Name: topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door een CAREER award van de National Science Foundation aan SH onder awardnummer 2047572. We bedanken Damien Rivera voor zijn hulp bij het fokken van fruitvliegen en de voorbereiding op actuele toepassingstests, Dr. Ganetzky aan de Universiteit van Wisconsin-Madison voor het delen van zijn Canton-S fruitvliegenstam, de Centers for Disease Control and Prevention voor het delen van de Rockefeller-stam en het United States Department of Agriculture Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology voor het delen van de IICC-isolinestam. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Muggen zijn verantwoordelijk voor meer dan 700.000 sterfgevallen per jaar als gevolg van de ziekten die ze op mensen overbrengen, met meer dan de helft van die sterfgevallen als gevolg van malaria alleenal 1. De belangrijkste preventieve methode tegen overdracht van malaria en andere door vectoren overgedragen ziekten is het gebruik van insecticiden, vaak in de vorm van langdurige insecticidenetten of binnenshuis-restsproeien2. Insecticideresistentie is echter wijdverspreid onder muggen en andere insectenvectoren, evenals landbouwongedierte 3,4. Om de weerstand effectief te beheersen, is bewaking van cruciaal belang5. Hiervoor zijn zeer nauwkeurige detectiemethoden met hoge doorvoerweerstand nodig. Momenteel zijn de meest wijdverspreide insecticideresistentiebewakingstools voor muggen de WHO-buistest6 en de CDC-flesbioassay7. Voor fruitvliegen is de residuele contacttoepassingsmethode (vergelijkbaar met de CDC-flesbioassay) een veelgebruikte insecticide bioassay 8,9,10. De variabiliteit in gegevens van deze methoden is echter meestal hoog, met metingen van dezelfde laboratoriummumstam variërend van ~ 20-70% mortaliteit in CDC-flestests en 0-50% in WHO-buistests bij blootstelling aan subletale doseringen11. Een dergelijke variatie is verrassend omdat de beperkte genetische variatie in de meeste laboratoriumstammen naar verwachting zal leiden tot een beperkte variatie in de gevoeligheid voor insecticiden in de populatie. Niettemin is er nog steeds een hoge mate van variatie waargenomen in de bioassay-resultaten.
Potentiële bronnen van deze variatie kunnen het gevolg zijn van heterogene blootstelling aan insecticiden tussen monsters binnen de bioassay als gevolg van indirecte blootstelling aan insecticiden via het oppervlak, heterogene milieueffecten, normale biologische variatie tussen individuen van hetzelfde genotype en variatie in de massa van specimens van dezelfde populatie12 . Een zelden gebruikte methode met een hogere repliceerbaarheid is de topische toepassing bioassay. In deze test wordt het insecticide rechtstreeks toegepast op elk insect13,14, waardoor de factor van heterogene blootstelling van verschillende monsters binnen dezelfde test wordt verwijderd. Vanwege de trage doorvoer van deze methode wordt deze echter niet routinematig gebruikt als een insecticide gevoeligheidsbewakingsinstrument voor muggenpopulaties. Dit artikel presenteert een aangepast protocol voor de topische toepassingsbioassay dat blootstellingen met een hogere doorvoer mogelijk maakt en tegelijkertijd corrigeert voor variatie in insectenmassa, een parameter die correleert met veranderingen in de gevoeligheid voor insecticiden12. Een vermindering van lawaai en massa-geassocieerde variatie in sterftegegevens door variabele blootstelling aan insecticiden zou een nauwkeurigere technische weerstandsbewaking mogelijk maken11,15. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om fenotypische resistentie nauwkeuriger te associëren met genetische markers, fitnessparameters en / of vectorcompetentie. Daarnaast laten we zien hoe deze test gemakkelijk kan worden aangepast aan andere insectensoorten door gebruik te maken van de actuele toepassing bioassay op fruitvliegen, een kleinere insectensoort.
De belangrijkste beperking van de bovengenoemde restcontacttoepassingen is dat de blootstelling aan insecticiden binnen dezelfde test van monster tot monster kan variëren. In het geval van CDC-flesbioassays en de contactmethode kan de blootstelling aan insecticiden variëren tussen replicaties van dezelfde test. De insecten worden blootgesteld aan insecticide dat ofwel wordt gedistribueerd aan de binnenkant van een glazen fles (CDC-fles bioassay en contactmethode) of op geïmpregneerd papier (WHO-buistest). De concentratie van insecticide op beide oppervlakken (glas en papier) is bekend en vooraf bepaald door het screenen van verschillende soorten van bekende genotypen. De hoeveelheid die beschikbaar is om mogelijk door het insect te worden geabsorbeerd, kan echter sterk variëren, afhankelijk van het gebruikte oppervlak, de bestanddelen van het insecticidemengsel en hoe homogeen het insecticide over het oppervlaktemateriaal is verdeeld16,17. In de CDC-flesbioassay is de insecticidecoating aan de binnenkant van de fles afhankelijk van de procedures die door elk laboratorium en elke gebruiker worden gebruikt. In de WHO-buistest worden de met insecticide behandelde papieren centraal geproduceerd en dus hoogstwaarschijnlijk vrij homogeen in laboratoria. In de WHO-buistest stelt de blootstellingsbuis monsters echter in staat om te landen en te rusten op niet-insecticide-blootgesteld metaalgaas, wat leidt tot mogelijke heterogene blootstelling aan insecticiden tussen de monsters binnen elke test. De werkelijke hoeveelheid insecticide die via elke methode door monsters wordt opgepikt en geabsorbeerd, moet nog worden onderzocht18.
Bovendien worden de CDC-flesbioassay, WHO-buistest en contactmethode het meest gebruikt als drempeltests die slechts één vooraf bepaalde insecticideconcentratie testen. Deze aanpak kan de aanwezigheid van weerstand nauwkeurig detecteren en is waardevol voor weerstandsbewaking (vooral wanneer weerstand zich verspreidt). Drempeltests kunnen echter de sterkte van de weerstand niet kwantificeren, wat meer voorspellend zou kunnen zijn voor de effectiviteit van interventie-instrumenten. Als meerdere insecticideconcentraties worden gebruikt met deze methoden, kunnen ze worden gebruikt als intensiteitstests. Intensiteitstests voor de CDC-flesbioassay en de WHO-buistest zijn geïntroduceerd door 5x en 10x de vooraf bepaalde discriminerende doseringen te testen om deze kloof in surveillance aan te pakken 6,19. Hoewel ze meer mogelijkheden bieden om onderscheid te maken tussen resistente populaties, bieden 3-5 (vooraf bepaalde) doseringen een beperkte resolutie om dodelijke concentraties te berekenen. Bovendien worden muggen van verschillende groottes gebruikt in dergelijke testen. Toch is de massa belangrijk om te meten, omdat grotere exemplaren mogelijk een hogere dosis nodig hebben om te worden gedood, omdat de effectieve dosis per massa-eenheid veel lager zal zijn dan die van een kleiner organisme12. Het berekenen van een massagerelativeerde letale dosis (hoeveelheid insecticide per insectenmassa) zou een nuttiger metriek zijn dan de meer gebruikelijke dodelijke concentratie (bijv. Hoeveelheid insecticide per oppervlak) omdat het rekening houdt met de variatie van insectenmassa tussen geslachten, populaties en genotypen. Dergelijke gegevens zouden helpen de kloof tussen genotypische en fenotypische resistentie binnen het laboratorium en het veld te dichten en zouden ook een eenvoudige manier kunnen bieden om de benodigde toepassingsconcentratie te berekenen voor de behandeling van een populatie insecten met een bekende gemiddelde massa.
Het gebruik van massa-gerelativeerde dodelijke doseringen die 50% van de monsters doden (LD50) bevat ook verschillende andere voordelen. De beoordeling van de toxiciteit van een specifieke verbinding in mg/kg (= ng/mg) is standaard in de toxicologie voor mens en dier14 en LD50-waarden zijn te vinden op veiligheidsinformatiebladen. Dodelijke doseringen maken ook directe vergelijking van toxiciteit mogelijk tussen verschillende chemicaliën voor een bepaalde soort of dezelfde chemische stof voor verschillende soorten20, evenals hoogwaardige evaluatie van nieuwe insecticiden en chemicaliën13. Bovendien kan de LD50 zinvollere en nauwkeurigere resistentieverhoudingen bieden dan die afgeleid van diagnostische dosissterfteresultaten, wat kan resulteren in een overschatting van het resistentieniveau dat aanwezig is in een populatie. Daarom zou deze test geschikt zijn voor routinematige surveillanceprogramma's door strengere resistentiemonitoring te bieden op basis van massagerelativeerde letale doses afgeleid van meer monsters dan aanbevolen voor andere bioassays21.
De topische toepassingsmethode is gebruikt bij de bewaking van de gevoeligheid van insecticiden voor muggen en vliegen als alternatief voor de standaard insecticide gevoeligheidsbioassays wanneer resistentie al bekend is of wordt vermoed22,23, evenals voor bewaking bij sommige plaaginsecten24 om resistentieprofielen en intrinsieke toxiciteit van insecticiden nauwkeuriger te beoordelen21 . In topische toepassing bioassays, wordt het insecticide toegepast op elk organisme, wat resulteert in minimale variatie in blootstelling aan insecticiden. Dit artikel presenteert een licht aangepaste en verbeterde methode die het mogelijk maakt om blootstelling aan insecticiden toe te passen op een groot aantal insecten in een korte periode, terwijl ook wordt gecontroleerd op insectenmassa22. Deze methode met een hogere doorvoer en een goede repliceerbaarheid zou een nuttig aanvullend hulpmiddel kunnen zijn voor routinematige bewaking van de gevoeligheid voor insecticiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

Het voortdurende gebruik van insecticiden voor de volksgezondheid en de landbouw heeft geleid tot wijdverspreide resistentie tegen insecticiden en het belemmeren van bestrijdingsmethoden. Insecticideresistentiebewaking van muggenpopulaties wordt meestal gedaan via Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flesbioassays of buistests van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze methoden kunnen echter resulteren in een hoge mate van variabiliteit in sterftegegevens als gevolg van variabel insecticidecontact met het insect, het relatief kleine aantal geteste organismen, uitgebreide variatie in massa tussen populaties en voortdurend veranderende omgevingsomstandigheden, wat leidt tot variabele uitkomsten. Dit artikel presenteert de actuele toepassing bioassay, aangepast als een fenotypische bioassay met hoge doorvoer voor zowel muggen als fruitvliegen, om grote aantallen insecten te testen langs een reeks insecticideconcentraties.
Deze test 1) zorgt voor een consistente behandeling en insecticide contact met elk organisme, 2) produceert zeer specifieke dosis-responscurven die rekening houden met verschillen in gemiddelde massa tussen stammen en geslachten (wat met name belangrijk is voor in het veld verzamelde organismen), en 3) maakt de berekening van statistisch rigoureuze mediane letale doses mogelijk (LD50 ), die nodig zijn voor vergelijkingen van resistentieratio's - een alternatieve surveillancebenadering van diagnostische dosissterfte, die ook wordt gebruikt voor larvicideresistentiesurveillance. Deze test zal een aanvullend hulpmiddel zijn voor het nauwkeurig fenotyperen van muggenpopulaties en is, zoals geïllustreerd met behulp van fruitvliegen, gemakkelijk aan te passen voor gebruik met andere insecten. We beweren dat deze test zal helpen de kloof tussen genotypische en fenotypische insecticideresistentie bij meerdere insectensoorten te vullen.

Deze representatieve resultaten bevatten twee verschillende stammen van Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) en een geïsoleerde veldstam uit Florida met bekende knockdown-resistentiemutaties F1534C en V1016I (IICC-genotype). Daarnaast komt Drosophila melanogaster (Canton: S-stam) aan bod.
Figuur 2 en figuur 3 illustreren de dosisrespons van elk organisme per stam en geslacht getest volgens het bovenstaande protocol. Aangezien er geen verschillen werden waargenomen tussen de dosis-responscurven van mannelijke en vrouwelijke muggen binnen elke stam (t = 1,70, p = 0,098 voor ROCK en t = 0,64, p = 0,527 voor IICC), werden gegevens van beide geslachten binnen elke muggenstam samengevoegd. De massagerelativeerde LD50 voor ROCK en IICC zijn respectievelijk 0,008 ng/mg (95% BI: 0-0,104) en 0,336 ng/mg (95% BI: 0,235-0,438). De 95% CI's van deze waarden overlappen elkaar niet, wat wijst op significant verschillende dosisresponsen van de stammen. De RR van de IICC-stam (ten opzichte van de ROCK-stam) is 41,7, wat volgens de WHO als zeer resistent wordt beschouwd5. Voor de Canton-S fruitvliegen is de massa-gerelativeerde LD50 0,213 ng/mg (95% BI: 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve gegevens van muggen met behulp van topische toepassing bioassay. Representatieve dosis-responsgegevens van topische toepassingsbioassay volgens het bovenstaande protocol met deltamethrin en muggen: (A) vrouwelijke Ae. aegypti ROCK (n = 880) en IICC (n = 550) stammen, (B) mannelijke Ae. aegypti ROCK (n = 880) en IICC (n = 569) stammen. Deltamethrin-testconcentraties varieerden van 0,00075 ng / μL tot 9,68705 ng / μL, en de dosis toegepast deltamethrin (ng) per gemiddelde muggenmassa (mg) wordt weerspiegeld op de x-as. De sterfte wordt weergegeven als een verhouding op de y-as. De zwarte lijn door elk gegevenspuntcluster vertegenwoordigt de spanning en geslachtsspecifieke lineaire regressie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve gegevens van fruitvliegen met behulp van topische toepassing bioassay. Representatieve dosis-responsgegevens van topische toepassingsbioassay volgens het bovenstaande protocol met deltamethrin en fruitvliegen: D. melanogaster Canton-S-stam (n = 1014). De testconcentraties van deltamethrin varieerden van 0,00499 tot 5,02876 ng/μL, en de dosis toegepast deltamethrin (ng) per gemiddelde fruitvliegmassa (mg) wordt weerspiegeld op de x-as. De sterfte wordt weergegeven als een verhouding op de y-as. De zwarte lijn vertegenwoordigt de lineaire regressie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur S1: Benchtop insectenbehandelingstent. Benchtop insectenbehandelingstent wordt gebruikt voor het gemakkelijker vangen van ontsnappende muggen of vliegen tijdens de actuele toepassingstest. Structuur is gesloten in A en open in B. Deze structuur is gebouwd met PVC-buis en fijnmazige stof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur S2: Spuit en repeater applicator unit. Spuit en repeater applicator unit gebruikt voor het doseren van insecten. De belangrijkste onderdelen zijn 1) naald, 2) spuitvat, 3) zuiger, 4) repeater en 5) repeaterknop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Randomisatiescript: Randomisatiescript om niet-bevooroordeelde labels te maken voor alle kopjes van elk experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 2: Sterftescoreblad: Sterftescoreblad om de sterftebeoordeling te ondersteunen. Blad bevat ook plaatsen om alle andere belangrijke informatie vast te leggen, zoals vermeld in het protocol, zoals de begin- en eindtijden van de insecticidetoepassing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 3: Voorbeeld van sterftegegevens: Voorbeeldgegevensbestand dat is gebruikt om figuur 2 te maken. De beschrijvingen van de kolomkoppen zijn als volgt: "id" = identificatiecode van elk gegevenspunt; "soort" = soortnaam (bijv. Aedes aegypti); "insecticide" = naam van het insecticide dat topisch wordt aangebracht (bijv. Deltamethrin); "stam" = naam van de muggenstam (bijv. ROCK); "datum" = begindatum actuele toepassing; "seks" = geslacht van muggen; "leeftijd" = leeftijd van muggen (jong = 3-5 dagen oud; oud = 4 weken oud); "total.mosq" = totaal aantal muggen gewogen in batch; "gewicht" = gewicht (mg) van alle muggen binnen de partij; "concentratie" = concentratie van insecticide (μg/ml); "spuit" = druppelvolume (ml) van de spuit; "dosis" = hoeveelheid insecticide actief ingrediënt toegepast op elke mug (ng); "totaal" = aantal muggen in elke beker; "dood" = aantal dode muggen in elke beker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 4: R-analysecode: Voorbeeld R-code die kan worden gebruikt om de Probit-analyse te voltooien (zoals beschreven in stap 8 van het protocol). De representatieve resultaten (toegankelijk via het aanvullende voorbeeldgegevensbestand) kunnen met deze R-code worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

We beschrijven de methodologie en het belang van de actuele toepassing bioassay om de gevoeligheid voor insecticiden bij muggen en fruitvliegen te meten. De gepresenteerde test is high-throughput, maakt gebruik van insectenmassa - waardoor een massa-gerelativeerde letale dosis in plaats van concentratie kan worden berekend - en heeft waarschijnlijk een lagere variabiliteit dan andere vergelijkbare methoden.

Topische toepassing Bioassay om insecticide toxiciteit voor muggen en fruitvliegen te kwantificeren

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Door insecticide rechtstreeks op het insect aan te brengen in plaats van via oppervlaktecontact, is er minimale variatie in blootstelling aan insecticiden, en dit stelt ons in staat om het gevoeligheidsprofiel van muggenpopulaties nauwkeuriger te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om massa-gerelativeerde dodelijke doses van een insecticide te berekenen in plaats van dodelijke concentraties, wat de vergelijkingen van de resistentieverhouding aanzienlijk verbetert. Zorg ervoor dat u de insecticiden op de juiste manier bewaart, voorkom dat uw gereedschap wordt verontreinigd en zorg ervoor dat de onderdelen van de spuit in goede staat zijn.Dit zal u helpen om consistente resultaten te behalen. Verwijder om te beginnen de benodigde insecticide-oplossingen uit de vriezer. Draai de oplossing onmiddellijk of keer vijf keer om en plaats deze in een lichtbestendige container bij kamertemperatuur om de insecticiden vóór gebruik tot kamertemperatuur te laten opwarmen.Zet vijf microcentrifugebuizen uit met elk 0,5 milliliter aceton. Vul het vat van de spuit volledig met aceton uit de eerste buis. Verdrijft vervolgens de aceton in een afvalcontainer door snel op de zuiger te duwen en herhaal dit nog vier keer om in totaal vijf acetonwassingen van dezelfde aceton aliquot te voltooien.Vul vervolgens het vat van de spuit volledig met lucht en verdrijft de lucht en mogelijke acetonresten in de afvalcontainer. Herhaal dit nog twee keer om drie wasbeurten met lucht te voltooien. Maak een luchtvak in de loop tussen de zuiger van de spuit en de bovenkant van de naald door de zuiger ongeveer vijf millimeter in de loop omhoog te trekken.Label de plastic bekers met de willekeurige ID voor blinde sterftebeoordeling. Gebruik een aspirator aangedreven door zuigkracht van inademing, aspirateer het gewenste aantal drie tot vijf dagen oude volwassen muggen. Plaats de punt van de aspirator in de tube met katoen om de punt gewikkeld.Adem zachtjes uit en tik op de aspirator om de muggen in een conische buis over te brengen. Gebruik het katoen om de buis te sluiten wanneer de aspiratorpunt wordt verwijderd en deed vervolgens met het deksel. Sla de muggen kort in de buizen door ze minimaal 10 minuten bij vier graden Celsius te plaatsen of onder het ijs in een ijsbak te begraven.Breng de neergeslagen muggen over naar de insectenbehandelingstent. Gooi de muggen voorzichtig uit op een plastic bak die op het ijs is geplaatst en giet ongeveer 50 muggen tegelijk om ervoor te zorgen dat elk de koele bak eronder raakt en neergeslagen blijft. Sorteer de muggen op geslacht door ze voorzichtig op te pakken bij de benen of vleugels met een tang, gevolgd door elk geslacht in een aparte houdbeker te plaatsen en stop wanneer het gewenste aantal is bereikt.Verwijder tijdens het sorteren alle muggen die gewond zijn of extra groot of klein zijn. Om het gewicht van de muggenbeker te registreren, plaatst u een lege beker met een petrischaal als deksel op de weegschaal en tarra de weegschaal. Giet de muggen in de container en plaats het deksel erop.Plaats de container op de weegschaal en noteer het uiteindelijke gewicht, samen met het aantal muggen. Plaats de beker met exemplaren onmiddellijk terug op het ijs om ze geïmmobiliseerd te houden totdat alle kopjes van het exemplaar zijn gewogen. Verdeel de voorbereide muggen in vijf tot 10 afzonderlijke kopjes op ijs, gelabeld met willekeurige ID's.Gebruik een pincet en een handheld teller om 20 tot 25 muggen per kopje te bereiken. Om de fruitvliegjes te sorteren, verdooft u de vliegen met behulp van koolstofdioxide gedurende zeven seconden. Giet de vliegen op een ijspak gewikkeld in bankpapier.Met behulp van een verfkwast met fijne punt, scheid en tel de mannetjes en vrouwtjes. Gebruik de kwast om de gekozen vliegen voorzichtig op te pakken en plaats ze in een schone, lege voorraadfles. Nadat u een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke fruitvliegen hebt gekozen, labelt u de voorraadflessen met de soortnaam en het totaal van de fruitvlieg.Verdoof de fles fruitvliegjes met koolstofdioxide gedurende zeven seconden. Giet de fruitvliegjes op weegpapier en gebruik het papier als een trechter om de vliegen in een geteerde injectieflacon te brengen met een willekeurige ID.Nadat u het deksel van de petrischaal op de flacon met fruitvliegjes hebt geplaatst, plaatst u deze op de weegschaal. Noteer het gecombineerde gewicht en het aantal exemplaren op het scoreblad.Plaats de flacon met fruitvliegjes onmiddellijk in een bakje ijs met het deksel er nog bovenop om te voorkomen dat de vliegen ontsnappen. Laad de spuit met de juiste insecticideconcentratie, te beginnen met de minst geconcentreerde dosis en werk toe naar de meest geconcentreerde dosis met elke groep organismen. Tip de monsters op weegpapier dat bovenop een bakje op het ijs is geplaatst.Scheid de monsters die dicht bij elkaar staan met behulp van een schone insecticidevrije verfkwast of wattenstaafje om gemakkelijk toegang te krijgen tot elk monster voor dosering. Breng met behulp van de spuit één druppel insecticide-oplossing aan op de ventrale thorax en het buikgebied voor muggen en de dorsum voor fruitvliegen. Giet de monsters onmiddellijk terug in de gelabelde plastic beker.Bedek de beker met gaas en een elastiekje. Let op een bijgewerkte telling van het aantal exemplaren op de beker als er exemplaren zijn gedood, beschadigd of ontsnapt in dit proces. Plaats de voltooide beker in een opbergbakje.Noteer voor de eerste beker de tijd waarop de dosering is voltooid. Herhaal de dosering voor elke cup totdat alle monsters zijn gedoseerd met de juiste insecticideconcentraties en noteer de eindtijd wanneer alle monsters zijn gedoseerd. Geef 10% sucrose-oplossing aan elke beker via een nat watje en bewaar de muggen en fruitvliegjes op de gewenste temperatuur en vochtigheid.Recordsterfte van specimens 24 uur na het begin van blootstelling aan insecticiden. Classificeer muggen als levend als ze kunnen vliegen en houd zichzelf rechtop en dood als ze immobiel of ataxisch zijn, zoals beschreven door de WHO. Volg dezelfde sterftebeoordeling voor fruitvliegen.Na het uitvoeren van de bioassay werden dosisresponsgegevens verkregen met twee stammen die Rockefeller en IICC-genotype zijn voor de mannelijke en vrouwelijke Aedes aegypti. De massagerelativeerde mediane letale dosis voor Rockefeller en IICC was respectievelijk 0,008 en 0,336 nanogram per milligram. De resultaten toonden geen verschillen tussen de dosisresponscurves van vrouwelijke en mannelijke muggen binnen elke stam.Daarom werden gegevens van beide geslachten gecombineerd om de mediane letale dosiswaarden te berekenen. Aangezien de 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor de mediane letale dosis van deze twee stammen elkaar niet overlapten, werden deze waarden als significant verschillend beschouwd. Bovendien was de IICC-stam bij het berekenen van de resistente verhoudingen meer dan 40 keer resistenter dan de vatbare Rockefeller-stam.Dosisresponsgegevens voor fruitvlieg, Drosophila melanogaster, Canton-S-stam, werden ook verkregen en de massagerelativeerde mediane letale dosis bleek 0,213 nanogram per milligram te zijn. Consistentie is van cruciaal belang, vooral bij het opslaan en toepassen van het insecticide en het beoordelen van de mortaliteit. Wees ook voorzichtig bij het hanteren van het monster om schade of de dood te voorkomen die niet door het insecticide wordt veroorzaakt.Met deze methode kunnen we nu nauwkeurig de technische weerstand van een muggenpopulatie bepalen en hoe omgevingsomstandigheden de weerstand beïnvloeden of hoe technische weerstand praktische weerstand voorspelt.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studeren Agressie in Drosophila (fruitvliegjes)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Bioassays voor Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Een geoptimaliseerde protocol voor het kweken van Fopius arisanus, Een Parasitaire van Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Laboratorium fokken van stabiel vliegen en andere Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...