Name: topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por um prêmio CAREER da National Science Foundation para sh sob o número de premiação 2047572. Agradecemos a Damien Rivera por sua ajuda na criação e preparação de moscas-de-frutas para o ensaio de aplicação atual, Dr. Ganetzky da Universidade de Wisconsin-Madison por compartilhar sua cepa de mosca-de-frutas Canton-S, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças para compartilhar a cepa Rockefeller, e o Centro de Agricultura Médica agrícola e veterinária dos Estados Unidos para compartilhar a cepa isolina do IICC. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Este artigo apresenta um protocolo adaptado para o ensaio de aplicação tópica para mosquitos e moscas-das-frutas. Este procedimento poderia ser facilmente adaptado para ser utilizado no campo e com outros organismos, pois requer equipamentos especializados mínimos. Abordados abaixo estão as etapas críticas deste protocolo, modificações potenciais, aconselhamento de solução de problemas, limitações do método e significância deste método.
Passos críticos no protocolo: Existem três etapas críticas no protocolo que, se concluídas incorretamente, podem impactar drasticamente os resultados do bioensaio: precisão de concentração de inseticidas, knockdown de amostras e avaliação da mortalidade.
Precisão de concentração de inseticidas: É extremamente importante ter soluções precisas de inseticidas para obter curvas de dose-resposta replicáveis e resultados significativos. A abordagem volumosa para a preparação da solução de inseticidas é mais comum dentro da literatura tanto para o bioensaio de garrafas CDC7 quanto para aplicações tópicas 13,14,43. No entanto, a abordagem gravimétrica descrita aqui é inerentemente mais precisa devido à consideração da temperatura através da inclusão da densidade (específica da temperatura), levando a uma preparação de formulação mais precisa.
Knockdown de espécimes: Derrubar os espécimes é um componente crítico deste método e permite a administração precisa das medidas de inseticida e de peso. No entanto, derrubar organismos inevitavelmente contém o risco de estresse físico e danos, como demonstrado anteriormente30. Portanto, tenha cuidado e cuidado ao derrubar os espécimes para garantir que i) cada espécime seja derrubado por uma duração semelhante, ii) o comprimento do knockdown é mantido ao mínimo, e iii) o método de knockdown é mantido consistente em todos os espécimes. Além disso, é aconselhável testar o método knockdown separadamente, antes da aplicação de inseticidas, para garantir que o método seja bem sucedido e não induza a mortalidade por controle superior a 10%. O teste inicial pode levar mais tempo para um usuário inexperiente, levando a tempos de knockdown mais longos. Portanto, tenha cuidado ao interpretar os resultados dos primeiros ensaios.
Avaliação de mortalidade: Avaliar a mortalidade pode ser desafiador, especialmente quando o inseticida não mata completamente, mas apenas derruba ou mutila o mosquito ou voa. Portanto, é importante estar ciente de como o inseticida impacta o organismo alvo e ter uma definição clara para organismos "mortos" (ou derrubados) antes de começar. Além disso, recomenda-se que a mesma pessoa avalie a mortalidade entre doses e réplicas para reduzir a variação.
Modificações de protocolo: Várias modificações descritas abaixo podem ser aplicadas a este protocolo para melhorar sua versatilidade e acessibilidade.
Adaptando o ensaio a insetos menores ou de maior porte: Ao usar espécimes menores ou maiores, é aconselhável aplicar uma dose menor ou maior de inseticida, respectivamente. Como exemplo, adaptamos o protocolo do mosquito para moscas frutíferas reduzindo a dose de 0,5 μL para uma dose de 0,2 μL. Certifique-se de que o tamanho correto da seringa é escolhido para o volume de dose escolhido.
Adaptando o ensaio aos insetos de campo: Ao usar insetos de campo, pode haver mais variação no tamanho dos insetos. Portanto, pesar os insetos em grupos menores (por exemplo, por xícara) seria recomendado em vez de como um grande grupo (por exemplo, todos os insetos usados para um experimento). Isso pode ajudar a capturar a variação potencial da suscetibilidade de inseticidas associada às diferenças na massa de insetos de campo.
Modificações do equipamento: Tenda de manuseio de insetos: A dosagem do espécime pode ser concluída sob uma tenda de manuseio de insetos que é simplesmente construída com tubo de PVC e rede de mosquitos. Esta pode ser uma alternativa a uma sala fechada (por exemplo, inseticária) e ajudar a eliminar a contaminação potencial de inseticidas em áreas onde a criação de insetos pode ocorrer. Esta tenda de manuseio de insetos é fácil de construir e de baixo custo (~$70). Alternativamente, uma gaiola de manuseio de insetos poderia ser comprada (~$425).
Mesa de frio: Blocos de gelo ou bandejas de gelo podem ser usados para derrubar o espécime e/ou manter o espécime derrubado.
Incubadora: As incubadoras são recomendadas para a criação da amostra e a realização da amostra por 24 h após o tratamento do inseticida. Se uma incubadora não estiver disponível, ela pode ser construída. Os equipamentos necessários para a construção da incubadora incluem um recipiente isolado, umidificador, cabos de calor, umidade e controlador de temperatura, e uma luz, que deve somar um custo total de ~$170, seguindo e expandindo sobre os métodos anteriores44.
Segurando copos: Embora os copos de plástico sejam usados para classificar e segurar o espécime tratado, copos de papel forrados de cera ou recipientes de vidro seriam alternativas adequadas.
Modificação do organismo e da fase de vida: Este método é muito adaptável para uso com outros vetores, insetos e/ou artrópodes como mosquitos Culex quinquefasciatus 32, moscas da casa32 e baratas45, bem como estágios de vida não adultos, como larvasde mosquitos 46.
Modificação de localização de aplicativo tópico: Este método descreve a aplicação do inseticida no tórax ventral e região do abdômen para mosquitos (e o dorso para moscas frutíferas). No entanto, outros locais de aplicação podem ser usados desde que o local de exposição seja consistente. A consistência é importante porque a sensibilidade ao inseticida pode variar de acordo com o localda aplicação 32.
Conselhos de solução de problemas: Este método tem vários passos que são inicialmente desafiadores. Descritos abaixo são alguns dos problemas mais comuns que se pode encontrar.
Soluções de inseticida de vazamento/evaporação: Inseticidas são comumente dissolvidos em acetona, um composto altamente volátil. Isso significa que a acetona evapora rapidamente à temperatura ambiente, aumentando as concentrações de inseticidas ao longo do tempo. Se as soluções de inseticida parecerem estar vazando ou evaporando, refaça as soluções, certifique-se de que a tampa do tubo está bem ligada e verifique duas vezes se os protocolos de armazenamento estão sendo seguidos corretamente (por exemplo, o parafilme está sendo usado e os tubos estão armazenados na vertical). Se o vazamento persistir, tente encher os tubos com um volume menor para permitir mais espaço para a mudança de volume que a acetona experimenta em diferentes temperaturas. Além disso, se usar acetona como solvente, certifique-se de que os tubos são classificados para armazenamento de acetona (por exemplo, plásticos FEP, TFE e PFA). Se utilizar inseticidas hidrofóbicos, armazene as soluções em frascos de vidro (como inseticidas hidrofóbicos aderem ao vidro menor que o plástico). Também é uma boa prática marcar o menisco da solução antes de armazenar para monitorar a evaporação.
Peso à deriva no microequilípmo ao pesar organismos: Se a leitura de peso na escala estiver à deriva (subindo ou descendo lentamente), isso pode ser devido à estática. A deriva ocorre mais frequentemente quando pesam organismos em itens plásticos, pois o plástico pode facilmente conter uma carga estática. Para evitar isso, um papel de pesagem pode ser colocado sob o recipiente plástico que está sendo pesado, ou um recipiente não plástico, como o vidro, pode ser usado.
Resultados de mortalidade anormal: Há muitas maneiras pelas quais os resultados da mortalidade podem parecer anormais, como observar alta mortalidade nos controles ou alta/baixa mortalidade em todas as doses de inseticida. Revise os seguintes casos para solucionar problemas em cada cenário.
Mortalidade de alto controle Se houver alta mortalidade no grupo controle (10% ou mais), avalie o método de knockdown e o tempo de queda dos espécimes. Se possível, encurte o tempo para o qual os espécimes são derrubados. Outros fatores potenciais a considerar para a alta mortalidade nos controles incluem i) verificar se as configurações da incubadora estão corretas — temperaturas anormais e/ou umidade podem levar ao aumento da mortalidade. Temperatura e umidade devem ser verificadas com um data logger independente. ii) Avaliação do manuseio de insetos. Manusear insetos demais ou muito grosseiramente pode levar à alta mortalidade. iii) Verificar se não há contaminação por inseticidas na acetona 100% utilizada para tratar o grupo controle ou na instrumentação. Substitua a acetona e limpe todos os instrumentos com acetona ou etanol. Evite a contaminação substituindo frequentemente luvas, evitando derramamentos e instrumentos de limpeza. Note que no Arquivo Suplementar 3, um máximo de dois mosquitos morreram dentro dos copos de controle (somente acetona). Esse nível de mortalidade não é considerado alto (é inferior a 10%), e, portanto, não houve motivo para preocupação.
Alta mortalidade em todos os grupos expostos (mas não em grupos de controle) Use concentrações de inseticidas mais baixas ou volumes menores de dose para testes. As doses utilizadas podem estar acima da dose mínima que não induzirá a mortalidade. Use várias diluições de 10 vezes para identificar a faixa de dose correta e descartar a contaminação. Para evitar contaminação, comece a dosar com a menor concentração e trabalhe para a maior concentração. Além disso, certifique-se de que todos os equipamentos utilizados sejam regularmente limpos com acetona e/ou etanol, as doses aplicadas à amostra são muito pequenas, e mesmo a menor contaminação cruzada pode impactar os resultados.
Baixa mortalidade em todos os grupos expostos Use maiores concentrações de inseticidas. As doses utilizadas podem ser muito baixas para causar mortalidade na população. Para identificar a faixa de dose correta, exponha as amostras a várias doses concentradas de 10 vezes mais. Certifique-se de que as soluções de inseticida não tenham expirado ou degradadas (potencialmente devido à alta temperatura ou exposição à luz). Se as soluções expiraram ou são suspeitas de terem degradado, refaça as soluções e garanta que as condições adequadas de armazenamento sejam seguidas.
Mortalidade inconsistente entre réplicas/dias A hora do dia em que os insetos são expostos ao inseticida pode afetar o nível de resistência expresso, especialmente para a resistência metabólica34. Repita este protocolo durante a mesma janela de tempo todos os dias para evitar o tempo do dia como uma variável potencial contribuindo para mudanças na mortalidade. Outros fatores potenciais que contribuem para a mortalidade inconsistente entre as réplicas incluem i) espécimes sendo criados diferencialmente entre experimentos. Certifique-se de que todos os espécimes são da mesma faixa etária, criados na mesma temperatura e densidades semelhantes e disponibilidade de alimentos. ii) concentrações de inseticidas degradantes ao longo do tempo ou se tornando mais concentradas devido à evaporação de acetona. Refaça as soluções e garanta condições adequadas de armazenamento. iii) Pontuação de mortalidade inconsistente. Certifique-se de que a mesma pessoa escore a mortalidade ou desenvolva um protocolo claro para ser usado consistentemente em toda a equipe. Use pontuação cega para reduzir o viés na pontuação de mortalidade.
Insetos grudados na superfície da bandeja de classificação: A acetona reage a plásticos usados neste protocolo, como placas de Petri. O espécime provavelmente aderirá à superfície se usar acetona em placas de Petri ou superfícies plásticas similares. Esta adesão pode ser evitada forrando a bandeja de classificação com papel de pesagem ou usando uma bandeja de triagem não plástica. Além disso, a condensação na superfície do plástico na bandeja de classificação ou copos de retenção pode levar a insetos que aderirem à condensação, ou o espécime pode ser muito frio e potencialmente congelar à superfície. Ajuste o método de knockdown para reduzir a condensação, evitando que as amostras fiquem muito frias/congeladas (por exemplo, coloque papel de pesagem entre os espécimes e a bandeja de triagem de plástico).
Erros de análise r: Uma vez coletados os dados de mortalidade, uma variedade de complicações pode ocorrer durante a análise. A razão mais comum de um código R não conseguir concluir as ações do arquivo de dados é que o formato de dados não corresponde ao código (por exemplo, títulos de coluna e/ou células vazias). Se surgirem complicações mais graves, consulte as páginas de ajuda R incorporadas ao Rstudio35.
Limitações do método de aplicação tópico acima descrito: A absorção de inseticidas através do método de aplicação tópica não imita a exposição natural: A aplicação atual no corpo primário não é a maneira natural de absorção de inseticidas. No campo, os insetos absorvem principalmente inseticidas através de suas pernas ao longo do tempo em que estão em contato com a superfície tratada com inseticida ou em suas asas através de pequenas partículas de aerossol47,48, em vez de uma exposição rápida na superfície ventral. No entanto, a aplicação direta de uma dose conhecida de inseticida estabelecerá com precisão uma resposta fenotípica aos inseticidas, necessária para estudos genéticos e evolutivos ou comparações de suscetibilidade de inseticidas através do espaço ou do tempo. Portanto, essa abordagem é benéfica para testar a resistência técnica, mas não medirá diretamente a resistência prática (a eficácia da ferramenta de intervenção real em um ajuste de campo15). No entanto, é importante notar que os métodos padrão atuais (por exemplo, testes de tubos da OMS e bioensasseções de garrafas CDC) também não podem capturar ou imitar a exposição de aerossol (ou seja, por embacmento) no campo.
Ensaios de aplicação tópicos só podem avaliar inseticidas de absorção de contato: Este método destina-se a inseticidas que trabalham através do contato e absorção do inseticida e não para uso com inseticidas orais, como o ácido bórico comumente usado em iscas de açúcar tóxico atraentes49.
Significado do método: O método de aplicação tópico expande-se em padrões bem estabelecidos para bioensaio de inseticida, calculando a dose letal (não concentração) e medindo a resistência técnica (não prática)15. Dado abaixo estão as vantagens e desvantagens deste método em relação aos ensaios de suscetibilidade de inseticida existentes.
Cálculo da dose letal: Este método determina a dose letal do inseticida, em vez da concentração letal que os bioensatórios do CDC e da OMS usam para estabelecer a dose discriminante11. A dose letal é mais significativa porque é uma quantidade quantificada de inseticida conhecida por provocar mortalidade. Em contraste, a concentração letal não considera quanto inseticida o organismo realmente adquire. Ao utilizar o cálculo da dose letal, as diferenças entre perfis de suscetibilidade de sexo ou tamanho dependente podem ser observadas e quantificadas com mais precisão, tornando essa medida ainda mais versátil.
Resistência técnica: Este método avalia a resistência técnica, que é a resistência medida em ambientes padronizados e controlados. Tais medidas são adequadas para a vigilância da propagação da resistência a inseticidas e ligando resistência fenotípica com marcadores potenciais15. Devido à diminuição da variação da mortalidade decorrente do bioensaio de aplicação tópica, permite uma melhor identificação de novos marcadores de resistência. No entanto, devido à exposição não natural de inseticidas ao mosquito, este ensaio não é adequado para a estimativa de eficácia de uma intervenção específica em uma população específica. Outros ensaios são necessários para medições de tal resistência prática15.
Adaptabilidade do espécime: Este método pode ser praticado em outros artrópodes importantes, como pragas de cultura (por exemplo, besouro de batata colorado), pragas de casa (por exemplo, baratas e percevejos), ou polinizadores (por exemplo, abelhas) com alterações simples na abordagem de knockdown e/ou dose de inseticida, volume e/ou concentração (como descrito acima). A facilidade de adaptabilidade pode ajudar a analogizar a pesquisa de resistência a inseticidas em diferentes campos de pesquisa. O uso de um valor LD50 em vez de uma concentração letal que mata 50% dos espécimes (LC50) permite uma comparação precisa entre as espécies.
Custar: Semelhante aos bioensatos de garrafas CDC e testes de tubos da OMS, os custos para executar o ensaio de aplicação tópico são mínimos (veja a Tabela de Materiais). Os equipamentos essenciais são a seringa (aproximadamente US$ 70) e o dispensador (aproximadamente US$ 100), que são reutilizáveis em ensaios.
Número de espécimes necessários: Um mínimo de 20-25 espécimes devem ser usados por copo de ensaio de aplicação tópica. Recomenda-se um mínimo de cinco concentrações de inseticidas para serem testadas por experimento, com um mínimo de três réplicas recomendadas para o procedimento. No geral, isso resulta em um mínimo de 300-375 amostras necessárias para um teste completo, comparável ao número de amostras necessárias para realizar testes de intensidade de resistência usando testes de tubo da OMS ou bioensatos de frascos CDC. No entanto, se a variabilidade reduzida for alcançada com o bioensaio de aplicação tópica, o mesmo número de espécimes pode levar a mais poder estatístico para comparar dados de suscetibilidade através do espaço ou do tempo.

Os mosquitos são responsáveis por mais de 700.000 mortes por ano devido às doenças que transmitem aos seres humanos, com mais da metade dessas mortes por malária apenas1. O principal método preventivo contra a transmissão da malária e outras doenças transmitidas por vetores é o uso de inseticidas, muitas vezes na forma de redes de inseticidas de longa duração ou pulverização residualinterna 2. No entanto, a resistência a inseticidas é generalizada entre mosquitos e outros vetores de insetos, bem como pragas agrícolas 3,4. Para gerenciar efetivamente a resistência, a vigilância é de fundamental importância5. Para isso, são necessários métodos de detecção de resistência altamente precisos e de alto rendimento. Atualmente, as ferramentas de vigilância de resistência a inseticidas mais difundidas para mosquitos são o teste de tubo da OMS6 e o bioensaio de garrafa CDC7. Para moscas de frutas, o método de aplicação de contato residual (semelhante ao bioensaio da garrafa CDC) é um bioensaio deseticida comumente usado 8,9,10. No entanto, a variabilidade nos dados desses métodos é tipicamente alta, com medidas da mesma cepa de mosquitos de laboratório variando de ~20-70% de mortalidade em ensaios de garrafas CDC e 0-50% em testes de tubos da OMS quando expostos a dosagens subletaras11. Tal variação é surpreendente porque espera-se que a variação genética limitada na maioria das cepas laboratoriais leve a uma variação limitada de suscetibilidade de inseticidas na população. No entanto, ainda há um alto nível de variação observado nos resultados do bioensaio.
Fontes potenciais dessa variação podem ser resultado da exposição heterogênea de inseticida entre espécimes dentro do bioensaio devido à exposição indireta de inseticidas através da superfície, efeitos ambientais heterogêneos, variação biológica normal entre indivíduos do mesmo genótipo e variação na massa de espécimes da mesma população12 . Um método pouco utilizado com maior replicabilidade é o bioensaio de aplicação tópico. Neste ensaio, o inseticida é diretamente aplicado a cada inseto13,14, removendo o fator de exposição heterogênea de diferentes espécimes dentro do mesmo ensaio. No entanto, devido à natureza de rendimento lento deste método, ele não é usado rotineiramente como ferramenta de vigilância de suscetibilidade de inseticidas para populações de mosquitos. Este artigo apresenta um protocolo modificado para o bioensaio de aplicação tópica que permite exposições de maior rendimento, ao mesmo tempo em que corrige a variação da massa de insetos, parâmetro que se correlaciona com alterações na suscetibilidade de inseticida12. A redução do ruído e da variação de massa nos dados de mortalidade por exposição variável a inseticidas permitiria uma vigilância de resistência técnica mais precisa11,15. Esses dados poderiam ser usados para associar com mais precisão a resistência fenotípica com marcadores genéticos, parâmetros de aptidão e/ou competência vetorial. Além disso, demonstramos como este ensaio poderia ser facilmente adaptado a outras espécies de insetos usando o bioensaio de aplicação tópica em moscas frutíferas, uma espécie de inseto de menor corpo.
A principal limitação das aplicações de contato residual acima mencionadas é que a exposição a inseticidas pode variar de espécime para espécime dentro do mesmo ensaio. No caso de bioensações de garrafas CDC e do método de contato, a exposição a inseticidas pode variar entre as réplicas do mesmo ensaio. Os insetos são expostos a inseticida que é distribuída no interior de uma garrafa de vidro (bioensaio de garrafa CDC e método de contato) ou em papéis impregnados (teste de tubo da OMS). A concentração de inseticida em ambas as superfícies (vidro e papel) é conhecida e predeterminada pela triagem de diferentes espécies de genótipos conhecidos. No entanto, a quantidade disponível para potencialmente ser absorvida pelo inseto pode variar muito dependendo da superfície utilizada, dos componentes da mistura de inseticidas e de quão homogêneo o inseticida é distribuído através do material superficial16,17. No bioensaio da garrafa CDC, o revestimento de inseticida no interior da garrafa depende dos procedimentos empregados por cada laboratório e usuário. No teste do tubo da OMS, os papéis tratados com inseticida são produzidos centralmente e, portanto, provavelmente bastante homogêneos entre os laboratórios. No entanto, no teste do tubo da OMS, o tubo de exposição permite que as amostras aterrissem e repousem sobre a malha metálica não exposta a inseticidas, levando a uma exposição potencial heterogênea de inseticida entre as amostras dentro de cada teste. A quantidade real de inseticida captada e absorvida por espécimes através de cada método ainda precisa ser explorada mais18.
Além disso, o bioensaio de garrafa CDC, o teste do tubo da OMS e o método de contato são mais comumente usados como ensaios limiares testando apenas uma concentração de inseticida pré-determinada. Essa abordagem pode detectar com precisão a presença de resistência e é valiosa para a vigilância de resistência (especialmente quando a resistência está se espalhando). No entanto, os ensaios limiares não podem quantificar a força da resistência, o que pode ser mais preditivo da eficácia das ferramentas de intervenção. Se múltiplas concentrações de inseticidas forem usadas com esses métodos, elas podem ser usadas como ensaios de intensidade. Ensaios de intensidade para o bioensaio de garrafas CDC e o teste do tubo da OMS foram introduzidos através do teste de 5x e 10x as doses discriminantes predeterminadas para resolver essa lacuna na vigilância 6,19. Ao mesmo tempo em que proporciona maior capacidade de diferenciar entre populações resistentes, as doses de 3-5 (predeterminadas) fornecem resolução limitada para calcular concentrações letais. Além disso, mosquitos de vários tamanhos são usados em tais ensaios. No entanto, a massa é importante de medir, pois espécimes maiores podem precisar de uma dose maior para serem mortos, pois a dose eficaz por unidade de massa será muito menor do que a de um organismo menor12. Calcular uma dose letal relativizada em massa (quantidade de inseticida por massa de insetos) seria uma métrica mais útil do que a concentração letal mais comum (por exemplo, quantidade de inseticida por área de superfície) pois considera a variação da massa de insetos entre sexos, populações e genótipos. Tais dados ajudariam a preencher a lacuna entre a resistência genotípica e fenotípica dentro do laboratório e do campo e também poderiam fornecer uma maneira fácil de calcular a concentração de aplicação necessária para tratar uma população de insetos de uma massa média conhecida.
O uso de doses letais relativizadas em massa que matam 50% dos espécimes (LD50) também incorpora vários outros benefícios. A avaliação da toxicidade de um composto específico em mg/kg (= ng/mg) é padrão na toxicologia humana e veterinária14, e os valores de LD50 são encontrados nas folhas de dados de segurança do material. As doses letais também permitem a comparação direta da toxicidade entre diferentes produtos químicos em relação a uma determinada espécie ou o mesmo produto químico para diferentes espécies20, bem como avaliação de alta qualidade de novos inseticidas e produtos químicos13. Além disso, o LD50 pode fornecer razões de resistência mais significativas e precisas do que aquelas derivadas dos resultados de mortalidade por dose diagnóstica, o que pode resultar em uma superestimação do nível de resistência presente em uma população. Portanto, este ensaio seria adequado para programas de vigilância de rotina, fornecendo um monitoramento de resistência mais rigoroso com base em doses letais relativizadas em massa derivadas de mais espécimes do que o recomendado para outros bioensasseos21.
O método de aplicação tópica tem sido usado na vigilância de suscetibilidade de inseticidas para mosquitos e moscas como alternativa para os bioensitárias de suscetibilidade de inseticidas padrão quando a resistência já é conhecida ou suspeitade 22,23, bem como para vigilância em alguns insetosde pragas 24 para avaliar com mais precisão perfis de resistência e toxicidade intrínseca intrínsecnica21 . Em bioensações de aplicação tópica, o inseticida é aplicado a cada organismo, resultando em variação mínima na exposição a inseticidas. Este artigo apresenta um método ligeiramente adaptado e aprimorado que permite que a exposição a inseticidas seja aplicada a um grande número de insetos em um curto período, ao mesmo tempo em que controla a massa de insetos22. Este método de maior rendimento com bons níveis de replicabilidade pode ser uma ferramenta adicional útil para a vigilância de suscetibilidade de inseticidas de rotina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

O uso contínuo de inseticidas para a saúde pública e a agricultura levou à resistência generalizada aos inseticidas e à dificultação dos métodos de controle. A vigilância da resistência a inseticidas das populações de mosquitos é normalmente feita através de bioensações de garrafas do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ou testes de tubos da Organização Mundial da Saúde (OMS). No entanto, esses métodos podem resultar em um alto grau de variabilidade nos dados de mortalidade devido ao contato variável de inseticidas com o inseto, ao número relativamente pequeno de organismos testados, à extensa variação da massa entre as populações e às constantes mudanças nas condições ambientais, levando a desfechos variáveis. Este artigo apresenta o bioensatório de aplicação tópica, adaptado como um bioensatório fenotípico de alto rendimento tanto para mosquitos quanto moscas de frutas, para testar um grande número de insetos ao longo de uma série de concentrações de inseticidas.
Este ensaio 1) garante tratamento consistente e contato de inseticidas com cada organismo, 2) produz curvas de dose-resposta altamente específicas que explicam diferenças na massa média entre cepas e sexos (o que é particularmente importante para organismos coletados em campo), e 3) permite o cálculo de doses letais medianas estatisticamente rigorosas (LD50 ), necessária para comparações de razão de resistência - uma abordagem alternativa de vigilância da mortalidade por dose diagnóstica, que também é utilizada para a vigilância da resistência ao larvicida. Este ensaio será uma ferramenta complementar para fenotipar com precisão as populações de mosquitos e, como ilustrado usando moscas frutíferas, é facilmente adaptável para uso com outros insetos. Argumentamos que este ensaio ajudará a preencher a lacuna entre a resistência genotípica e fenotípica de inseticidas em várias espécies de insetos.

Estes resultados representativos apresentam duas cepas diferentes de Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), e uma cepa de campo isolada da Flórida com mutações conhecidas de resistência ao knockdown F1534C e V1016I (genótipo IICC). Além disso, drosophila melanogaster (cepa Canton: S) é destaque.
As figuras 2 e figura 3 ilustram a resposta da dose de cada organismo por cepa e sexo testados seguindo o protocolo acima. Como não foram observadas diferenças entre as curvas dose-resposta dos mosquitos machos e fêmeas dentro de cada cepa (t = 1,70, p = 0,098 para ROCHA e t = 0,64, p = 0,527 para IICC), foram agrupados dados de ambos os sexos dentro de cada cepa de mosquito. Os LD50 relativizados em massa para ROCK e IICC são de 0,008 ng/mg (IC 95%: 0-0,104) e 0,336 ng/mg (IC 95%: 0,235-0,438), respectivamente. Os 95% de CIs desses valores não se sobrepõem, indicando respostas de dose significativamente diferentes das cepas. A RR da cepa IICC (em relação à cepa ROCK) é de 41,7, que segundo a OMS, é considerada altamente resistente5. Para as moscas de frutas Canton-S, o LD50 relativizado em massa é de 0,213 ng/mg (IC 95%: 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Figura 2: Dados representativos de mosquitos utilizando bioensaio de aplicação tópica. Dados representativos de dose-resposta do bioensaio de aplicação tópica seguindo o protocolo acima utilizando deltametrina e mosquitos: (A) fêmea Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 550) cepas, (B) variedades macho Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 569). As concentrações de teste de deltametrina variaram de 0,00075 ng/μL a 9,68705 ng/μL, e a dose de deltametrina aplicada (ng) por massa média de mosquito (mg) é refletida no eixo x. A mortalidade é mostrada como proporção no eixo y. A linha preta através de cada cluster de ponto de dados representa a tensão e a regressão linear específica do sexo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Figura 3: Dados representativos de moscas-das-frutas usando bioensaio de aplicação tópica. Dados representativos de dose-resposta do bioensaio de aplicação tópica seguindo o protocolo acima usando deltametrina e moscas de frutas: cepa D. melanogaster Canton-S (n = 1014). As concentrações de teste de deltametrina variaram de 0,00499 a 5,02876 ng/μL, e a dose de deltametrina aplicada (ng) por massa média de mosca de fruta (mg) é refletida no eixo x. A mortalidade é mostrada como proporção no eixo y. A linha preta representa a regressão linear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar S1: Tenda de manuseio de insetos benchtop. A tenda de manuseio de insetos benchtop é usada para facilitar a captura de mosquitos ou moscas durante o ensaio de aplicação atual. Estrutura é fechada em A e aberta em B. Esta estrutura foi construída com tubo de PVC e tecido de malha fina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura Suplementar S2: Unidade aplicadora de seringa e repetidor. Unidade aplicadora de seringa e repetidor usada para dosar insetos. As peças principais incluem agulha 1), 2) cano de seringa, 3) êmbolo, 4) repetidor e 5) botão repetidor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo suplementar 1: script de randomização: Script de randomização para criar rótulos não tendenciosos para todas as xícaras de cada experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Folha de pontuação de mortalidade: Folha de pontuação de mortalidade para auxiliar na avaliação da mortalidade. A folha também inclui locais para registrar todas as outras informações importantes para registrar, como referenciado no protocolo, como o início e o fim da aplicação de inseticida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo suplementar 3: Exemplos de dados de mortalidade: Exemplo arquivo de dados usado para criar Figura 2. As descrições de títulos da coluna são as seguintes: "id" = código de identificação de cada ponto de dados; "espécies" = nome da espécie (por exemplo, Aedes aegypti); "inseticida" = nome do inseticida topicamente aplicado (por exemplo, Deltametrina); "cepa" = nome da cepa de mosquito (por exemplo, ROCK); "data" = aplicação atual da data de início; "sexo" = sexo de mosquitos; "idade" = idade dos mosquitos (jovem = 3-5 dias de idade; velho = 4 semanas de idade); "total.mosq" = número total de mosquitos pesados em lote; "peso" = peso (mg) de todos os mosquitos dentro do lote; "concentração" = concentração de inseticida (μg/mL); "seringa" = volume de gotícula (mL) de seringa; "dose" = quantidade de ingrediente ativo de inseticida aplicado a cada mosquito (ng); "total" = número de mosquitos em cada xícara; "morto" = número de mosquitos mortos em cada xícara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo suplementar 4: Código de análise R: Exemplo R código que pode ser usado para completar a análise Probit (conforme descrito na etapa 8 do protocolo). Os resultados representativos (acessíveis através do arquivo de dados de exemplo suplementar) podem ser usados com este código R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

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Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Descrevemos a metodologia e a importância do bioensaio de aplicação tópica para medir a suscetibilidade de inseticidas em mosquitos e moscas frutíferas. O ensaio apresentado é de alto rendimento, utiliza massa de insetos - permitindo assim calcular uma dose letal relativizada em massa em vez de concentração - e provavelmente tem menor variabilidade do que outros métodos semelhantes.

Bioensaio de aplicação tópico para quantificar toxicidade de inseticida para mosquitos e moscas de frutas

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Aplicando diretamente o inseticida no inseto e não através do contato superficial, há uma variação mínima na exposição a inseticidas, e isso nos permite medir o perfil de suscetibilidade das populações de mosquitos com mais precisão. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite calcular doses letais relativizadas em massa de um inseticida em vez de concentrações letais, o que melhora muito as comparações de razão de resistência. Tenha cuidado para armazenar os inseticidas corretamente, evite contaminar suas ferramentas e certifique-se de que as peças de seringa estejam em boa forma.Isso vai ajudá-lo a obter resultados consistentes. Para começar, remova as soluções necessárias de inseticidas do congelador. Imediatamente vórtice da solução ou inverter cinco vezes, e colocá-la em um recipiente resistente à luz à temperatura ambiente para deixar os inseticidas aquecer à temperatura ambiente antes de usar.Coloque cinco tubos de microcentrifus de microcentragem com 0,5 mililitros de acetona cada. Encha o barril de seringa completamente com acetona do primeiro tubo. Em seguida, expelir a acetona em um recipiente de resíduos empurrando rapidamente para baixo no êmbolo, e repita mais quatro vezes para completar um total de cinco lavagens de acetona da mesma alíquota de acetona.Em seguida, encha o barril de seringa completamente com ar, e expulse o ar e potenciais restos de acetona para dentro do recipiente de resíduos. Repita mais duas vezes para completar três lavagens com ar. Crie um bolsão de ar dentro do cano entre o êmbolo da seringa e o topo da agulha puxando o êmbolo de aproximadamente cinco milímetros para dentro do barril.Rotule os copos de plástico com a ID aleatória para avaliação de mortalidade cega. Usando um aspirador alimentado por sucção por inalação, aspire o número desejado de mosquitos adultos de três a cinco dias de idade. Coloque a ponta do aspirador no tubo com algodão enrolado na ponta.Exale suavemente e toque no aspirador para transferir os mosquitos para um tubo cônico. Use o algodão para tampar o tubo quando a ponta do aspirador for removida e, em seguida, tampar com a tampa. Derrube brevemente os mosquitos nos tubos, colocando-os por um mínimo de 10 minutos a quatro graus Celsius ou enterrando-os sob o gelo em uma bandeja de gelo.Transfira os mosquitos derrubados para a tenda de manuseio de insetos. Coloque cuidadosamente os mosquitos em uma bandeja de plástico colocada no gelo, e despeje cerca de 50 mosquitos de cada vez para garantir que cada um toque na bandeja fria abaixo dela e permaneça derrubado. Classifique os mosquitos por sexo, pegando-os suavemente pelas pernas ou asas com fórceps, seguido de colocar cada sexo em um copo de retenção separado, e parar quando o número desejado for atingido.Durante a triagem, remova todos os mosquitos que estejam feridos ou sejam extra grandes ou pequenos. Para registrar o peso do copo de mosquito, coloque um copo vazio com uma placa de Petri como uma tampa na balança, e coloque a balança. Despeje os mosquitos no recipiente e coloque a tampa em cima.Coloque o recipiente na balança e regise o peso final, juntamente com o número de mosquitos. Coloque imediatamente a xícara de espécimes de volta no gelo para mantê-los imobilizados até que todas as xícaras do espécime sejam pesadas. Divida os mosquitos preparados em cinco a 10 xícaras separadas colocadas no gelo, rotuladas com identidades aleatórias.Use pinças e um contador portátil para alcançar 20 a 25 mosquitos por xícara. Para classificar as moscas das frutas, anestesiar as moscas usando dióxido de carbono por sete segundos. Despeje as moscas em uma bolsa de gelo embrulhada em papel de banco.Usando um pincel fino, separe e conte os machos e fêmeas. Use o pincel para pegar suavemente as moscas escolhidas e colocá-las em uma garrafa de estoque limpa e vazia. Depois de escolher o mesmo número de moscas de frutas machos e fêmeas, rotule as garrafas de estoque com o nome da cepa e o total da mosca da fruta.Anestesiar a garrafa de moscas de frutas usando dióxido de carbono por sete segundos. Despeje as moscas da fruta sobre o papel de pesagem, e use o papel como funil para introduzir as moscas em um frasco tared rotulado com uma ID aleatória.Depois de colocar a tampa da placa de Petri em cima do frasco de moscas de frutas, coloque-a na balança. Registo o peso combinado e o número de espécimes na folha de pontuação.Coloque imediatamente o frasco de moscas de frutas em uma bandeja de gelo com a tampa ainda em cima para evitar que as moscas escapem. Carregue a seringa com a concentração adequada de inseticidas, começando com a dose menos concentrada e trabalhe para a dose mais concentrada com cada grupo de organismos. Coloque os espécimes sobre papel de pesagem colocado em cima de uma bandeja no gelo.Separe os espécimes que estão próximos usando um pincel limpo sem inseticidas ou um cotonete de algodão para permitir fácil acesso a cada espécime para dosagem. Utilizando a seringa, aplique uma gota de solução de inseticida no tórax ventral e na área do abdômen para mosquitos e dorso para moscas frutíferas. Despeje imediatamente os espécimes de volta no copo de plástico rotulado.Cubra o copo com rede e um elástico. Observe que um espécime atualizado conta com o copo se algum espécime foi morto, danificado ou escapou neste processo. Coloque o copo completo em uma bandeja de retenção.Para a primeira xícara, registo o tempo em que a dosagem é concluída. Repita a dosagem para cada xícara até que todos os espécimes tenham sido dosados com as concentrações adequadas de inseticidas, e regise o tempo final quando todos os espécimes tiverem sido dosados. Forneça 10% de solução de sacarose para cada xícara através de uma bola de algodão molhado, e armazene os mosquitos e moscas de frutas na temperatura e umidade desejadas.Registo da mortalidade por amostra em 24 horas após o início da exposição a inseticidas. Classificar os mosquitos como vivos se eles podem voar e se manter em pé e mortos se eles são imóveis ou ataxicos, como descrito pela OMS. Siga a mesma avaliação de mortalidade para moscas frutíferas.Após a realização do bioensaio, foram obtidos dados de resposta de dose com duas cepas que são o genótipo Rockefeller e IICC para o Aedes aegypti masculino e feminino. A dose letal mediana relativizada em massa para Rockefeller e IICC foi de 0,008 e 0,336 nanogramas por miligrama, respectivamente. Os resultados não revelaram diferenças entre as curvas de resposta da dose de mosquitos femininos e machos dentro de cada cepa.Portanto, os dados de ambos os sexos foram combinados para calcular os valores médios da dose letal. Como os intervalos de confiança de 95% para a dose letal mediana dessas duas cepas não se sobrepuseram, esses valores foram considerados significativamente diferentes. Além disso, ao calcular as razões resistentes, a cepa IICC foi mais de 40 vezes mais resistente do que a cepa Rockefeller suscetível.Também foram obtidos dados de resposta de dose para mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, cepa Canton-S, e a dose letal mediana relativizada em massa foi encontrada em 0,213 nanogramas por miligrama. A consistência é fundamental, especialmente ao armazenar e aplicar o inseticida e avaliar a mortalidade. Além disso, tome cuidado ao manusear a amostra para evitar danos ou morte não induzida pelo inseticida.Com este método, podemos agora determinar com precisão a resistência técnica de uma população de mosquitos e como as condições ambientais impactam a resistência ou como a resistência técnica prevê resistência prática.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Agressão a estudar em Drosophila (mosca da fruta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Biologia

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Bioensaios de Resistência a Inseticidas Monitoramento

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Um protocolo Optimizado para Criação Fopius arisanus, Um parasitóide de Frutas Tephritid Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolamento e Estudo de Biofísica de Cutículas Frutas

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Técnicas para induzir e quantificar a senescência celular

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Laboratório de criação de moscas estáveis e outros Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...