Name: topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
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Cette recherche a été soutenue par un prix CAREER de la National Science Foundation à SH sous le numéro de bourse 2047572. Nous remercions Damien Rivera pour son aide dans l’élevage de mouches des fruits et la préparation pour le test d’application topique, le Dr Ganetzky de l’Université du Wisconsin-Madison pour avoir partagé sa souche de mouche des fruits Canton-S, les Centers for Disease Control and Prevention pour le partage de la souche Rockefeller et le Centre d’entomologie médicale agricole et vétérinaire du Département de l’agriculture des États-Unis pour avoir partagé la souche d’isoligne IICC. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les moustiques sont responsables de plus de 700 000 décès chaque année dus aux maladies qu’ils transmettent à l’homme, dont plus de la moitié sont dus au paludismeseulement 1. La principale méthode préventive contre la transmission du paludisme et d’autres maladies à transmission vectorielle est l’utilisation d’insecticides, souvent sous la forme de moustiquaires imprégnées d’insecticide ou de pulvérisations à effet rémanent à l’intérieur2. Cependant, la résistance aux insecticides est répandue chez les moustiques et autres insectes vecteurs, ainsi que chez les ravageurs agricoles 3,4. Pour gérer efficacement la résistance, la surveillance est d’une importance capitale5. Pour cela, des méthodes de détection de résistance très précises et à haut débit sont nécessaires. Actuellement, les outils de surveillance de la résistance aux insecticides les plus répandus pour les moustiques sont le testen tube 6 de l’OMS et le test biologique7 en bouteille du CDC. Pour les mouches des fruits, la méthode d’application par contact résiduel (similaire à l’essai biologique en bouteille du CDC) est un essai biologique insecticide couramment utilisé 8,9,10. Cependant, la variabilité des données de ces méthodes est généralement élevée, avec des mesures de la même souche de moustique de laboratoire allant d’environ 20 à 70% de mortalité dans les tests de bouteille du CDC et de 0 à 50% dans les tests en tube de l’OMS lorsqu’ils sont exposés à des doses sublétales11. Une telle variation est surprenante parce que la variation génétique limitée dans la plupart des souches de laboratoire devrait entraîner une variation limitée de la susceptibilité aux insecticides dans la population. Néanmoins, il y a encore un niveau élevé de variation observée dans les résultats des essais biologiques.
Les sources potentielles de cette variation pourraient être le résultat d’une exposition hétérogène à un insecticide entre les échantillons dans le cadre de l’essai biologique en raison d’une exposition indirecte à l’insecticide par la surface, d’effets environnementaux hétérogènes, d’une variation biologique normale entre des individus du même génotype et d’une variation de la masse des spécimens de la même population12 . Une méthode rarement utilisée avec une reproductibilité plus élevée est le bioessai d’application topique. Dans ce test, l’insecticide est directement appliqué sur chaque insecte 13,14, éliminant le facteur d’exposition hétérogène de différents spécimens dans le même test. Cependant, en raison de la nature à débit lent de cette méthode, elle n’est pas couramment utilisée comme outil de surveillance de la susceptibilité aux insecticides pour les populations de moustiques. Cet article présente un protocole modifié pour l’essai biologique d’application topique qui permet des expositions à débit plus élevé tout en corrigeant la variation de la masse d’insectes, un paramètre qui est corrélé aux changements dans la sensibilité aux insecticides12. Une réduction du bruit et de la variation de masse des données de mortalité résultant d’une exposition variable aux insecticides permettrait une surveillance plus précise de la résistance technique11,15. Ces données pourraient être utilisées pour associer plus précisément la résistance phénotypique aux marqueurs génétiques, aux paramètres de condition physique et/ou à la compétence vectorielle. De plus, nous démontrons comment ce test pourrait facilement être adapté à d’autres espèces d’insectes en utilisant l’essai biologique d’application topique sur les mouches des fruits, une espèce d’insecte plus petite.
La principale limite des applications de contact résiduel susmentionnées est que l’exposition aux insecticides peut varier d’un échantillon à l’autre dans le même essai. Dans le cas des essais biologiques en bouteille du CDC et de la méthode de contact, l’exposition à l’insecticide peut varier entre les répétitions du même essai. Les insectes sont exposés à un insecticide qui est soit distribué à l’intérieur d’une bouteille en verre (essai biologique en bouteille cdc et méthode de contact), soit sur des papiers imprégnés (test en tube de l’OMS). La concentration d’insecticide sur les deux surfaces (verre et papier) est connue et prédéterminée par le dépistage de différentes espèces de génotypes connus. Cependant, la quantité disponible pour être potentiellement absorbée par l’insecte peut varier considérablement en fonction de la surface utilisée, des composants du mélange d’insecticides et de l’homogénéité avec laquelle l’insecticide est réparti sur le matériau de surface16,17. Dans le test biologique de la bouteille CDC, le revêtement insecticide à l’intérieur de la bouteille dépend des procédures utilisées par chaque laboratoire et utilisateur. Dans le test en tube de l’OMS, les papiers traités à l’insecticide sont produits de manière centralisée et donc très probablement assez homogènes dans tous les laboratoires. Cependant, dans le test en tube de l’OMS, le tube d’exposition permet aux échantillons d’atterrir et de reposer sur des mailles métalliques non exposées aux insecticides, ce qui entraîne une exposition hétérogène potentielle à l’insecticide parmi les échantillons de chaque essai. La quantité réelle d’insecticide ramassée et absorbée par les spécimens par chaque méthode doit encore être explorée plus avant18.
En outre, le test biologique en bouteille du CDC, le test en tube de l’OMS et la méthode de contact sont le plus souvent utilisés comme tests de seuil ne testant qu’une seule concentration d’insecticide prédéterminée. Cette approche permet de détecter avec précision la présence de résistance et est utile pour la surveillance de la résistance (en particulier lorsque la résistance se propage). Cependant, les tests de seuil ne peuvent pas quantifier la force de la résistance, ce qui pourrait être plus prédictif de l’efficacité des outils d’intervention. Si plusieurs concentrations d’insecticide sont utilisées avec ces méthodes, elles peuvent être utilisées comme tests d’intensité. Les tests d’intensité pour l’essai biologique en bouteille du CDC et le test en tube de l’OMS ont été introduits en testant 5x et 10x les doses discriminantes prédéterminées pour combler cette lacune dans la surveillance 6,19. Tout en offrant une plus grande capacité à différencier les populations résistantes, 3-5 doses (prédéterminées) fournissent une résolution limitée pour calculer les concentrations létales. De plus, des moustiques de différentes tailles sont utilisés dans de tels tests. Pourtant, il est important de mesurer la masse car les échantillons plus grands peuvent avoir besoin d’une dose plus élevée pour être tués, car la dose efficace par unité de masse sera beaucoup plus faible que celle d’un organisme plus petit12. Le calcul d’une dose létale relativisée en masse (quantité d’insecticide par masse d’insecte) serait une mesure plus utile que la concentration létale plus courante (p. ex., quantité d’insecticide par surface) car elle tient compte de la variation de la masse d’insectes entre les sexes, les populations et les génotypes. De telles données aideraient à combler l’écart entre la résistance génotypique et phénotypique en laboratoire et sur le terrain et pourraient également fournir un moyen facile de calculer la concentration d’application nécessaire pour traiter une population d’insectes d’une masse moyenne connue.
L’utilisation de doses létales relativisées en masse qui tuent 50% des échantillons (DL 50) intègre également plusieurs autres avantages. L’évaluation de la toxicité d’un composé spécifique en mg/kg (= ng/mg) est la norme en toxicologie humaine et vétérinaire14, et les valeurs DL50 figurent sur les fiches de données de sécurité. Les doses létales permettent également une comparaison directe de la toxicité entre différents produits chimiques pour une espèce particulière ou le même produit chimique pour différentes espèces20, ainsi qu’une évaluation de haute qualité de nouveaux insecticides et produits chimiques13. De plus, la DL50 peut fournir des rapports de résistance plus significatifs et plus précis que ceux dérivés des résultats de la mortalité par dose diagnostique, ce qui peut entraîner une surestimation du niveau de résistance présent dans une population. Par conséquent, ce test conviendrait aux programmes de surveillance de routine en fournissant une surveillance plus rigoureuse de la résistance basée sur des doses létales relativisées en masse dérivées de plus d’échantillons que celles recommandées pour d’autres essais biologiques21.
La méthode d’application topique a été utilisée dans la surveillance de la sensibilité aux insecticides pour les moustiques et les mouches comme alternative aux essais biologiques standard de sensibilité aux insecticides lorsque la résistance est déjà connue ou soupçonnée22,23, ainsi que pour la surveillance chez certains insectes nuisibles24 afin d’évaluer plus précisément les profils de résistance et la toxicité intrinsèque des insecticides21 . Dans les essais biologiques d’application topique, l’insecticide est appliqué sur chaque organisme, ce qui entraîne une variation minimale de l’exposition à l’insecticide. Cet article présente une méthode légèrement adaptée et améliorée qui permet d’appliquer l’exposition à l’insecticide sur un grand nombre d’insectes en peu de temps tout en contrôlant la massed’insectes 22. Cette méthode à débit plus élevé avec de bons niveaux de reproductibilité pourrait être un outil supplémentaire utile pour la surveillance systématique de la susceptibilité aux insecticides.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

L’utilisation continue d’insecticides pour la santé publique et l’agriculture a conduit à une résistance généralisée aux insecticides et à une entrave aux méthodes de lutte. La surveillance de la résistance aux insecticides des populations de moustiques se fait généralement par le biais d’essais biologiques en bouteille des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ou de tests en tube de l’Organisation mondiale de la santé (OMS). Cependant, ces méthodes peuvent entraîner un degré élevé de variabilité des données sur la mortalité en raison du contact variable de l’insecticide avec l’insecte, du nombre relativement faible d’organismes testés, de la variation importante de la masse entre les populations et des conditions environnementales en constante évolution, conduisant à des résultats variables. Cet article présente le bioessai d’application topique, adapté en tant que bioessai phénotypique à haut débit pour les moustiques et les mouches des fruits, pour tester un grand nombre d’insectes le long d’une gamme de concentrations d’insecticides.
Ce test 1) assure un traitement et un contact insecticide cohérents avec chaque organisme, 2) produit des courbes dose-réponse très spécifiques qui tiennent compte des différences de masse moyenne entre les souches et les sexes (ce qui est particulièrement important pour les organismes collectés sur le terrain), et 3) permet le calcul de doses létales médianes statistiquement rigoureuses (DL50 ), qui sont nécessaires pour les comparaisons des rapports de résistance - une approche de surveillance alternative à la mortalité par dose diagnostique, qui est également utilisée pour la surveillance de la résistance aux larvicides. Ce test sera un outil complémentaire pour phénotyper avec précision les populations de moustiques et, comme illustré par les mouches des fruits, est facilement adaptable pour une utilisation avec d’autres insectes. Nous soutenons que ce test aidera à combler l’écart entre la résistance aux insecticides génotypiques et phénotypiques chez plusieurs espèces d’insectes.

Ces résultats représentatifs présentent deux souches différentes d’Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), et une souche de champ isolée de Floride avec des mutations de résistance à l’élimination connues F1534C et V1016I (génotype IICC). De plus, Drosophila melanogaster (Canton: souche S) est présenté.
La figure 2 et la figure 3 illustrent la dose-réponse de chaque organisme par souche et sexe testés conformément au protocole ci-dessus. Comme aucune différence n’a été observée entre les courbes dose-réponse des moustiques mâles et femelles au sein de chaque souche (t = 1,70, p = 0,098 pour ROCK et t = 0,64, p = 0,527 pour IICC), les données des deux sexes au sein de chaque souche de moustique ont été regroupées. La DL50 relativisée en masse pour ROCK et IICC est de 0,008 ng/mg (IC à 95 % : 0-0,104) et de 0,336 ng/mg (IC à 95 % : 0,235-0,438), respectivement. Les IC à 95 % de ces valeurs ne se chevauchent pas, ce qui indique des réponses posologiques significativement différentes des souches. Le RR de la souche IICC (par rapport à la souche ROCK) est de 41,7, ce qui, selon l’OMS, est considéré comme très résistant5. Pour les mouches des fruits canton-S, la DL50 relativisée en masse est de 0,213 ng/mg (IC à 95 % : 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Figure 2 : Données représentatives des moustiques à l’aide d’un essai biologique d’application topique. Données dose-réponse représentatives provenant d’essais biologiques topiques d’application suivant le protocole ci-dessus utilisant de la deltaméthrine et des moustiques : (A) souches femelles Ae. aegypti ROCK (n = 880) et IICC (n = 550), (B) souches mâles Ae. aegypti ROCK (n = 880) et IICC (n = 569). Les concentrations d’analyse de la deltaméthrine variaient de 0,00075 ng /μL à 9,68705 ng / μL, et la dose de deltaméthrine appliquée (ng) par masse moyenne de moustique (mg) est réfléchie sur l’axe des x. La mortalité est indiquée en proportion sur l’axe des y. La ligne noire traversant chaque groupe de points de données représente la régression linéaire spécifique à la souche et au sexe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Figure 3 : Données représentatives des mouches des fruits à l’aide d’un essai biologique par application topique. Données dose-réponse représentatives provenant d’un essai biologique topique en application suivant le protocole ci-dessus utilisant la deltaméthrine et les mouches des fruits : souche D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Les concentrations d’essai de deltaméthrine variaient de 0,00499 à 5,02876 ng / μL, et la dose de deltaméthrine appliquée (ng) par masse moyenne de mouche des fruits (mg) est reflétée sur l’axe des x. La mortalité est indiquée en proportion sur l’axe des y. La ligne noire représente la régression linéaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Tente de manipulation d’insectes de paillasse. La tente de manipulation des insectes de paillasse est utilisée pour faciliter la capture des moustiques ou des mouches qui s’échappent pendant le test d’application topique. La structure est fermée en A et ouverte en B. Cette structure a été construite avec un tuyau en PVC et un tissu à mailles fines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Unité d’applicateur de seringue et de répéteur. Seringue et appareil applicateur de répéteur utilisé pour doser les insectes. Les pièces principales comprennent 1) aiguille, 2) barillet de seringue, 3) piston, 4) répéteur et 5) bouton de répéteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Script de randomisation : Script de randomisation pour créer des étiquettes non biaisées pour toutes les tasses de chaque expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 2 : Feuille de pointage de mortalité : Feuille de pointage de mortalité pour faciliter l’évaluation de la mortalité. La feuille comprend également les endroits où enregistrer toutes les autres informations importantes à enregistrer, telles que référencées dans le protocole, telles que les heures de début et de fin de l’application de l’insecticide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 3 : Exemples de données sur la mortalité : Exemple de fichier de données utilisé pour créer la figure 2. Les descriptions des en-têtes de colonne sont les suivantes: « id » = code d’identification de chaque point de données; « espèce » = nom de l’espèce (p. ex., Aedes aegypti); « insecticide » = nom de l’insecticide appliqué par voie topique (p. ex. deltaméthrine); « souche » = nom de la souche de moustique (p. ex., ROCK); « date » = date de début de l’application topique; « sexe » = sexe des moustiques; « âge » = âge des moustiques (jeunes = 3-5 jours; vieux = 4 semaines); « total.mosq » = nombre total de moustiques pesés en lot; « poids » = poids (mg) de tous les moustiques dans le lot; « concentration » = concentration d’insecticide (μg/mL); « seringue » = volume de gouttelettes (mL) de la seringue; « dose » = quantité d’ingrédient actif insecticide appliqué sur chaque moustique (ng); « total » = nombre de moustiques dans chaque tasse; « morts » = nombre de moustiques morts dans chaque tasse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 4 : Code d’analyse R : Exemple de code R pouvant être utilisé pour effectuer l’analyse Probit (comme décrit à l’étape 8 du protocole). Les résultats représentatifs (accessibles via l’exemple de fichier de données supplémentaire) peuvent être utilisés avec ce code R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Nous décrivons la méthodologie et l’importance de l’essai biologique d’application topique pour mesurer la sensibilité aux insecticides chez les moustiques et les mouches des fruits. Le test présenté est à haut débit, utilise la masse d’insectes - permettant ainsi de calculer une dose létale relativisée en masse au lieu de la concentration - et a probablement une variabilité plus faible que d’autres méthodes similaires.

Essai biologique d’application topique pour quantifier la toxicité des insecticides pour les moustiques et les mouches des fruits

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

En appliquant directement de l’insecticide sur l’insecte plutôt que par contact avec la surface, il y a une variation minime de l’exposition aux insecticides, ce qui nous permet de mesurer plus précisément le profil de sensibilité des populations de moustiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de calculer les doses létales relativisées en masse d’un insecticide plutôt que les concentrations létales, ce qui améliore considérablement les comparaisons de rapports de résistance. Veillez à bien entreposer les insecticides, évitez de contaminer vos outils et assurez-vous que les pièces de la seringue sont en bon état.Cela vous aidera à obtenir des résultats cohérents. Pour commencer, retirez les solutions insecticides nécessaires du congélateur. Vaporisez immédiatement la solution en vortex ou inversez-la cinq fois et placez-la dans un récipient résistant à la lumière à température ambiante pour laisser les insecticides se réchauffer à la température ambiante avant de les utiliser.Posez cinq tubes de microcentrifugation de 0,5 millilitre d’acétone chacun. Remplissez complètement le barillet de la seringue avec de l’acétone du premier tube. Ensuite, expulsez l’acétone dans un conteneur à déchets en appuyant rapidement sur le piston et répétez quatre fois de plus pour effectuer un total de cinq lavages d’acétone à partir de la même aliquote d’acétone.Ensuite, remplissez complètement le barillet de la seringue avec de l’air et expulsez l’air et les restes potentiels d’acétone dans le conteneur à déchets. Répétez deux autres fois pour effectuer trois lavages à l’air. Créez une poche d’air dans le barillet entre le piston de la seringue et le haut de l’aiguille en tirant le piston vers le haut d’environ cinq millimètres dans le canon.Étiquetez les gobelets en plastique avec l’ID aléatoire pour l’évaluation de la mortalité à l’aveugle. À l’aide d’un aspirateur alimenté par aspiration par inhalation, aspirez le nombre souhaité de moustiques adultes âgés de trois à cinq jours. Placez la pointe de l’aspirateur dans le tube avec du coton enroulé autour de la pointe.Expirez doucement et tapotez l’aspirateur pour transférer les moustiques dans un tube conique. Utilisez le coton pour boucher le tube lorsque la pointe de l’aspirateur est retirée, puis coiffer avec le couvercle. Abattre brièvement les moustiques dans les tubes en les plaçant pendant au moins 10 minutes à quatre degrés Celsius ou en les enterrant sous la glace dans un bac à glace.Transférez les moustiques renversés dans la tente de manipulation des insectes. Basculez soigneusement les moustiques sur un plateau en plastique placé sur la glace et versez environ 50 moustiques à la fois pour vous assurer que chacun touche le plateau frais en dessous et reste renversé. Triez les moustiques par sexe en les ramassant doucement par les jambes ou les ailes avec une pince, puis en plaçant chaque sexe dans une tasse de maintien séparée et arrêtez-vous lorsque le nombre souhaité est atteint.Lors du tri, enlevez tous les moustiques blessés ou très grands ou petits. Pour enregistrer le poids de la tasse à moustiques, placez une tasse vide avec une boîte de Petri comme couvercle sur la balance et tare la balance. Versez les moustiques dans le récipient et placez le couvercle sur le dessus.Placez le récipient sur la balance et notez le poids final, ainsi que le nombre de moustiques. Replacez immédiatement la tasse de spécimens sur la glace pour les garder immobilisés jusqu’à ce que toutes les tasses du spécimen soient pesées. Divisez les moustiques préparés en cinq à 10 tasses distinctes placées sur de la glace, étiquetées avec des pièces d’identité aléatoires.Utilisez une pince à épiler et un compteur portatif pour obtenir 20 à 25 moustiques par tasse. Pour trier les mouches des fruits, anesthésiez les mouches à l’aide de dioxyde de carbone pendant sept secondes. Versez les mouches sur un sac de glace enveloppé dans du papier de banc.À l’aide d’un pinceau à pointe fine, séparez et comptez les mâles et les femelles. Utilisez le pinceau pour ramasser doucement les mouches choisies et placez-les dans une bouteille propre et vide. Après avoir choisi un nombre égal de mouches des fruits mâles et femelles, étiquetez les bouteilles de stock avec le nom de la souche et le total de la mouche des fruits.Anesthésiez la bouteille de mouches des fruits en utilisant du dioxyde de carbone pendant sept secondes. Versez les mouches des fruits sur du papier de pesée et utilisez le papier comme entonnoir pour introduire les mouches dans un flacon goudronné étiqueté avec un id aléatoire.Après avoir placé le couvercle de la boîte de Petri sur le flacon de mouches des fruits, placez-le sur la balance. Notez le poids et le nombre combinés de spécimens sur la feuille de pointage.Placez immédiatement le flacon de mouches des fruits dans un plateau de glace avec le couvercle toujours sur le dessus pour empêcher les mouches de s’échapper. Chargez la seringue avec la concentration d’insecticide appropriée, en commençant par la dose la moins concentrée et travaillez vers la dose la plus concentrée avec chaque groupe d’organismes. Basculez les spécimens sur du papier de pesage placé sur un plateau sur la glace.Séparez les spécimens qui sont proches les uns des autres à l’aide d’un pinceau propre sans insecticide ou d’un coton-tige pour permettre un accès facile à chaque spécimen pour le dosage. À l’aide de la seringue, appliquez une gouttelette de solution insecticide sur le thorax ventral et l’abdomen pour les moustiques et le dos pour les mouches des fruits. Versez immédiatement les spécimens dans le gobelet en plastique étiqueté.Couvrez la tasse avec un filet et un élastique. Notez un nombre de spécimens mis à jour sur la tasse si des spécimens ont été tués, endommagés ou échappés au cours de ce processus. Placez la tasse terminée dans un plateau de maintien.Pour la première tasse, notez l’heure à laquelle le dosage est terminé. Répétez le dosage pour chaque tasse jusqu’à ce que tous les échantillons aient été dosés avec les concentrations d’insecticide appropriées, et notez l’heure de fin lorsque tous les échantillons ont été dosés. Fournir une solution de saccharose à 10% à chaque tasse via une boule de coton humide et stocker les moustiques et les mouches des fruits à la température et à l’humidité souhaitées.Enregistrer la mortalité des échantillons 24 heures après le début de l’exposition à l’insecticide. Classez les moustiques comme vivants s’ils peuvent voler et se tenir debout et morts s’ils sont immobiles ou ataxiques, comme décrit par l’OMS. Suivez la même évaluation de la mortalité pour les mouches des fruits.Après avoir effectué le bioessai, des données dose-réponse ont été obtenues avec deux souches de génotype Rockefeller et IICC pour le mâle et le femelle Aedes aegypti. La dose létale médiane relativisée en masse pour Rockefeller et IICC était de 0,008 et 0,336 nanogramme par milligramme, respectivement. Les résultats n’ont révélé aucune différence entre les courbes dose-réponse des moustiques femelles et mâles au sein de chaque souche.Par conséquent, les données des deux sexes ont été combinées pour calculer les valeurs médianes de la dose létale. Étant donné que les intervalles de confiance à 95 % pour la dose létale médiane de ces deux souches ne se chevauchaient pas, ces valeurs ont été considérées comme significativement différentes. De plus, lors du calcul des rapports de résistance, la souche IICC était plus de 40 fois plus résistante que la souche Rockefeller sensible.Des données dose-réponse pour la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, souche Canton-S, ont également été obtenues, et la dose létale médiane relativisée en masse s’est avérée être de 0,213 nanogramme par milligramme. La cohérence est essentielle, en particulier lors de l’entreposage et de l’application de l’insecticide et de l’évaluation de la mortalité. De plus, faites attention lors de la manipulation de l’échantillon pour éviter les dommages ou la mort non induits par l’insecticide.Avec cette méthode, nous pouvons maintenant déterminer avec précision la résistance technique d’une population de moustiques et comment les conditions environnementales ont un impact sur la résistance ou comment la résistance technique prédit la résistance pratique.

Research

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