस्टिनी होंगे। पीएक्सजीएल मीडिया, एन 2 बी 27 बेसल मीडिया, वाशिंग बफर, पीबीएस और एकत्रीकरण मीडिया को शुरू करने, तैयार करने और प्रीवार्म करने के लिए। ब्लास्टोइड बनाने के लिए एचपीएससी निलंबन से एमईएफ को बाहर निकालें।
एमईएफ बहिष्करण के लिए, छह अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में 0.1% जिलेटिन के एक मिलीलीटर को जोड़कर एक जिलेटिन लेपित प्लेट तैयार करें। 30 से 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते हैं। कोशिकाओं को काटने के लिए, माध्यम को हटा दें, और पीबीएस के एक मिलीमीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल टुकड़ी समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एकल कोशिकाओं में कालोनियों के पृथक्करण का पालन करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें। धोने बफर के एक मिलीलीटर के साथ सेल टुकड़ी समाधान पतला।
धीरे से पांच से 10 बार पाइपिंग द्वारा प्लेट से कोशिकाओं को ले लीजिए। सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। चार मिनट के लिए 200 आरसीएफ पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें।
सतह पर तैरनेवाला निकालें, और प्रत्येक अच्छी तरह से पीएक्सजीएल माध्यम के 1.5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एमईएफ बहिष्करण के लिए जिलेटिन लेपित प्लेटों पर कोशिकाओं को बीज दें, और प्लेटों को 60 से 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक बार जब भोली कोशिकाओं को एमईएफ बहिष्करण के लिए वरीयता दी जाती है, तो माइक्रोवेल्स से पीबीएस को हटा दें और प्रत्येक माइक्रोवेल चिप के लिए बेसल एन 2 बी 27 माध्यम के 200 माइक्रोलीटर के साथ कुओं को संतुलित करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
असंबद्ध भोले कोशिकाओं युक्त सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए। इसे 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और चार मिनट के लिए 200 आरसीएफ पर कोशिकाओं को स्पिन करें। मीडिया को त्यागें, और एन 2 बी 27 बेसल मीडिया के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
सेल गिनती स्लाइड्स का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। चार मिनट के लिए 200 आरसीएफ पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें। माध्यम को त्यागें, और 50 माइक्रोलीटर प्रति 30,000 कोशिकाओं के सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए 10 माइक्रोमोलर वाई 27632 युक्त एन 2 बी 27 मीडिया की उचित मात्रा जोड़ें।
संतुलित माइक्रोवेल सरणियों से माध्यम निकालें, और 10 माइक्रोमोलर वाई 27632 के साथ एन 2 बी 27 मीडिया के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें। सेल निलंबन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कोशिकाओं को माइक्रोवेल के तल में गिरने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। फिर एन 2 बी 27 माध्यम के 125 माइक्रोलीटर जोड़ें, 10 माइक्रोमोलर वाई 27632 के साथ पूरक।
24 घंटों के भीतर, माइक्रोवेल चिप पर भोले एचपीएससी के समुच्चय देखे जाएंगे। पाली माध्यम तैयार करके ब्लास्टोइड गठन शुरू करें। इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म करें।
एकत्रीकरण माध्यम को हटा दें, और माइक्रोवेल्स में प्रीवार्म्ड पाली माध्यम के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। सेल संस्कृति प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर में वापस रखें। पहले दिन मीडिया परिवर्तन दोहराएं।
दूसरे दिन, पाली माध्यम को हटा दें, और एन 2 बी 27 माध्यम के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, एलपीए और 10 माइक्रोमोलर वाई 27632 के साथ पूरक। तीसरे दिन मीडिया परिवर्तन दोहराएं। पूर्ण ब्लास्टोइड गठन चार दिन तक होता है।
पहले वर्णित के रूप में ब्लास्टोइड गठन के लिए भोले एचपीएससी सेल निलंबन तैयार करें। माध्यम को त्यागें, और माध्यम के प्रति 100 माइक्रोलीटर 70 कोशिकाओं के सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए 10 माइक्रोमोलर वाई 27632 युक्त एन 2 बी 27 मीडिया की उचित मात्रा जोड़ें। कुओं के तल पर क्लस्टर कोशिकाओं के लिए, कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए 200 आरसीएफ पर प्लेट को अपकेंद्रित्र करें।
हाइपोक्सिक संस्कृति की स्थिति के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं। 24 घंटों के भीतर, कुओं पर भोले एचपीएससी के समुच्चय देखे जाएंगे। कुओं में ताजा तैयार और प्रीवार्म्ड दो बार पाली माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
सेल संस्कृति प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर में वापस रखें। 24 घंटों के बाद, मीडिया के आधे हिस्से को त्याग दें, और इसे प्रीवार्म्ड पाली माध्यम के 100 माइक्रोलीटर के साथ बदलें। चरण को चौथे दिन तक दोहराएं।
पहले वर्णित के रूप में क्षोभमंडल गठन के लिए भोले एचपीएससी सेल निलंबन तैयार करें। एक बार जब भोले एचपीएससी के समुच्चय 24 घंटों के बाद बन जाते हैं, तो एलआईएफ के बिना पीएएलवाई के साथ एकत्रीकरण माध्यम का आदान-प्रदान करते हैं, जो प्रारंभिक ट्रॉफेक्टोडर्म का प्रतिनिधित्व करने वाले ट्रोफोस्फीयर बनाने के लिए तीन माइक्रोमोलर एससी 144 के साथ पूरक होते हैं। परिपक्व ट्रॉफेक्टोडर्म का प्रतिनिधित्व करने वाले ट्रोफोस्फीयर बनाने के लिए, पीएएलवाई के साथ एकत्रीकरण माध्यम का आदान-प्रदान करें, जो दो माइक्रोमोलर एक्सएमयूएमपी 1 के साथ पूरक है।
माध्यम को रोजाना ताज़ा करें। पूर्ण ट्रोफोस्फीयर गठन चार दिन तक होता है। सेल राज्यों का मूल्यांकन करने के लिए, पोस्ट इम्प्लांटेशन जैसी मानव ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओं सहित उपयुक्त नियंत्रणों के साथ ब्लास्टोइड और ट्रोफोस्फीयर से ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा की तुलना करें।
पीएक्सजीएल में सुसंस्कृत भोले एचपीएससी एकत्रित और गुहाकृत संरचनाएं थीं जो पाली प्रेरण के बाद 48 से 72 घंटे के बीच उभरीं, और 96 घंटों के भीतर 150 से 250 माइक्रोमीटर के व्यास तक पहुंच गईं। मॉर्फोमेट्रिक मापदंडों और तीन वंशों की उपस्थिति के आधार पर, प्रेरण दक्षता 70 से 80% तक पहुंच गई, प्रेरण के 96 घंटों के भीतर 50 से 60% दक्षता पर ट्रोफोस्फीयर का गठन किया गया था। अनुकूलित प्रेरण स्थितियों के तहत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अल्ट्रा लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेटों में ब्लास्टोइड गठन सफल रहा।
एकल सेल आरएनए अनुक्रमण तकनीक का उपयोग ब्लास्टोइड सेल राज्य को आगे बढ़ाने के लिए किया गया था। कोशिकाएं क्लस्टरिंग और डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन को करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों की परवाह किए बिना स्पष्ट रूप से अलग-अलग क्लस्टरिंग प्रोफाइल प्रदर्शित करती हैं, जिसने आत्मविश्वास से तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों को अलग करने की अनुमति दी। 24 और 60 घंटों के बीच, पीएक्सजीएल प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं एपिब्लास्ट और ट्रॉफेक्टोडर्म के एनालॉग बनाती हैं।
फिर 60 और 96 घंटे के बीच, ध्रुवीय ट्रॉफेक्टोडर्म के एनालॉग, और आदिम एंडोडर्म के गठन होते हैं। यह ब्लास्टोसिस्ट के भीतर विनिर्देश का अनुक्रम है, इस प्रकार ब्लास्टोइड वंश विनिर्देश के विकास ता्मक अनुक्रम को दोहराते हैं। विकास के विभिन्न चरणों में भ्रूण से अलग कोशिकाओं के संदर्भ डेटासेट के साथ ब्लास्टोइड डेटासेट के विलय से पता चला है कि ब्लास्टोइड्स से 97% कोशिकाएं ब्लास्टोसिस्ट कोशिकाओं के साथ क्लस्टर होती हैं, लेकिन पोस्ट इम्प्लांटेशन भ्रूण से कोशिकाओं के साथ नहीं।
स्वतंत्र विश्लेषण ने पुष्टि की कि समय के साथ, स्टेम कोशिकाओं ने कोशिकाओं का गठन किया जो पांच और 7.5 दिन के बीच मानव भ्रूण की कोशिकाओं के साथ ट्रांसक्रिप्शनल रूप से मेल खाते थे। यह वास्तव में विकास ता्मक चरण है जिसके दौरान मानव ब्लास्टोसिस्ट बनता है। उन्होंने यह भी पुष्टि की कि ब्लास्टोइड्स के भीतर 95% से अधिक कोशिकाओं में एक ट्रांसक्रिप्टोम होता है जो ब्लास्टोसिस्ट के तीन सेल वंशों से मेल खाता है, जबकि 3% कोशिकाएं लक्ष्य से दूर थीं, और पोस्ट इम्प्लांटेशन चरणों के साथ मेल खाती थीं।
ध्यान दें, हमने देखा कि हमारी प्रारंभिक 2 डी संस्कृतियों में लक्ष्य कोशिकाओं का लगभग 5% भी शामिल है। समतुल्य विकास ता्मक चरण को विशिष्ट मार्करों के अभिव्यक्ति पैटर्न को देखकर भी कल्पना की जा सकती है जैसे कि ब्लास्टोसिस्ट ट्रॉफेक्टोडर्म के लिए सीडीएक्स 2, और ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट के लिए पीआरएमडी 14। प्रारंभिक पीएक्सजीएल संस्कृति की गुणवत्ता बिल्कुल महत्वपूर्ण है, और प्रारंभिक कुल के भीतर कोशिकाओं की संख्या भी महत्वपूर्ण है, और इसे माइक्रोवेल्स का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है।
24 घंटे के बाद सेलुलर कुल का समग्र आकार लगभग 50 से 70 माइक्रोमीटर होना चाहिए। चरण पूर्ण ब्लास्टोइड्स का कुशल गठन मानव भ्रूण के आरोपण और आरोपण के बाद के विकास की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने का मार्ग प्रशस्त कर रहा है।
मानव ब्लास्टोइड्स के गठन को रेखांकित करने वाला एक प्रोटोकॉल जो कुशलतापूर्वक, समय पर और क्रमिक रूप से ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करता है।
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