Name: topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Это исследование было поддержано премией CAREER Национального научного фонда SH под номером 2047572. Мы благодарим Дэмиена Риверу за его помощь в выращивании плодовой мухи и подготовке к местному анализу применения, доктора Ганецки из Университета Висконсин-Мэдисон за то, что он поделился своим штаммом плодовой мухи Кантон-S, Центры по контролю и профилактике заболеваний за совместное использование штамма Рокфеллера и Центр медицинской сельскохозяйственной и ветеринарной энтомологии Министерства сельского хозяйства США за совместное использование изолинового штамма IICC. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комары несут ответственность за более чем 700 000 смертей каждый год из-за болезней, которые они передают людям, причем более половины этих смертей вызваны только малярией1. Основным профилактическим методом против передачи малярии и других трансмиссивных болезней является использование инсектицидов, часто в форме инсектицидных сеток длительного пользования или остаточного распыления внутри помещений2. Однако устойчивость к инсектицидам широко распространена среди комаров и других насекомых-переносчиков, а также сельскохозяйственных вредителей 3,4. Для эффективного управления сопротивлением эпиднадзор имеет ключевое значение5. Для этого необходимы высокоточные и высокопроизводительные методы обнаружения сопротивления. В настоящее время наиболее распространенными инструментами эпиднадзора за устойчивостью комаров к инсектицидам являются тест6 в трубке ВОЗ и биоанализ из бутылок CDC7. Для плодовых мушек метод остаточного контактного применения (аналогичный биоанализу бутылки CDC) представляет собой широко используемый биоанализ инсектицидов 8,9,10. Тем не менее, вариабельность данных этих методов, как правило, высока, причем измерения одного и того же лабораторного штамма комаров варьируются от ~ 20-70% смертности в анализах бутылок CDC и 0-50% в пробных тестах ВОЗ при воздействии сублетальных доз11. Такая вариация удивительна, поскольку ожидается, что ограниченная генетическая изменчивость большинства лабораторных штаммов приведет к ограниченной изменчивости восприимчивости к инсектицидам в популяции. Тем не менее, по-прежнему наблюдается высокий уровень вариаций в результатах биоанализа.
Потенциальные источники этой изменчивости могут быть результатом гетерогенного воздействия инсектицидов между образцами в рамках биоанализа из-за косвенного воздействия инсектицидов через поверхность, гетерогенного воздействия окружающей среды, нормальной биологической изменчивости между особями одного и того же генотипа и изменения массы образцов одной и той же популяции12. . Редко используемым методом с более высокой воспроизводимостью является топический прикладной биоанализ. В этом анализе инсектицид наносится непосредственно на каждое насекомое13,14, устраняя фактор гетерогенного воздействия различных образцов в пределах одного и того же анализа. Однако из-за медленной пропускной способности этого метода он обычно не используется в качестве инструмента наблюдения за восприимчивостью к инсектицидам для популяций комаров. В данной работе представлен модифицированный протокол для местного применения биоанализа, который позволяет проводить воздействия с более высокой пропускной способностью, а также корректирует изменение массы насекомых, параметр, который коррелирует с изменениями восприимчивости к инсектицидам12. Снижение уровня шума и связанных с массой колебаний данных о смертности в результате переменного воздействия инсектицидов позволило бы обеспечить более точный технический эпиднадзор за устойчивостью 11,15. Такие данные могут быть использованы для более точного связывания фенотипической резистентности с генетическими маркерами, параметрами приспособленности и/или векторной компетентностью. Кроме того, мы демонстрируем, как этот анализ может быть легко адаптирован к другим видам насекомых, используя биоанализ местного применения на плодовых мухах, видах насекомых с меньшим телом.
Основным ограничением вышеупомянутых применений остаточного контакта является то, что воздействие инсектицидов может варьироваться от образца к образцу в пределах одного и того же анализа. В случае биоанализов в бутылках CDC и контактного метода воздействие инсектицидов может варьироваться между репликами одного и того же анализа. Насекомые подвергаются воздействию инсектицида, который либо распределяется на внутренней стороне стеклянной бутылки (метод биоанализа и контакта с бутылками CDC), либо на пропитанной бумаге (тест пробирки ВОЗ). Концентрация инсектицида на обеих поверхностях (стеклянной и бумажной) известна и предопределена путем скрининга различных видов известных генотипов. Однако количество, потенциально поглощаемое насекомым, может сильно варьироваться в зависимости от используемой поверхности, компонентов смеси инсектицидов и того, насколько однородно инсектицид распределен по поверхностному материалу16,17. В биоанализе бутылки CDC инсектицидное покрытие на внутренней стороне бутылки зависит от процедур, используемых каждой лабораторией и пользователем. В пробирке ВОЗ обработанные инсектицидами бумаги производятся централизованно и, таким образом, скорее всего, довольно однородны в разных лабораториях. Однако в пробке ВОЗ экспозиционная трубка позволяет образцам приземляться и опираться на металлическую сетку, не подвергающуюся воздействию инсектицидов, что приводит к потенциальному воздействию гетерогенных инсектицидов среди образцов в рамках каждого теста. Фактическое количество инсектицида, собранного и поглощенного образцами с помощью каждого метода, еще предстоит изучить18.
Кроме того, биоанализ бутылки CDC, тест ВОЗ в пробирке и контактный метод чаще всего используются в качестве пороговых анализов, проверяющих только одну заранее определенную концентрацию инсектицида. Этот подход может точно обнаружить наличие резистентности и полезен для наблюдения за устойчивостью (особенно когда устойчивость распространяется). Тем не менее, пороговые анализы не могут количественно оценить силу сопротивления, что может быть более прогностическим для эффективности инструментов вмешательства. Если с этими методами используются множественные концентрации инсектицидов, то они могут быть использованы в качестве анализов интенсивности. Анализ интенсивности для биоанализа в бутылке CDC и теста ВОЗ в пробирке был введен путем тестирования в 5 и 10 раз больше предопределенных дискриминирующих дозировок для устранения этого разрыва в эпиднадзоре 6,19. Обеспечивая большую способность дифференцировать резистентные популяции, 3-5 (предопределенные) дозы обеспечивают ограниченное разрешение для расчета летальных концентраций. Кроме того, в таких анализах используются комары различных размеров. Тем не менее, массу важно измерить, поскольку более крупным образцам может потребоваться более высокая доза для уничтожения, поскольку эффективная доза на единицу массы будет намного ниже, чем у меньшего организма12. Расчет релятивизированной массы смертельной дозы (количество инсектицида на массу насекомого) был бы более полезным показателем, чем более распространенная смертельная концентрация (например, количество инсектицида на площадь поверхности), поскольку он учитывает различия массы насекомых между полами, популяциями и генотипами. Такие данные помогут заполнить пробел между генотипической и фенотипической устойчивостью в лаборатории и на местах, а также могут обеспечить простой способ расчета необходимой концентрации для обработки популяции насекомых известной средней массы.
Использование массово-релятивизированных смертельных доз, которые убивают 50% образцов (LD50), также включает в себя несколько других преимуществ. Оценка токсичности конкретного соединения в мг/кг (= нг/мг) является стандартной в токсикологии человека и ветеринарии14, а значения LD50 указаны в паспортах безопасности материалов. Смертельные дозы также позволяют напрямую сравнивать токсичность различных химических веществ по отношению к определенному виду или одного и того же химического вещества к различным видам20, а также высококачественную оценку новых инсектицидов и химических веществ13. Кроме того, LD50 может обеспечить более значимые и точные соотношения резистентности, чем те, которые получены из результатов смертности от диагностических доз, что может привести к переоценке уровня резистентности, присутствующего в популяции. Таким образом, этот анализ будет подходить для рутинных программ эпиднадзора, обеспечивая более строгий мониторинг резистентности на основе массовых релятивизированных смертельных доз, полученных из большего количества образцов, чем рекомендовано для других биоанализов21.
Метод местного применения был использован в эпиднадзоре за восприимчивостью к инсектицидам у комаров и мух в качестве альтернативы стандартным биоанализам на восприимчивость к инсектицидам, когда устойчивость уже известна или подозревается22,23, а также для наблюдения за некоторыми насекомыми-вредителями24 для более точной оценки профилей устойчивости и внутренней токсичности инсектицидов21 . При местном применении биоанализа инсектицид наносится на каждый организм, что приводит к минимальным изменениям в воздействии инсектицидов. В настоящем документе представлен слегка адаптированный и улучшенный метод, который позволяет применять инсектицидное воздействие на большое количество насекомых в течение короткого периода времени, а также контролировать массу насекомых22. Этот высокопроизводительный метод с хорошими уровнями воспроизводимости может стать полезным дополнительным инструментом для рутинного эпиднадзора за восприимчивостью к инсектицидам.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

Продолжающееся использование инсектицидов для общественного здравоохранения и сельского хозяйства привело к широкому распространению устойчивости к инсектицидам и затруднению методов борьбы. Эпиднадзор за устойчивостью к инсектицидам популяций комаров обычно осуществляется с помощью центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) бутылочных биоанализов или пробных тестов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Однако эти методы могут привести к высокой степени изменчивости данных о смертности из-за переменного контакта инсектицидов с насекомым, относительно небольшого числа протестированных организмов, обширных колебаний массы между популяциями и постоянно меняющихся условий окружающей среды, что приводит к переменным результатам. В этой статье представлен актуальный прикладной биоанализ, адаптированный в качестве высокопроизводительного фенотипического биоанализа как для комаров, так и для плодовых мух, для тестирования большого количества насекомых в диапазоне концентраций инсектицидов.
Этот анализ 1) обеспечивает постоянную обработку и контакт инсектицидов с каждым организмом, 2) дает высокоспецифичные кривые «доза-реакция», которые учитывают различия в средней массе между штаммами и полами (что особенно важно для организмов, собранных в полевых условиях), и 3) позволяет рассчитывать статистически строгие средние смертельные дозы (LD50). ), которые необходимы для сравнения соотношения резистентности - альтернативный подход к эпиднадзору за смертностью от диагностических доз, который также используется для эпиднадзора за устойчивостью к ларвицидам. Этот анализ будет дополнительным инструментом для точного фенотипирования популяций комаров и, как показано на примере плодовых мушек, легко адаптируется для использования с другими насекомыми. Мы утверждаем, что этот анализ поможет заполнить пробел между генотипической и фенотипической устойчивостью к инсектицидам у нескольких видов насекомых.

Эти репрезентативные результаты показывают два различных штамма Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) и изолированный полевой штамм из Флориды с известными мутациями нокдаун-резистентности F1534C и V1016I (генотип IICC). Кроме того, представлена Drosophila melanogaster (кантон: штамм S).
Рисунки 2 и 3 иллюстрируют дозовую реакцию каждого организма по штаммам и полу, протестированным в соответствии с вышеуказанным протоколом. Поскольку не наблюдалось различий между кривыми «доза-реакция» самцов и самок комаров в пределах каждого штамма (t = 1,70, p = 0,098 для ROCK и t = 0,64, p = 0,527 для IICC), данные от обоих полов в пределах каждого штамма комаров были объединены. Массовая релятивизированнаяLD 50 для ROCK и IICC составляет 0,008 нг/мг (95% ДИ: 0-0,104) и 0,336 нг/мг (95% ДИ: 0,235-0,438), соответственно. 95% QI этих значений не перекрываются, что указывает на значительно отличающиеся дозовые реакции штаммов. ОР штамма IICC (относительно штамма ROCK) составляет 41,7, что по данным ВОЗ, считается высокоустойчивым5. Для плодовых мушек Кантон-S массовая релятивизированная LD50 составляет 0,213 нг/мг (95% ДИ: 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативные данные о комарах с использованием биоанализа местного применения. Репрезентативные данные о дозе-ответе от местного применения биоанализа в соответствии с вышеуказанным протоколом с использованием дельтаметрина и комаров: (A) женские штаммы Ae. aegypti ROCK (n = 880) и IICC (n = 550), (B) мужские штаммы Ae. aegypti ROCK (n = 880) и IICC (n = 569). Концентрации тестирования дельтаметрина варьировались от 0,00075 нг/мкл до 9,68705 нг/мкл, а доза примененного дельтаметрина (нг) на среднюю массу комара (мг) отражается на оси х. Смертность показана в пропорции по оси Y. Черная линия, проходящая через каждый кластер точек данных, представляет собой линейную регрессию, специфичную для деформации и пола. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативные данные плодовых мушек с использованием местного применения биоанализа. Репрезентативные данные о дозе-ответе от местного применения биоанализа в соответствии с вышеуказанным протоколом с использованием дельтаметрина и плодовых мушек: штамм D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Концентрации в ходе испытаний дельтаметрина варьировались от 0,00499 до 5,02876 нг/мкл, а доза примененного дельтаметрина (нг) на среднюю массу плодовой мухи (мг) отражается на оси X. Смертность показана в пропорции по оси Y. Черная линия представляет линейную регрессию. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный рисунок S1: Настольная палатка для обработки насекомых. Настольная палатка для обработки насекомых используется для более легкого отлова убегающих комаров или мух во время местного анализа применения. Структура закрыта в А и открыта в В. Эта конструкция была построена из трубы ПВХ и тонкоячеистой ткани. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный рисунок S2: Аппликатор шприца и ретранслятора. Шприц и ретранслятор аппликатора используются для дозирования насекомых. Основные части включают в себя 1) иглу, 2) шприц-ствол, 3) плунжер, 4) ретранслятор и 5) кнопку ретранслятора. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 1: Скрипт рандомизации: Скрипт рандомизации для создания непредвзятых меток для всех чашек каждого эксперимента. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 2: Оценочный лист смертности: Оценочный лист смертности для облегчения оценки смертности. Лист также включает в себя места для записи всей другой важной информации для записи, как указано в протоколе, такой как время начала и окончания применения инсектицидов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 3: Пример данных о смертности: Пример файла данных, использованного для создания рисунок 2. Описания заголовков столбцов являются следующими: "id" = идентификационный код каждой точки данных; "вид" = видовое название (например, Aedes aegypti); "инсектицид" = наименование инсектицида, применяемого местно (например, дельтаметрин); "штамм" = название штамма комаров (например, ROCK); "date" = дата начала актуальной заявки; "пол" = пол комаров; «возраст» = возраст комаров (детеныш = 3-5-дневный; старый = 4 недели); "total.mosq" = общее количество комаров, взвешенных партиями; "вес" = вес (мг) всех комаров в партии; "концентрация" = концентрация инсектицида (мкг/мл); "шприц" = объем капель (мл) шприца; "доза" = количество инсектицидного активного ингредиента, применяемого к каждому комару (нг); "всего" = количество комаров в каждой чашке; "dead" = количество мертвых комаров в каждой чашке. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 4: Код анализа R: Пример кода R, который можно использовать для завершения анализа Probit (как описано в шаге 8 протокола). Репрезентативные результаты (доступные через дополнительный файл данных примера) могут быть использованы с этим кодом R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Мы описываем методологию и важность местного применения биоанализа для измерения восприимчивости к инсектицидам у комаров и плодовых мух. Представленный анализ является высокопроизводительным, использует массу насекомых, что позволяет рассчитать массу релятивизированной смертельной дозы вместо концентрации и, вероятно, имеет более низкую изменчивость, чем другие подобные методы.

Местное применение Биоанализ для количественной оценки токсичности инсектицидов для комаров и плодовых мух

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

При непосредственном нанесении инсектицида на насекомое, а не через поверхностный контакт, существует минимальное изменение воздействия инсектицидов, и это позволяет нам более точно измерять профиль восприимчивости популяций комаров. Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет рассчитывать массово-релятивизированные летальные дозы инсектицида, а не летальные концентрации, что значительно улучшает сравнение коэффициентов резистентности. Будьте осторожны, чтобы правильно хранить инсектициды, избегать загрязнения ваших инструментов и убедитесь, что части шприца находятся в хорошей форме.Это поможет вам получить последовательные результаты. Для начала извлеките необходимые растворы инсектицидов из морозильной камеры. Немедленно вихрьте раствор или инвертируйте пять раз и поместите его в светостойкий контейнер при комнатной температуре, чтобы инсектициды нагрелись до комнатной температуры перед использованием.Установите пять микроцентрифужных трубок с 0,5 миллилитрами ацетона каждая. Наполните ствол шприца полностью ацетоном из первой трубки. Затем выбросьте ацетон в контейнер для отходов, быстро надавив на плунжер, и повторите еще четыре раза, чтобы завершить в общей сложности пять промывок ацетона из той же ацетоновой аликвоты.Затем заполните ствол шприца полностью воздухом и выбросьте воздух и потенциальные остатки ацетона в контейнер для отходов. Повторите еще два раза, чтобы завершить три промывки воздухом. Создайте воздушный карман внутри ствола между плунжером шприца и верхней частью иглы, подтянув плунжер примерно на пять миллиметров в ствол.Пометьте пластиковые стаканчики случайным идентификатором для оценки смертности слепых. Используя аспиратор, приводимый в действие всасыванием от ингаляции, аспирируйте нужное количество трех-пятидневных взрослых комаров. Поместите наконечник аспиратора в трубку с хлопком, обернутым вокруг наконечника.Осторожно выдохните и постучите по аспиратору, чтобы перенести комаров в коническую трубку. Используйте вату, чтобы заткнуть трубку, когда наконечник аспиратора удален, а затем крышкой крышки. Ненадолго сбивайте комаров в трубках, помещая их минимум на 10 минут при четырех градусах Цельсия или закапывая под лед в лоток для льда.Перенесите сбитых комаров в палатку для обработки насекомых. Осторожно выложите комаров на пластиковый лоток, помещенный на лед, и вылейте около 50 комаров за раз, чтобы каждый из них коснулся прохладного лотка под ним и оставался сбитым с ног. Сортируйте комаров по полу, осторожно подбирая их за ноги или крылья щипцами, а затем помещая каждый пол в отдельную чашку для хранения, и останавливайтесь, когда желаемое число будет достигнуто.Во время сортировки удалите всех комаров, которые травмированы или являются очень большими или маленькими. Чтобы записать вес чашки комара, поместите пустую чашку с чашкой Петри в качестве крышки на весы и нанесите на весы тару. Вылейте комаров в контейнер и поместите крышку сверху.Поместите контейнер на весы и запишите окончательный вес вместе с количеством комаров. Немедленно поместите чашку образцов обратно на лед, чтобы держать их обездвиженными, пока все чашки образца не будут взвешены. Разделите подготовленных комаров на пять-10 отдельных стаканчиков, помещенных на лед, помеченных случайными идентификаторами.Используйте пинцет и ручной счетчик, чтобы получить от 20 до 25 комаров на чашку. Чтобы отсортировать плодовых мушек, обезбольте мух с помощью углекислого газа в течение семи секунд. Вылейте мух на пакет со льдом, завернутый в скамейку.Используя кисть с мелким наконечником, разделите и посчитайте самцов и самок. Используйте кисть, чтобы аккуратно подобрать выбранных мух, и поместите их в чистую, пустую бутылку. После выбора равного количества самцов и самок плодовых мушек, маркируйте бутылки с названием штамма и общим количеством плодовой мухи.Обезболить бутылку плодовых мушек с помощью углекислого газа в течение семи секунд. Вылейте плодовых мушек на бумагу для взвешивания и используйте бумагу в качестве воронки, чтобы ввести мух в заостренный флакон, помеченный случайным идентификатором.Поместив крышку чашки Петри поверх флакона плодовых мушек, поместите его на весы. Запишите совокупный вес и количество образцов в оценочном листе.Немедленно поместите флакон плодовых мушек в лоток со льдом с крышкой сверху, чтобы мухи не могли убежать. Загрузите шприц с правильной концентрацией инсектицидов, начиная с наименее концентрированной дозы и работая в направлении наиболее концентрированной дозы с каждой группой организмов. Опрокидывайте образцы на бумагу для взвешивания, помещенную поверх лотка на льду.Отделите образцы, которые находятся близко друг к другу, используя чистую кисть без инсектицидов или ватный тампон, чтобы обеспечить легкий доступ к каждому образцу для дозирования. С помощью шприца нанесите одну каплю раствора инсектицида на вентральную грудную клетку и область брюшка для комаров и спинку для плодовых мушек. Немедленно вылейте образцы обратно в маркированный пластиковый стаканчик.Накройте чашку сеткой и резинкой. Обратите внимание на обновленное количество образцов на чашке, если какие-либо образцы были убиты, повреждены или спасены в этом процессе. Поместите готовую чашку в лоток для хранения.Для первой чашки запишите время, когда дозировка завершена. Повторяйте дозирование для каждой чашки до тех пор, пока все образцы не будут дозированы с надлежащими концентрациями инсектицидов, и запишите время окончания, когда все образцы были дозированы. Внесите 10% раствор сахарозы в каждую чашку с помощью влажного ватного тампона и храните комаров и плодовых мушек при желаемой температуре и влажности.Регистрирует смертность образцов через 24 часа после начала воздействия инсектицидов. Классифицируйте комаров как живых, если они могут летать и держать себя в вертикальном положении, и мертвых, если они неподвижны или атаксические, как описано ВОЗ. Следуйте той же оценке смертности плодовых мушек.После выполнения биоанализа были получены данные о дозовом ответе с двумя штаммами, которые являются генотипом Рокфеллера и IICC для мужского и женского Aedes aegypti. Массовая релятивизированная средняя смертельная доза для Рокфеллера и IICC составила 0,008 и 0,336 нанограмма на миллиграмм соответственно. Результаты не выявили различий между кривыми дозовой реакции самок и самцов комаров в пределах каждого штамма.Поэтому данные обоих полов были объединены для расчета средних значений смертельной дозы. Поскольку 95%-ные доверительные интервалы для медианной смертельной дозы этих двух штаммов не перекрывались, эти значения считались существенно отличающимися. Кроме того, при расчете коэффициентов резистентности штамм IICC был более чем в 40 раз более устойчивым, чем восприимчивый штамм Рокфеллера.Также были получены данные о реакции на дозу для плодовой мухи, Drosophila melanogaster, штамма Canton-S, и было обнаружено, что массовая релятивизированная средняя смертельная доза составляет 0,213 нанограмма на миллиграмм. Последовательность имеет решающее значение, особенно при хранении и применении инсектицида и оценке смертности. Кроме того, будьте осторожны при обращении с образцом, чтобы избежать вреда или смерти, не вызванной инсектицидом.С помощью этого метода мы теперь можем точно определить техническую устойчивость популяции комаров и то, как условия окружающей среды влияют на устойчивость или как техническая устойчивость предсказывает практическую устойчивость.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Изучение агрессии у дрозофилы (дрозофил)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Биопробы для мониторинга резистентности к инсектицидам

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Оптимизированный протокол для разведения Fopius arisanus, Паразитоид из Tephritid плодовых мух

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Изоляция и биофизических исследований фруктов кутикул

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Анализ Multi-обнаружения малярии комарами

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Методы индуцируют и Quantify Cellular Старение

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Лаборатория воспитания стабильной мух и других Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Протоколы для испытания на токсичность новых инсектицидных химия комаров

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Носовые разности потенциалов для количественного определения транс эпителиальных ионный транспорт в мышей

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Вынуждены слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции комаров

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...