Name: topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من خلال جائزة CAREER من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم إلى SH تحت رقم الجائزة 2047572. نشكر داميان ريفيرا على مساعدته في تربية ذبابة الفاكهة وإعدادها لفحص التطبيق الموضعي ، والدكتور غانيتسكي في جامعة ويسكونسن ماديسون على مشاركة سلالة ذبابة الفاكهة كانتون إس ، ومراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها لمشاركة سلالة روكفلر ، ومركز وزارة الزراعة الأمريكية للحشرات الطبية الزراعية والبيطرية لتقاسم سلالة أيزولين IICC. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

البعوض مسؤول عن أكثر من 700،000 حالة وفاة كل عام بسبب الأمراض التي ينقلها إلى البشر ، مع أكثر من نصف هذه الوفيات بسبب الملاريا وحدها1. والطريقة الوقائية الرئيسية ضد انتقال الملاريا وغيرها من الأمراض المنقولة بالنواقل هي استخدام المبيدات الحشرية، وغالبا ما تكون في شكل ناموسيات مبيدات حشرية طويلة الأمد أو رش داخلي متبقي2. ومع ذلك ، فإن مقاومة المبيدات الحشرية منتشرة على نطاق واسع بين البعوض وناقلات الحشرات الأخرى ، وكذلك الآفات الزراعية 3,4. ولإدارة المقاومة بفعالية، تكتسي المراقبة أهمية رئيسية5. لهذا ، هناك حاجة إلى طرق دقيقة للغاية وعالية الإنتاجية للكشف عن المقاومة. وفي الوقت الحالي، فإن أدوات مراقبة مقاومة المبيدات الحشرية الأكثر انتشارا بالنسبة للبعوض هي اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية6 والفحص الحيوي لزجاجة مركز السيطرة على الأمراض7. بالنسبة لذباب الفاكهة ، فإن طريقة تطبيق الاتصال المتبقي (على غرار الفحص الحيوي لزجاجة CDC) هي مقايسة بيولوجية شائعة الاستخدام للمبيدات الحشرية 8,9,10. ومع ذلك، فإن التباين في البيانات من هذه الطرق عادة ما يكون مرتفعا، حيث تتراوح قياسات نفس سلالة البعوض المختبري بين 20-70٪ تقريبا في اختبارات زجاجات CDC و 0-50٪ في اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية عند التعرض لجرعات دون قاتلة11. هذا التباين مثير للدهشة لأن التباين الجيني المحدود في معظم سلالات المختبرات من المتوقع أن يؤدي إلى تباين محدود في قابلية المبيدات الحشرية بين السكان. ومع ذلك ، لا يزال هناك مستوى عال من التباين الذي لوحظ في نتائج الفحص البيولوجي.
ويمكن أن تكون المصادر المحتملة لهذا التباين نتيجة للتعرض غير المتجانس للمبيدات الحشرية بين العينات داخل المقايسة الحيوية بسبب التعرض غير المباشر للمبيدات الحشرية عبر السطح، والآثار البيئية غير المتجانسة، والتباين البيولوجي الطبيعي بين الأفراد من نفس النمط الوراثي، والتباين في كتلة العينات من نفس السكان12 . طريقة نادرة الاستخدام مع قابلية تكرار أعلى هي المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي. في هذا الفحص ، يتم تطبيق المبيد الحشري مباشرة على كل حشرة13,14 ، مما يزيل عامل التعرض غير المتجانس للعينات المختلفة داخل نفس المقايسة. ومع ذلك ، نظرا لطبيعة الإنتاجية البطيئة لهذه الطريقة ، لا يتم استخدامها بشكل روتيني كأداة لمراقبة قابلية المبيدات الحشرية لمجموعات البعوض. تقدم هذه الورقة بروتوكولا معدلا للفحص الحيوي للتطبيق الموضعي الذي يسمح بالتعرض لإنتاجية أعلى مع تصحيح التباين في كتلة الحشرات ، وهي معلمة ترتبط بالتغيرات في قابلية المبيدات الحشرية12. ومن شأن الحد من الضوضاء والتباين المرتبط بالكتلة في بيانات الوفيات الناجمة عن التعرض المتغير للمبيدات الحشرية أن يسمح بمراقبة المقاومة التقنية بدقة أكبر11,15. ويمكن استخدام هذه البيانات لربط مقاومة النمط الظاهري بدقة أكبر بالعلامات الجينية و/أو معلمات اللياقة البدنية و/أو كفاءة النواقل. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن بسهولة تكييف هذا الفحص مع أنواع الحشرات الأخرى باستخدام الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي على ذباب الفاكهة ، وهو نوع من الحشرات أصغر حجما.
القيد الرئيسي لتطبيقات الاتصال المتبقية المذكورة أعلاه هو أن التعرض للمبيدات الحشرية قد يختلف من عينة إلى أخرى ضمن نفس الفحص. في حالة المقايسات الحيوية لزجاجة CDC وطريقة الاتصال ، قد يختلف التعرض للمبيدات الحشرية بين النسخ المتماثلة لنفس المقايسة. تتعرض الحشرات لمبيد حشري يتم توزيعه إما داخل زجاجة زجاجية (الفحص الحيوي لزجاجة CDC وطريقة الاتصال) أو على الأوراق المشربة (اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية). تركيز المبيدات الحشرية على كلا السطحين (الزجاج والورق) معروف ومحدد مسبقا من خلال فحص أنواع مختلفة من الأنماط الوراثية المعروفة. ومع ذلك ، فإن الكمية المتاحة لاحتمال امتصاصها من قبل الحشرة يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على السطح المستخدم ، ومكونات خليط المبيدات الحشرية ، وكيفية توزيع المبيد الحشري بشكل متجانس عبر المواد السطحية16,17. في الفحص الحيوي لزجاجة CDC ، يعتمد طلاء المبيدات الحشرية الموجود داخل الزجاجة على الإجراءات المستخدمة من قبل كل مختبر ومستخدم. في اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية ، يتم إنتاج الأوراق المعالجة بالمبيدات الحشرية مركزيا وبالتالي من المرجح أن تكون متجانسة تماما عبر المختبرات. ومع ذلك، في اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية، يسمح أنبوب التعرض للعينات بالهبوط والاستناد على شبكة معدنية غير معرضة للمبيدات الحشرية، مما يؤدي إلى احتمال التعرض للمبيدات الحشرية غير المتجانسة بين العينات داخل كل اختبار. ولا تزال الكمية الفعلية من المبيدات الحشرية التي تلتقطها العينات وتمتصها عبر كل طريقة بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف18.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقايسة الحيوية لزجاجة CDC ، واختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية ، وطريقة الاتصال هي الأكثر شيوعا كاختبارات عتبة تختبر تركيزا واحدا فقط من المبيدات الحشرية المحددة مسبقا. يمكن لهذا النهج أن يكتشف بدقة وجود المقاومة وهو ذو قيمة لمراقبة المقاومة (خاصة عندما تنتشر المقاومة). ومع ذلك، لا يمكن لاختبارات العتبة تحديد قوة المقاومة، والتي قد تكون أكثر تنبؤا بفعالية أدوات التدخل. إذا تم استخدام تركيزات مبيدات حشرية متعددة مع هذه الطرق ، فيمكن استخدامها كاختبارات كثافة. تم إدخال اختبارات الشدة للفحص الحيوي لزجاجة CDC واختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية عن طريق اختبار 5x و 10x الجرعات التمييزية المحددة مسبقا لمعالجة هذه الفجوة في الترصد 6,19. في حين توفر قدرة أكبر على التمييز بين المجموعات السكانية المقاومة ، فإن 3-5 جرعات (محددة مسبقا) توفر دقة محدودة لحساب التركيزات المميتة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام البعوض من مختلف الأحجام في مثل هذه المقاييس. ومع ذلك ، من المهم قياس الكتلة لأن العينات الأكبر قد تحتاج إلى جرعة أعلى ليتم قتلها لأن الجرعة الفعالة لكل وحدة من الكتلة ستكون أقل بكثير من جرعة الكائن الحي الأصغر12. إن حساب جرعة قاتلة نسبية الكتلة (كمية المبيد الحشري لكل كتلة حشرة) سيكون مقياسا أكثر فائدة من التركيز المميت الأكثر شيوعا (على سبيل المثال ، كمية المبيد الحشري لكل مساحة سطحية) لأنه يأخذ في الاعتبار تباين كتلة الحشرات بين الجنسين والسكان والأنماط الوراثية. ومن شأن هذه البيانات أن تساعد على سد الفجوة بين مقاومة النمط الوراثي والنمط الظاهري داخل المختبر والميدان، ويمكن أن توفر أيضا طريقة سهلة لحساب تركيز التطبيق اللازم لعلاج مجموعة من الحشرات ذات الكتلة المتوسطة المعروفة.
استخدام جرعات قاتلة نسبية جماعية تقتل 50٪ من العينات (LD50) يتضمن أيضا العديد من الفوائد الأخرى. تقييم سمية مركب معين في مغ / كغ (= نانوغرام / ملغم) هو المعيار في علم السموم البشري والبيطري14 ، وتوجد قيم LD50 في صحائف بيانات سلامة المواد. تسمح الجرعات القاتلة أيضا بإجراء مقارنة مباشرة للسمية بين المواد الكيميائية المختلفة تجاه نوع معين أو نفس المادة الكيميائية تجاه الأنواع المختلفة20 ، بالإضافة إلى تقييم عالي الجودة للمبيدات الحشرية والمواد الكيميائية الجديدة13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوفر LD50 نسب مقاومة أكثر وضوحا ودقة من تلك المستمدة من نتائج وفيات الجرعة التشخيصية ، مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مستوى المقاومة الموجود في السكان. لذلك ، سيكون هذا الفحص مناسبا لبرامج المراقبة الروتينية من خلال توفير مراقبة مقاومة أكثر صرامة استنادا إلى جرعات قاتلة نسبية جماعية مشتقة من عينات أكثر مما هو موصى به للمقايسات الحيوية الأخرى21.
وقد استخدمت طريقة التطبيق الموضعية في ترصد قابلية البعوض والذباب لقابلية البعوض والذباب للمبيدات الحشرية كبديل للمقايسات البيولوجية القياسية لقابلية المبيدات الحشرية عندما تكون المقاومة معروفة بالفعل أو مشتبه فيها 22,23، وكذلك للترصد في بعض حشرات الآفات 24 لتقييم ملامح المقاومة والسمية الجوهرية للمبيدات الحشرية بدقة أكبر 21 . في الفحوصات الحيوية للتطبيق الموضعي ، يتم تطبيق المبيد الحشري على كل كائن حي ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من الاختلاف في التعرض للمبيدات الحشرية. تقدم هذه الورقة طريقة مكيفة ومحسنة قليلا تسمح بتطبيق التعرض للمبيدات الحشرية على عدد كبير من الحشرات في فترة قصيرة مع التحكم أيضا في كتلة الحشرات22. ويمكن أن تكون هذه الطريقة ذات الإنتاجية العالية مع مستويات جيدة من التكرار أداة إضافية مفيدة للترصد الروتيني لقابلية المبيدات الحشرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

وقد أدى استمرار استخدام المبيدات الحشرية للصحة العامة والزراعة إلى انتشار مقاومة المبيدات الحشرية وإعاقة أساليب المكافحة. عادة ما يتم ترصد مقاومة المبيدات الحشرية لمجموعات البعوض من خلال المقايسات الحيوية لزجاجات مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) أو اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية (WHO). ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه الطرق إلى درجة عالية من التباين في بيانات الوفيات بسبب الاتصال المتغير للمبيدات الحشرية بالحشرة ، والأعداد الصغيرة نسبيا من الكائنات الحية التي تم اختبارها ، والتباين الواسع النطاق في الكتلة بين السكان ، والظروف البيئية المتغيرة باستمرار ، مما يؤدي إلى نتائج متغيرة. تقدم هذه الورقة المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي ، والتي تم تكييفها كاختبار حيوي ظاهري عالي الإنتاجية لكل من البعوض وذباب الفاكهة ، لاختبار أعداد كبيرة من الحشرات على طول مجموعة من تركيزات المبيدات الحشرية.
يضمن هذا الفحص 1) العلاج المتسق واتصال المبيدات الحشرية مع كل كائن حي ، 2) ينتج منحنيات استجابة جرعة محددة للغاية تمثل الاختلافات في متوسط الكتلة بين السلالات والجنسين (وهو أمر مهم بشكل خاص للكائنات الحية التي تم جمعها ميدانيا) ، و 3) يسمح بحساب متوسط الجرعات المميتة الصارمة إحصائيا (LD50 )، وهي ضرورية لمقارنات نسبة المقاومة - نهج ترصد بديل من وفيات الجرعات التشخيصية، والذي يستخدم أيضا في ترصد مقاومة مبيدات اليرقات. سيكون هذا الفحص أداة تكميلية للتنميط الظاهري الدقيق لمجموعات البعوض ، وكما هو موضح باستخدام ذباب الفاكهة ، يمكن تكييفه بسهولة للاستخدام مع الحشرات الأخرى. نحن نجادل بأن هذا الفحص سيساعد في سد الفجوة بين مقاومة المبيدات الحشرية الجينية والمظهرية في أنواع الحشرات المتعددة.

تتميز هذه النتائج التمثيلية بسلالتين مختلفتين من Ae. aegypti و Rockefeller (ROCK) وسلالة ميدانية معزولة من فلوريدا مع طفرات مقاومة الضربة القاضية المعروفة F1534C و V1016I (النمط الجيني IICC). بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض ذبابة الفاكهة melanogaster (كانتون: سلالة S).
يوضح الشكل 2 والشكل 3 استجابة الجرعة لكل كائن حي حسب السلالة والجنس الذي تم اختباره وفقا للبروتوكول أعلاه. وبما أنه لم يلاحظ أي فروق بين منحنيات الاستجابة للجرعة لدى ذكور وإناث البعوض داخل كل سلالة (t = 1.70، p = 0.098 ل ROCK و t = 0.64، p = 0.527 ل IICC)، تم تجميع البيانات من كلا الجنسين داخل كل سلالة من سلالات البعوض. ويبلغ LD 50 النسبي الشامل ل ROCKوIICC 0.008 نانوغرام/ملغ (مجال الموثوقية 95٪: 0-0.104) و 0.336 نانوغرام/ملغ (مجال الموثوقية 95٪: 0.235-0.438)، على التوالي. لا تتداخل CIs 95٪ من هذه القيم ، مما يشير إلى استجابات جرعات مختلفة بشكل كبير من السلالات. RR من سلالة IICC (بالنسبة لسلالة ROCK) هو 41.7 ، والتي وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، تعتبر مقاومة للغاية5. بالنسبة لذباب فاكهة كانتون-S ، فإن LD50 النسبي للكتلة هو 0.213 نانوغرام / ملغ (مجال الموثوقية 95٪: 0-0.490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> الشكل 2: البيانات التمثيلية للبعوض باستخدام المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي. بيانات الاستجابة للجرعة التمثيلية من الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي باتباع البروتوكول المذكور أعلاه باستخدام الدلتامثرين والبعوض: (أ) سلالات الإناث Ae. aegypti ROCK (n = 880) و IICC (n = 550) ، (B) الذكور Ae. aegypti ROCK (n = 880) و IICC (n = 569). وتراوحت تركيزات اختبار الدلتامثرين بين 0.00075 نانوغرام/ميكرولتر و9.68705 نانوغرام/ميكرولتر، وتنعكس جرعة الدلتامثرين المطبقة (ng) لكل متوسط كتلة البعوض (ملغ) على المحور x. يظهر معدل الوفيات كنسبة على المحور y. يمثل الخط الأسود من خلال كل مجموعة نقطة بيانات الإجهاد والانحدار الخطي الخاص بالجنس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> الشكل 3: البيانات التمثيلية لذباب الفاكهة باستخدام المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي. بيانات الاستجابة للجرعة التمثيلية من الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي باتباع البروتوكول المذكور أعلاه باستخدام الدلتامثرين وذباب الفاكهة: سلالة D. melanogaster Canton-S (n = 1014). تراوحت تركيزات اختبار الدلتامثرين من 0.00499 إلى 5.02876 نانوغرام/ميكرولتر، وتنعكس جرعة الدلتامثرين المطبقة (ng) لكل متوسط كتلة ذبابة الفاكهة (ملغ) على المحور x. يظهر معدل الوفيات كنسبة على المحور y. يمثل الخط الأسود الانحدار الخطي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي S1: خيمة مناولة الحشرات على الطاولة. يتم استخدام خيمة مناولة الحشرات على الطاولة لتسهيل التقاط البعوض أو الذباب الهارب أثناء فحص التطبيق الموضعي. الهيكل مغلق في A ومفتوح في B. تم بناء هذا الهيكل باستخدام أنابيب PVC ونسيج شبكي ناعم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي S2: وحدة قضيب المحاقن والمكررات. وحدة قضيب المحاقن والمكرر المستخدمة لجرعات الحشرات. تشمل الأجزاء الرئيسية 1) إبرة ، 2) برميل حقنة ، 3) مكبس ، 4) مكرر ، و 5) زر مكرر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 1: البرنامج النصي للتوزيع العشوائي: برنامج نصي عشوائي لإنشاء تسميات غير متحيزة لجميع أكواب كل تجربة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: ورقة درجة الوفيات: ورقة درجة الوفيات للمساعدة في تقييم الوفيات. تتضمن الورقة أيضا أماكن لتسجيل جميع المعلومات المهمة الأخرى لتسجيلها ، كما هو مشار إليه في البروتوكول ، مثل أوقات بدء وانتهاء تطبيق المبيدات الحشرية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 3: أمثلة على بيانات الوفيات: مثال على ملف البيانات المستخدم لإنشاء الشكل 2. أوصاف عنوان العمود هي كما يلي: "id" = رمز تعريف لكل نقطة بيانات. "الأنواع" = اسم النوع (على سبيل المثال، الزاعجة المصرية)؛ "مبيد حشري" = اسم المبيد الحشري المطبق موضعيا (على سبيل المثال، الدلتاميثرين)؛ "سلالة" = اسم سلالة البعوض (على سبيل المثال ، ROCK) ؛ "التاريخ" = تاريخ بدء التطبيق الموضعي ؛ "الجنس" = جنس البعوض. "العمر" = عمر البعوض (الشباب = 3-5 أيام ؛ العمر = 4 أسابيع) ؛ "total.mosq" = العدد الإجمالي للبعوض الذي تم وزنه دفعة واحدة ؛ "الوزن" = الوزن (ملغ) لجميع البعوض داخل دفعة ؛ "التركيز" = تركيز المبيدات الحشرية (ميكروغرام/مل)؛ "حقنة" = حجم القطيرات (مل) من حقنة ؛ "الجرعة" = كمية العنصر النشط للمبيدات الحشرية المطبقة على كل بعوضة (نانوغرام) ؛ "المجموع" = عدد البعوض في كل كوب ؛ "ميت" = عدد البعوض الميت في كل كوب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
ملف تكميلي 4: رمز تحليل R: مثال على التعليمات البرمجية R التي يمكن استخدامها لإكمال تحليل Probit (كما هو موضح في الخطوة 8 من البروتوكول). يمكن استخدام النتائج التمثيلية (التي يمكن الوصول إليها عبر ملف بيانات المثال التكميلي) مع رمز R هذا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

نحن نصف منهجية وأهمية الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لقياس قابلية المبيدات الحشرية في البعوض وذباب الفاكهة. الفحص المقدم عالي الإنتاجية ، ويستخدم كتلة الحشرات - مما يسمح بحساب جرعة قاتلة نسبية الكتلة بدلا من التركيز - ومن المحتمل أن يكون له تباين أقل من الطرق المماثلة الأخرى.

الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لتحديد سمية المبيدات الحشرية للبعوض وذباب الفاكهة

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

من خلال تطبيق المبيدات الحشرية مباشرة على الحشرة بدلا من التلامس السطحي ، هناك اختلاف ضئيل في التعرض للمبيدات الحشرية ، وهذا يسمح لنا بقياس ملف تعريف قابلية مجموعات البعوض بشكل أكثر دقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بحساب الجرعات القاتلة النسبية للكتلة من مبيد حشري بدلا من التركيزات القاتلة ، مما يحسن بشكل كبير من مقارنات نسبة المقاومة. كن حريصا على تخزين المبيدات الحشرية بشكل صحيح ، وتجنب تلويث أدواتك ، وتأكد من أن أجزاء المحاقن في حالة جيدة.سيساعدك هذا على الحصول على نتائج متسقة. للبدء ، قم بإزالة محاليل المبيدات الحشرية اللازمة من الثلاجة. قم بتدوير المحلول على الفور أو عكسه خمس مرات ، وضعه في حاوية مقاومة للضوء في درجة حرارة الغرفة للسماح للمبيدات الحشرية بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.حدد خمسة أنابيب لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة مع 0.5 ملليلتر من الأسيتون لكل منها. املأ برميل المحقنة بالكامل بالأسيتون من الأنبوب الأول. ثم اطرد الأسيتون إلى حاوية نفايات عن طريق الضغط بسرعة على المكبس ، وكرر أربع مرات أخرى لإكمال ما مجموعه خمس غسلات أسيتون من نفس أليكوت الأسيتون.ثم املأ برميل المحقنة بالكامل بالهواء ، واطرد الهواء وبقايا الأسيتون المحتملة في حاوية النفايات. كرر مرتين أخريين لإكمال ثلاث غسلات بالهواء. قم بإنشاء جيب هوائي داخل البرميل بين مكبس المحقنة والجزء العلوي من الإبرة عن طريق سحب المكبس حوالي خمسة ملليمترات داخل البرميل.قم بتسمية أكواب الحيازة البلاستيكية بمعرف عشوائي لتقييم وفيات المكفوفين. باستخدام شفاط مدعوم بالشفط من الاستنشاق ، استنشق العدد المطلوب من البعوض البالغ من العمر ثلاثة إلى خمسة أيام. ضع طرف الشاحن في الأنبوب مع القطن الملفوف حول الطرف.الزفير بلطف ، واضغط على الشافط لنقل البعوض إلى أنبوب مخروطي. استخدم القطن لتوصيل الأنبوب عند إزالة طرف الشافطة، ثم قم بتغطيته بالغطاء. قم بإسقاط البعوض لفترة وجيزة في الأنابيب عن طريق وضعها لمدة لا تقل عن 10 دقائق عند أربع درجات مئوية أو دفنها تحت الجليد في صينية ثلج.نقل البعوض المحطم إلى خيمة مناولة الحشرات. قم بقلب البعوض بعناية على صينية بلاستيكية موضوعة على الجليد ، وصب حوالي 50 بعوضة في المرة الواحدة لضمان لمس كل منها للصينية الباردة تحتها وبقائها محطمة. فرز البعوض حسب الجنس عن طريق التقاطه بلطف من الساقين أو الأجنحة باستخدام الملقط ، يليه وضع كل جنس في كوب عقد منفصل ، والتوقف عند الوصول إلى الرقم المطلوب.أثناء الفرز ، قم بإزالة أي بعوض مصاب أو كبير أو صغير جدا. لتسجيل وزن كوب البعوض ، ضع كوبا فارغا مع طبق بتري كغطاء على الميزان ، وقم بتقطيع الميزان. صب البعوض في الحاوية ، ووضع الغطاء في الأعلى.ضع الحاوية على الميزان ، وسجل الوزن النهائي ، إلى جانب عدد البعوض. ضع كوب العينات على الفور مرة أخرى على الجليد لإبقائها مشلولة حتى يتم وزن جميع أكواب العينة. قسم البعوض المحضر إلى خمسة إلى 10 أكواب منفصلة موضوعة على الجليد ، مع وضع ملصقات عليها هويات عشوائية.استخدم ملاقط ومنضدة محمولة لتحقيق 20 إلى 25 بعوضة لكل كوب. لفرز ذباب الفاكهة ، قم بتخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون لمدة سبع ثوان. صب الذباب على كيس ثلج ملفوف بورق مقعد.باستخدام فرشاة طلاء ذات رؤوس دقيقة ، افصل وعد الذكور والإناث. استخدم فرشاة الطلاء لالتقاط الذباب المختار بلطف ، ووضعه في زجاجة مرق نظيفة وفارغة. بعد اختيار عدد متساو من ذباب الفاكهة من الذكور والإناث ، قم بتسمية زجاجات المخزون باسم السلالة وإجمالي ذبابة الفاكهة.تخدير زجاجة ذباب الفاكهة باستخدام ثاني أكسيد الكربون لمدة سبع ثوان. صب ذباب الفاكهة على ورق الوزن ، واستخدم الورق كقمع لإدخال الذباب في قارورة مشوهة تحمل علامة هوية عشوائية.بعد وضع غطاء طبق بتري فوق قارورة ذباب الفاكهة ، ضعه على الميزان. سجل الوزن المشترك وعدد العينات على ورقة النتيجة.ضع قارورة ذباب الفاكهة على الفور في صينية من الثلج مع بقاء الغطاء في الأعلى لمنع الذباب من الهروب. قم بتحميل المحقنة بتركيز المبيدات الحشرية المناسب ، بدءا من الجرعة الأقل تركيزا والعمل نحو الجرعة الأكثر تركيزا مع كل مجموعة من الكائنات الحية. ضع العينات على ورق الوزن الموضوع فوق صينية على الجليد.افصل العينات القريبة من بعضها البعض باستخدام فرشاة طلاء نظيفة خالية من المبيدات الحشرية أو قطعة قطن للسماح بسهولة الوصول إلى كل عينة للحصول على الجرعات. باستخدام المحقنة ، ضع قطرة واحدة من محلول المبيدات الحشرية على منطقة الصدر والبطن البطنية للبعوض والظهرية لذباب الفاكهة. صب العينات على الفور مرة أخرى في الكوب البلاستيكي الموسوم.قم بتغطية الكوب بالمعاوضة وشريط مطاطي. لاحظ وجود عينة محدثة على الكأس في حالة قتل أي عينات أو تلفها أو هروبها في هذه العملية. ضع الكوب المكتمل في صينية تعليق.بالنسبة للكوب الأول ، سجل الوقت الذي تكتمل فيه الجرعات. كرر الجرعات لكل كوب حتى يتم إعطاء جميع العينات بتركيزات المبيدات الحشرية المناسبة ، وسجل وقت الانتهاء عندما تم إعطاء جميع العينات. توفير محلول السكروز بنسبة 10٪ لكل كوب عن طريق كرة قطنية مبللة ، وتخزين البعوض وذباب الفاكهة في درجة الحرارة والرطوبة المطلوبة.تسجيل وفيات العينات في 24 ساعة بعد بدء التعرض للمبيدات الحشرية. تصنيف البعوض على أنه على قيد الحياة إذا كان بإمكانه الطيران وحمل نفسه في وضع مستقيم وميت إذا كان غير متحرك أو ترنح ، كما هو موضح من قبل منظمة الصحة العالمية. اتبع نفس تقييم الوفيات لذباب الفاكهة.بعد إجراء الفحص الحيوي ، تم الحصول على بيانات استجابة الجرعة التي تضم سلالتين هما النمط الجيني لروكفلر و IICC للذكور والإناث الزاعجة المصرية. كان متوسط الجرعة القاتلة النسبية الجماعية لروكفلر و IICC 0.008 و 0.336 نانوغرام لكل ملليغرام ، على التوالي. وكشفت النتائج عن عدم وجود اختلافات بين منحنيات استجابة الجرعة للإناث والذكور من البعوض داخل كل سلالة.لذلك ، تم الجمع بين البيانات من كلا الجنسين لحساب متوسط قيم الجرعة المميتة. وبما أن فترات الثقة البالغة 95٪ لمتوسط الجرعة القاتلة لهاتين السلالتين لم تتداخل ، فقد اعتبرت هذه القيم مختلفة بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، عند حساب نسب المقاومة ، كانت سلالة IICC أكثر مقاومة بأكثر من 40 مرة من سلالة روكفلر الحساسة.كما تم الحصول على بيانات الاستجابة للجرعة لذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ، سلالة كانتون-S ، ووجد أن متوسط الجرعة القاتلة النسبية للكتلة هو 0.213 نانوغرام لكل ملليغرام. الاتساق أمر بالغ الأهمية ، خاصة عند تخزين المبيد الحشري وتطبيقه وتقييم الوفيات. أيضا ، توخي الحذر عند التعامل مع العينة لتجنب الضرر أو الموت الذي لا يسببه المبيد الحشري.باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا الآن تحديد المقاومة التقنية لمجموعات البعوض بدقة وكيف تؤثر الظروف البيئية على المقاومة أو كيف تتنبأ المقاومة التقنية بالمقاومة العملية.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

دراسة العدوان في ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

اختبارات بيولوجية على مقاومة المبيدات الحشرية الرصد

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

بروتوكول الأمثل لتربية Fopius arisanus ، وهو الطفيل من الفاكهة Tephritid الذباب

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

تقنيات للحث وتحديد الخلوي الشيخوخة

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

مختبر تربية الذباب مستقرة وأخرى ديبتيرا موسكويد

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

بروتوكولات لاختبار السمية لرواية كيمياء مبيدات الحشرات للبعوض

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

الآنف الفرق المحتملة التحديد الكمي للنقل عبر الظهارية أيون في الفئران

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...