Name: topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
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这项研究得到了美国国家科学基金会授予SH的CAREER奖的支持，奖项编号为2047572。我们感谢Damien Rivera在果蝇饲养和局部应用测定准备方面的帮助，威斯康星大学麦迪逊分校的Ganetzky博士分享了他的Canton-S果蝇菌株，疾病控制和预防中心分享了洛克菲勒菌株，美国农业部医学农业和兽医昆虫学中心分享了IICC同种线菌株。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。

作者声明没有利益冲突。

本文提出了一种适用于蚊子和果蝇局部应用测定的方案。该程序可以很容易地适应在野外和其他生物体中使用，因为它需要最少的专用设备。下面讨论了该协议的关键步骤，潜在的修改，故障排除建议，方法的局限性以及此方法的重要性。
协议中的关键步骤： 方案中有三个关键步骤，如果完成不正确，可能会对生物测定的结果产生巨大影响：杀虫剂浓度准确性，标本敲低和死亡率评估。
杀虫剂浓度精度： 拥有准确的杀虫剂解决方案以获得可复制的剂量 - 反应曲线和有意义的结果非常重要。杀虫剂溶液制备的体积法在CDC瓶生物测定7和局部应用13，14，43的文献中更为常见。然而，这里描述的重量法本质上是更准确的，因为通过包含（温度特异性）密度来考虑温度，从而导致更准确的配方制备。
标本敲低： 敲低标本是这种方法的关键组成部分，可以精确地施用杀虫剂和重量测量。然而，击倒生物体不可避免地包含物理压力和损伤的风险，如前所述30。因此，在敲低试样时要小心谨慎，以确保i）每个试样被敲低的时间相似，ii）敲低的长度保持在最低限度，iii）敲低方法在所有试样上保持一致。此外，建议在施用杀虫剂之前单独测试敲低方法，以确保该方法成功并且不会诱发大于10%的控制死亡率。对于没有经验的用户，初始测试可能需要更长的时间，从而导致更长的击倒时间。因此，在解释第一次测定的结果时要小心。
死亡率评估： 评估死亡率可能具有挑战性，特别是当杀虫剂不会完全杀死，而只会击倒或致残蚊子或苍蝇时。因此，在开始之前，重要的是要了解杀虫剂如何影响目标生物体，并对“死亡”（或击倒）生物体有明确的定义。此外，建议让同一人评估剂量和重复之间的死亡率，以减少变异。
协议修改： 下面描述的几种修改可以应用于该协议，以提高其多功能性和可访问性。
使测定适用于较小或较大尺寸的昆虫： 当使用较小或较大的标本时，建议分别施用较小或较大剂量体积的杀虫剂。例如，我们将0.5μL剂量减少到0.2μL剂量，从而将蚊子方案应用于果蝇。确保为所选剂量选择正确的注射器尺寸。
使测定适应野外昆虫： 当使用田间昆虫时，昆虫的大小可能会有更大的变化。因此，建议将昆虫分成较小的组（例如，每杯）称重，而不是作为一个大组（例如，用于一个实验的所有昆虫）。这可以帮助捕获与田间昆虫质量差异相关的杀虫剂易感性的潜在变化。
设备改造： 昆虫处理帐篷：标本的加样可以在昆虫处理帐篷下完成，该帐篷仅用PVC管和蚊帐建造。这可以替代封闭的房间（例如，昆虫），并有助于消除可能发生昆虫饲养的区域的潜在杀虫剂污染。这种昆虫处理帐篷易于建造且成本低廉（约70美元）。或者，可以购买一个昆虫处理笼（约425美元）。
冷却台：冰袋或冰盘可用于击倒标本和/或保持标本被击倒。
培养箱：建议使用培养箱饲养标本，并在杀虫剂处理后将标本保持24小时。如果没有孵化器，可以建造它。建造培养箱所需的设备包括绝缘容器，加湿器，加热电缆，湿度和温度控制器以及灯，其总成本应为约170美元，遵循并扩展了以前的方法44。
保温杯：虽然塑料杯用于分拣和保温处理过的标本，但蜡衬里纸杯或玻璃容器将是合适的替代品。
生物体和生命阶段修饰： 这种方法非常适用于其他载体，昆虫和/或节肢动物，如 Culex quinquefasciatus 蚊子32，家蝇32和蟑螂45，以及非成虫生命阶段，如蚊子幼虫46。
局部应用位置修改： 这种方法描述了将杀虫剂应用于蚊子的腹侧胸部和腹部区域（以及果蝇的背部）。但是，只要暴露部位一致，就可以使用其他应用位置。一致性很重要，因为杀虫剂的敏感性可以根据施用地点32而变化。
故障排除建议： 此方法有几个最初具有挑战性的步骤。下面描述的是一些可能遇到的最常见问题。
泄漏/蒸发杀虫剂溶液： 杀虫剂通常溶解在丙酮中，丙酮是一种高挥发性的化合物。这意味着丙酮在室温下迅速蒸发，随着时间的推移增加杀虫剂的浓度。如果杀虫剂溶液似乎泄漏或蒸发，请重新制作溶液，确保管的盖子紧紧地打开，并仔细检查是否正确遵循了存储协议（例如，正在使用parafilm，并且管子是直立存储的）。如果泄漏持续存在，请尝试用较低的体积填充管子，以便为丙酮在不同温度下经历的体积变化留出更多空间。此外，如果使用丙酮作为溶剂，请确保管子的额定丙酮储存（例如，FEP，TFE和PFA塑料）。如果使用疏水性杀虫剂，请将溶液储存在玻璃瓶中（因为疏水性杀虫剂对玻璃的粘附力小于塑料）。在储存之前标记溶液的半月板以监测蒸发也是一种很好的做法。
称量生物体时微量天平上的重量漂移： 如果秤上的重量读数漂移（缓慢上升或下降），这可能是由于静电。漂移最常发生在称量塑料物品中的生物体时，因为塑料很容易保持静电荷。为了避免这种情况，可以将称重纸放在正在称重的塑料容器下方，也可以使用玻璃等非塑料容器。
异常死亡率结果： 死亡率结果可能看起来异常，例如在对照组中观察到高死亡率，或者在所有杀虫剂剂量中观察到高/低死亡率。查看以下案例以对每个方案进行故障排除。
高控制死亡率 如果对照组的死亡率很高（10%或更高），请评估敲低方法和敲低标本的时间长度。如果可能，缩短试样被击倒的时间长度。对照中高死亡率需要考虑的其他潜在因素包括i）检查培养箱设置是否正确 - 异常的温度和/或湿度可能导致死亡率增加。应使用独立的数据记录仪检查温度和湿度。ii） 评估昆虫处理情况。过多或过于粗略地处理昆虫可能导致高死亡率。iii）检查用于治疗对照组的100%丙酮或仪器上是否有杀虫剂污染。更换丙酮，并用丙酮或乙醇清洁所有仪器。通过经常更换手套、防止溢出和清洁仪器来避免污染。请注意，在 补充文件3中，最多有两只蚊子在对照杯内死亡（仅丙酮）。这种死亡率水平被认为并不高（低于10%），因此，没有理由担心。
所有暴露组（但对照组除外）死亡率高 使用较低的杀虫剂浓度或较小的剂量进行测试。使用的剂量可能高于不会诱发死亡的最低剂量。使用几种10倍稀释液来确定正确的剂量范围，并排除污染。为避免污染，请开始以最低浓度加样，并努力达到最高浓度。此外，确保使用的所有设备都定期用丙酮和/或乙醇清洁，施加在试样上的剂量非常小，即使是最轻微的交叉污染也可能影响结果。
所有暴露群体的死亡率低 使用较高的杀虫剂浓度。使用的剂量可能都太低，无法导致人口死亡。为了确定正确的剂量范围，将标本暴露于几个10倍的浓缩剂量。确保杀虫剂溶液未过期或降解（可能是由于高温或光照）。如果解决方案已过期或被怀疑已降级，请重新制作解决方案并确保遵循适当的存储条件。
重复/天之间的死亡率不一致 昆虫暴露于杀虫剂的时间可能会影响所表达的抗药性水平，特别是对于代谢抗性34。在每天的同一时间窗口重复此方案，以避免一天中的时间作为导致死亡率变化的潜在变量。导致重复之间死亡率不一致的其他潜在因素包括i）实验之间差异饲养的标本。确保所有标本的年龄范围相同，在相同的温度和相似的密度和食物供应下饲养。ii）杀虫剂浓度随着时间的推移而降解或由于丙酮蒸发而变得更加浓缩。重新制定解决方案并确保适当的储存条件。iii） 死亡率评分不一致。确保同一个人对死亡率进行评分，或制定一个明确的方案，以便在整个团队中一致使用。使用盲评分来减少死亡率评分的偏差。
粘在分拣托盘表面的昆虫： 丙酮与该协议中使用的塑料发生反应，例如培养皿。如果在培养皿或类似的塑料表面上使用丙酮，试样可能会粘附在表面上。通过在分拣托盘上衬有称量纸或使用非塑料分拣托盘，可以避免这种粘连。此外，分拣托盘或保温杯中塑料表面的冷凝会导致昆虫粘附在冷凝物上，或者标本可能太冷并可能冻结到表面。调整敲低方法以减少冷凝，同时防止试样变得太冷/冷冻（例如，将称量纸放在试样和塑料分拣托盘之间）。
R 分析误差： 一旦收集了死亡率数据，分析过程中可能会发生各种并发症。R 代码无法完成数据文件操作的最常见原因是数据格式与代码不匹配（例如，列标题和/或空单元格）。如果出现更严重的并发症，请参阅 Rstudio35 中内置的 R 帮助页面。
上述局部应用方法的局限性： 通过局部施用方法吸收杀虫剂不会模仿自然暴露： 在原体上局部应用不是杀虫剂吸收的自然方式。在野外，昆虫大多通过腿部吸收杀虫剂，在它们与经杀虫剂处理的表面接触的时间长度上或在翅膀上通过小气溶胶颗粒47，48吸收杀虫剂，而不是在腹侧表面快速暴露。然而，直接应用已知杀虫剂剂量将准确地建立对杀虫剂的表型反应，这是遗传和进化研究或跨空间或时间比较杀虫剂易感性所必需的。因此，这种方法有利于测试技术耐药性，但不会直接测量实际耐药性（实际干预工具在现场设置中的功效15）。然而，重要的是要注意，目前的标准方法（例如，世卫组织试管试验和CDC瓶装生物测定）也无法捕获或模拟现场的气溶胶（即通过雾化）杀虫剂暴露。
局部应用测定只能评估接触吸收杀虫剂： 该方法适用于通过接触和吸收杀虫剂而起作用的杀虫剂，并且不用于口服杀虫剂，例如通常用于有吸引力的有毒糖饵中的硼酸49。
方法的意义： 局部应用方法通过计算致死剂量（非浓度）和测量技术（不实用）抗性15，扩展了已建立的杀虫剂生物测定标准。下面给出了该方法相对于现有杀虫剂敏感性测定的优缺点。
致死剂量计算： 该方法确定杀虫剂的致死剂量，而不是CDC和WHO生物测定用于确定判别剂量11的致死浓度。致死剂量更有意义，因为它是已知可诱发死亡率的定量杀虫剂。相比之下，致死浓度不考虑生物体实际获得的杀虫剂量。当使用致死剂量计算时，可以更准确地观察和量化性别或大小依赖性易感性特征之间的差异，使这种测量更加通用。
技术阻力： 该方法评估技术电阻，即在标准化，受控环境中测量的电阻。这种测量适用于监测杀虫剂耐药性的传播，并将表型耐药性与潜在标志物15联系起来。由于局部应用生物测定导致死亡率变化降低，因此可以更好地鉴定新的耐药标志物。然而，由于杀虫剂不自然地暴露于蚊子，该测定不适用于估计特定干预措施在特定人群中的疗效。需要其他测定来测量这种实际电阻15。
试样适应性： 这种方法可以在其他重要的节肢动物上实施，例如作物害虫（例如，科罗拉多马铃薯甲虫），家养害虫（例如蟑螂和臭虫）或传粉媒介（例如蜜蜂），只需简单地改变敲低方法和/或杀虫剂剂量，体积和/或浓度（如上所述）。适应性的易用性可以帮助类比不同研究领域的杀虫剂耐药性研究。使用LD50 值代替杀死50%标本的致命浓度（LC50）可以跨物种进行准确比较。
成本： 与CDC瓶装生物测定和WHO试管测试类似，运行局部应用测定的成本最低（见 材料表）。必不可少的设备是注射器（约70美元）和分配器（约100美元），可在分析过程中重复使用。
所需试样数量： 每个局部应用测定杯应使用至少20-25个标本。建议每个实验至少测试五种杀虫剂浓度，建议至少三次重复。总体而言，这导致完成测试至少需要300-375个标本，与使用WHO管测试或CDC瓶装生物测定进行耐药强度测试所需的标本数量相当。然而，如果局部应用生物测定法降低了变异性，则相同数量的标本可能会产生更大的统计能力来比较跨空间或时间的易感性数据。

蚊子每年因传播给人类的疾病而造成70多万人死亡，其中一半以上仅死于疟疾1。预防疟疾和其他病媒传播疾病传播的主要方法是使用杀虫剂，通常采用长效杀虫剂蚊帐或室内滞留喷洒的形式2.然而，杀虫剂耐药性在蚊子和其他昆虫媒介以及农业害虫中很普遍3，4。为了有效管理耐药性，监测至关重要5.为此，需要高精度和高通量的电阻检测方法。目前，最普遍的蚊子杀虫剂耐药性监测工具是世卫组织试管6 和CDC瓶装生物测定7。对于果蝇的残留接触应用方法（类似于CDC瓶生物测定法）是常用的杀虫剂生物测定法8，9，10。然而，这些方法的数据差异通常很大，对同一实验室蚊子菌株的测量值从CDC瓶装测定的死亡率约为20-70%，暴露于亚致死剂量时的世卫组织管试验的死亡率为0-50%不等11。这种变异令人惊讶，因为大多数实验室菌株中有限的遗传变异预计将导致种群中有限的杀虫剂易感性变异。然而，在生物测定结果中观察到的高度变异仍然存在。
这种变异的潜在来源可能是生物测定中标本之间由于通过表面间接接触杀虫剂、异质性环境效应、同一基因型个体之间的正常生物变异以及同一种群标本质量的变化而导致的异质性杀虫剂暴露12.一种不常用且具有较高可复制性的方法，即局部应用生物测定法。在该测定中，将杀虫剂直接施用于每个昆虫13，14，除去在同一测定中不同样品的异质暴露因子。然而，由于这种方法的通量慢，它不经常用作蚊子种群的杀虫剂易感性监测工具。本文提出了一种用于局部应用生物测定的改进方案，该方案允许更高的通量暴露，同时还校正昆虫质量的变化，该参数与杀虫剂易感性的变化相关12。减少可变杀虫剂暴露的死亡率数据的噪声和质量相关变化，将允许更准确的技术耐药性监测11，15。这些数据可用于更准确地将表型抗性与遗传标记、适应性参数和/或载体能力联系起来。此外，我们展示了如何通过在果蝇（一种较小的昆虫物种）上使用局部应用生物测定来轻松地将该测定法适应其他昆虫物种。
上述残留接触应用的主要局限性是，在同一测定中，杀虫剂暴露可能因标本而异。在CDC瓶生物测定和接触方法的情况下，同一测定的重复之间可能不同，杀虫剂暴露可能不同。昆虫暴露于分布在玻璃瓶内部（CDC瓶生物测定和接触方法）或浸渍纸（WHO管试验）上的杀虫剂。杀虫剂在两个表面（玻璃和纸张）上的浓度是已知的，并通过筛选不同种类的已知基因型来预先确定。然而，可被昆虫潜在吸收的量可以根据所使用的表面、杀虫剂混合物组分以及杀虫剂在表面材料16、17上的均匀分布而有很大差异。在CDC瓶子生物测定中，瓶子内部的杀虫剂涂层取决于每个实验室和用户采用的程序。在世卫组织的试管试验中，经杀虫剂处理的试纸是集中生产的，因此很可能在实验室之间非常均匀。然而，在世卫组织试管试验中，暴露管允许标本降落并停留在非杀虫剂暴露的金属网上，从而导致每次试验中标本之间潜在的异质性杀虫剂暴露。通过每种方法被标本拾取和吸收的杀虫剂的实际量仍需进一步探索18。
此外，CDC瓶装生物测定，WHO管测试和接触方法最常用作阈值测定，仅检测一种预定的杀虫剂浓度。这种方法可以准确检测耐药性的存在，对于耐药性监测（特别是当耐药性正在传播时）很有价值。然而，阈值测定不能量化耐药性的强度，这可能更能预测干预工具的功效。如果这些方法使用多种杀虫剂浓度，则可以将它们用作强度测定。CDC瓶装生物测定和WHO管测试的强度测定是通过测试预定剂量的5倍和10倍来引入的，以解决监测中的这一差距6，19。虽然提供更大的区分耐药人群的能力，但3-5（预定）剂量提供有限的分辨率来计算致死浓度。此外，各种大小的蚊子也用于此类测定。然而，质量的测量很重要，因为较大的标本可能需要更高的剂量才能被杀死，因为每单位质量的有效剂量将远低于较小生物体12的有效剂量。计算质量相对化致死剂量（每个昆虫质量的杀虫剂量）将是一个比更常见的致死浓度（例如，每个表面积的杀虫剂量）更有用的指标，因为它考虑了性别，种群和基因型之间的昆虫质量变化。这些数据将有助于填补实验室和现场内基因型和表型抗性之间的差距，并且还可以提供一种简单的方法来计算治疗已知平均质量的昆虫种群所需的应用浓度。
使用杀死50%标本（LD50）的质量相对化致死剂量也包含其他一些好处。以mg/kg（= ng/mg）为单位评估特定化合物的毒性是人类和兽医毒理学14的标准，LD50 值可在材料安全数据表上找到。致死剂量还允许直接比较不同化学品对特定物种或同一化学品对不同物种的毒性20，以及对新型杀虫剂和化学品的高质量评估13。此外，LD50 可以提供比诊断剂量死亡率结果更有意义和准确的耐药性比，这可能导致高估人群中存在的耐药水平。因此，该测定将适用于常规监测计划，方法是根据质量相对化致死剂量提供更严格的耐药性监测，这些剂量来自比其他生物测定推荐的更多标本21。
局部应用方法已用于蚊子和苍蝇的杀虫剂易感性监测，作为已知或怀疑耐药性时的标准杀虫剂易感性生物测定的替代方案22，23，以及用于对某些害虫昆虫的监测24 以更准确地评估耐药性和杀虫剂的内在毒性21.在局部应用生物测定中，将杀虫剂应用于每种生物体，导致杀虫剂暴露的变化最小。本文提出了一种稍微适应和改进的方法，该方法允许在短时间内将杀虫剂暴露应用于大量昆虫，同时还控制昆虫质量22。这种具有良好可复制性的高通量方法可以成为常规杀虫剂易感性监测的有用附加工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

继续将杀虫剂用于公共卫生和农业，导致杀虫剂普遍具有抗药性，并阻碍了控制方法。蚊子种群的杀虫剂耐药性监测通常通过疾病控制和预防中心（CDC）瓶生物测定或世界卫生组织（WHO）管测试来完成。然而，由于杀虫剂与昆虫的接触不同，测试的生物体数量相对较少，种群之间的质量差异很大，以及环境条件不断变化，这些方法可能导致死亡率数据的高度变化，从而导致结果可变。本文介绍了局部应用生物测定法，该测定法适用于蚊子和果蝇的高通量表型生物测定法，以测试沿一系列杀虫剂浓度的大量昆虫。
该测定1）确保与每个生物体的一致治疗和杀虫剂接触，2）产生高度特异性的剂量反应曲线，解释菌株和性别之间平均质量的差异（这对于现场收集的生物体尤其重要），3）允许计算统计学上严格的中位致死剂量（LD50），这对于耐药性比比较是必要的 - 诊断剂量死亡率的替代监测方法，也用于杀幼虫剂耐药性监测。该测定将成为准确表型蚊子种群的补充工具，并且如果蝇所示，易于适应与其他昆虫一起使用。我们认为，这种测定将有助于填补多种昆虫物种中基因型和表型杀虫剂抗性之间的差距。

这些代表性结果以埃及伊蚊（Rockefeller ）和佛罗里达州分离的野外菌株为特征，已知抗敲低突变F1534C和V1016I（IICC基因型）。此外， 还有黑腹果蝇 （Canton：S菌株）的特色。
图2 和 图3 说明了按照上述方案通过菌株和性别测试的每种生物体的剂量反应。由于在每个菌株中雄性和雌性蚊子的剂量反应曲线之间没有观察到差异（ROCK的t = 1.70，p = 0.098，IICC的 t = 0.64，p = 0.527），因此汇总了每个蚊子菌株中两性的数据。ROCK和IICC的质量相对化LD50 分别为0.008 ng / mg（95%CI：0-0.104）和0.336 ng / mg（95%CI：0.235-0.438）。这些值的95%CI不重叠，表明菌株的剂量反应显着不同。IICC菌株的RR（相对于ROCK菌株）为41.7，根据世界卫生组织的说法，被认为是高度耐药性的5。对于Canton-S果蝇，质量相对化LD50 为0.213 ng / mg（95%CI：0-0.490）。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> 图2：使用局部应用生物测定法的蚊子的代表性数据。根据上述方案使用倍他菊酯和蚊子进行局部应用生物测定的代表性剂量反应数据：（A）雌性埃及伊蚊ROCK（n = 880）和IICC（n = 550）菌株，（B）雄性埃及伊蚊ROCK（n = 880）和IICC（n = 569）菌株。溴氰菊酯检测浓度范围为0.00075 ng/μL至9.68705 ng/μL，每平均蚊子质量（mg）施用的溴氰菊酯剂量（mg）反映在x轴上。死亡率在 y 轴上显示为一个比例。穿过每个数据点聚类的黑线表示应变和性别特异性线性回归。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> 图3：使用局部应用生物测定法的果蝇代表性数据。 根据上述方案使用溴氰菊酯和果蝇进行局部应用生物测定的代表性剂量反应数据： D. melanogaster Canton-S菌株（n = 1014）。溴氰菊酯测试浓度范围为0.00499至5.02876 ng/μL，每平均果蝇质量（mg）施用的溴氰菊酯剂量（mg）反映在x轴上。死亡率在 y 轴上显示为一个比例。黑线表示线性回归。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
补充图S1：台式昆虫处理帐篷。 台式昆虫处理帐篷用于在局部应用测定期间更容易捕获逃跑的蚊子或苍蝇。结构在 A 中是闭合的，在 B中是开放的。该结构由PVC管和细网织物制成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图S2：注射器和中继器涂药器单元。 用于昆虫加药的注射器和中继器涂药器单元。主要部件包括1）针头，2）注射器筒，3）柱塞，4）中继器和5）中继器按钮。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 1：随机化脚本： 随机化脚本，用于为每个实验的所有杯子创建无偏倚标签。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 2：死亡率评分表： 死亡率评分表，以协助评估死亡率。Sheet还包括记录协议中引用的所有其他要记录的重要信息的位置，例如杀虫剂应用的开始和结束时间。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 3：死亡率数据示例： 用于创建 图 2 的示例数据文件。列标题说明如下：“id”=每个数据点的识别码;“物种”=物种名称（例如，埃及伊 蚊）;“杀虫剂”=局部施用杀虫剂的名称（例如，溴氰菊酯）;“菌株”=蚊子菌株的名称（例如，ROCK）;“日期”=开始日期局部应用;“性”=蚊子的性别;“年龄”=蚊子的年龄（年轻=3-5天大;老=4周大）;“total.mosq” = 分批称重的蚊子总数;“重量”=批次内所有蚊子的重量（毫克）;“浓度”=杀虫剂浓度（微克/毫升）;“注射器”=注射器的液滴体积（mL）;“剂量”=应用于每只蚊子的杀虫剂活性成分的量（ng）;“总数”=每个杯子里的蚊子数量;“死”=每个杯子里死去的蚊子数量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 4：R 分析代码： 可用于完成 Probit 分析的示例 R 代码（如协议的步骤 8 中所述）。代表性结果（可通过补充示例数据文件访问）可与此 R 代码一起使用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

我们描述了局部应用生物测定法在蚊子和果蝇中测量杀虫剂易感性的方法和重要性。所提出的测定是高通量的，利用昆虫质量 - 从而允许计算质量相对化致死剂量而不是浓度 - 并且可能具有比其他类似方法更低的变异性。

局部应用生物测定以量化蚊子和果蝇的杀虫剂毒性

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

通过直接在昆虫上施用杀虫剂而不是通过表面接触，杀虫剂暴露的变化很小，这使我们能够更准确地测量蚊子种群的易感性分布。这种技术的主要优点是它允许我们计算杀虫剂的质量相对化致死剂量而不是致死浓度，这大大提高了抗药率比较。小心正确存放杀虫剂，避免污染工具，并确保注射器部件处于良好状态。这将帮助您获得一致的结果。首先，从冰箱中取出所需的杀虫剂溶液。立即涡旋溶液或倒置五次，并将其置于室温下耐光容器中，让杀虫剂在使用前升温至室温。设置五个微量离心管，每个管含有0.5毫升丙酮。用第一管中的丙酮完全填充注射器桶。然后通过迅速向下推柱塞将丙酮排出到废容器中，并重复四次，以完成从同一丙酮等分试样中总共五次丙酮洗涤。然后，用空气完全填充注射器桶，并将空气和潜在的丙酮残留物排出到废物容器中。再重复两次，用空气完成三次洗涤。在注射器柱塞和针头顶部之间的枪管内创建一个气穴，方法是将柱塞向上拉约五毫米到枪管中。用随机ID标记塑料保温杯，以进行盲人死亡率评估。使用由吸入吸入驱动的吸气器，吸出所需数量的三到五天大的成年蚊子。将吸气器的尖端放入管中，尖端缠绕有棉花。轻轻呼气，然后点击吸气器将蚊子转移到锥形管中。当吸气器尖端被移除时，使用棉花堵塞管子，然后用盖子盖住。将蚊子在4摄氏度下放置至少10分钟或将它们埋在冰盘中的冰下，将其短暂地击倒管中。将被击倒的蚊子转移到昆虫处理帐篷。小心地将蚊子倒在放在冰上的塑料托盘上，一次倒入大约50只蚊子，以确保每只蚊子都接触到它下面的凉爽托盘并保持被击倒。按性别对蚊子进行分类，用镊子轻轻地用腿或翅膀捡起它们，然后将每个性别放入单独的抱杯中，并在达到所需数量时停止。分类时，清除任何受伤或超大或超小的蚊子。要记录蚊子杯的重量，请将一个带有培养皿的空杯子作为秤上的盖子，然后将秤去皮。将蚊子倒入容器中，并将盖子放在顶部。将容器放在秤上，记录最终重量以及蚊子的数量。立即将标本杯放回冰上，使其保持固定，直到称量标本的所有杯子。将准备好的蚊子分成5到10个单独的杯子，放在冰上，用随机ID标记。使用镊子和手持式计数器，每杯可灭蚊20至25只。要对果蝇进行分类，请使用二氧化碳麻醉果蝇七秒钟。将苍蝇倒在用长凳纸包裹的冰袋上。使用细尖的画笔，分离并计算男性和女性。使用画笔轻轻地捡起选择的苍蝇，并将它们放入干净的空汤瓶中。选择相同数量的雄性和雌性果蝇后，用菌株名称和果蝇总数标记库存瓶。用二氧化碳麻醉果蝇瓶七秒钟。将果蝇倒在称量纸上，并将纸用作漏斗，将果蝇引入标有随机ID的去皮小瓶中。将培养皿盖放在果蝇小瓶的顶部后，将其放在秤上。在评分表上记录标本的总重量和数量。立即将果蝇小瓶放入冰盘中，盖子仍然在上面，以防止果蝇逃跑。在注射器中装载适当的杀虫剂浓度，从浓度最小的剂量开始，然后与每组生物体一起朝着最集中的剂量努力。将标本倒在放在冰上托盘上的称量纸上。使用干净的无杀虫剂画笔或棉签分离靠近在一起的标本，以便于访问每个标本进行给药。使用注射器，将一滴杀虫剂溶液涂抹在蚊子的腹侧胸部和腹部区域以及果蝇的背部。立即将试样倒回贴有标签的塑料杯中。用网和橡皮筋盖住杯子。请注意，如果在此过程中有任何标本被杀死、损坏或逸出，则杯子上会记录更新的标本计数。将完成的杯子放入保温盘中。对于第一个杯子，记录配料完成的时间。对每个杯子重复加药，直到所有试样都用适当的杀虫剂浓度加药，并记录所有试样的给药结束时间。通过湿棉球为每杯提供10%蔗糖溶液，并将蚊子和果蝇储存在所需的温度和湿度下。记录杀虫剂暴露后 24 小时内的标本死亡率。如世界卫生组织所述，如果蚊子可以飞行并保持直立，如果它们不动或共济失调，则将其归类为活体。对果蝇进行相同的死亡率评估。进行生物测定后，获得剂量反应数据，其中两种菌株是洛克菲勒和IICC基因型的雄性和雌性埃及伊蚊。洛克菲勒和IICC的质量相对化中位致死剂量分别为每毫克0.008和0.336纳克。结果显示，每个品系中雌性和雄性蚊子的剂量反应曲线之间没有差异。因此，将来自两性的数据结合起来计算中位致死剂量值。由于这两种菌株的中位致死剂量的95%置信区间不重叠，因此这些值被认为显着不同。此外，在计算抗性比时，IICC菌株的耐药性是易感洛克菲勒菌株的40倍以上。还获得了果蝇，黑腹果蝇，Canton-S菌株的剂量反应数据，发现质量相对化的中位致死剂量为每毫克0.213纳克。一致性至关重要，特别是在储存和施用杀虫剂以及评估死亡率时。此外，在处理标本时要小心，以避免非杀虫剂引起的伤害或死亡。通过这种方法，我们现在可以准确地确定蚊子种群的技术抗性，以及环境条件如何影响抗性或技术耐药性如何预测实际耐药性。

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

学习在果蝇的侵略（果蝇）

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

科研

生物学

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

生物测定对杀虫剂的抗药性监测

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

一个优化的协议饲养 Fopius arisanus Tephritid果寄生蝇

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

果实角质层分离和生物物理研究

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

一种多检测试验为疟疾蚊子发射

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

技术诱导和量化细胞衰老

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

稳定蝇及其他 Muscoid 双翅目的实验室饲养

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

新型杀虫化学对蚊子毒性测试规程

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

鼻电位差量化小鼠跨上皮离子转运

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

强迫流涎法分析蚊虫的载体能力

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...