Name: topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Denna forskning stöddes av en CAREER-utmärkelse från National Science Foundation till SH under prisnummer 2047572. Vi tackar Damien Rivera för hans hjälp med fruktflugeuppfödning och förberedelse för aktuell applikationsanalys, Dr. Ganetzky vid University of Wisconsin-Madison för att dela sin Canton-S fruktflugstam, Centers for Disease Control and Prevention för att dela Rockefeller-stammen och USA: s Department of Agriculture Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology för att dela IICC-isolinstammen. Figur 1 skapades med BioRender.com.

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Detta dokument presenterar ett anpassat protokoll för den aktuella applikationsanalysen för myggor och fruktflugor. Denna procedur kan enkelt anpassas för att användas i fält och med andra organismer eftersom det kräver minimal specialutrustning. Nedan behandlas detta protokolls kritiska steg, potentiella ändringar, felsökningsråd, metodens begränsningar och betydelsen av denna metod.
Kritiska steg i protokollet: Det finns tre kritiska steg i protokollet som, om de fylls i felaktigt, drastiskt kan påverka resultaten av bioassayn: insekticidkoncentrationsnoggrannhet, provknockdown och dödlighetsbedömning.
Insekticidkoncentrationsnoggrannhet: Det är oerhört viktigt att ha exakta insekticidlösningar för att få replikerbara dos-responskurvor och meningsfulla resultat. Det volymetriska tillvägagångssättet för beredning av insekticidlösning är vanligare inom litteraturen för både CDC-flaskbioassay7 och aktuellaapplikationer 13,14,43. Det gravimetriska tillvägagångssättet som beskrivs här är emellertid i sig mer exakt på grund av hänsyn till temperatur genom inkludering av (temperaturspecifik) densitet, vilket leder till mer exakt formuleringsberedning.
Exempel knockdown: Att slå ner proverna är en kritisk komponent i denna metod och möjliggör noggrann administrering av insektsmedlet och viktmätningar. Att slå ner organismer innehåller emellertid oundvikligen risken för fysisk stress och skada, vilket tidigarevisats 30. Var därför försiktig och uppmärksam när du slår ner proverna för att säkerställa att i) varje prov slås ner under en liknande varaktighet, ii) längden på knockdown hålls till ett minimum och iii) metoden för knockdown hålls konsekvent över alla exemplar. Dessutom rekommenderas att testa knockdown-metoden separat, före applicering av insektsmedel, för att säkerställa att metoden är framgångsrik och inte inducerar kontrolldödlighet större än 10%. Det första testet kan ta längre tid för en oerfaren användare, vilket leder till längre knockdown-tider. Var därför försiktig när du tolkar resultaten från de första analyserna.
Bedömning av dödlighet: Att bedöma dödligheten kan vara utmanande, särskilt när insektsmedlet inte helt dödar utan bara slår ner eller lemlästar myggan eller flugan. Därför är det viktigt att vara medveten om hur insektsmedlet påverkar målorganismen och ha en tydlig definition för "döda" (eller nedslagna) organismer innan man börjar. Dessutom rekommenderas att samma person bedömer dödligheten mellan doser och replikat för att minska variationen.
Ändringar av protokollet: Flera ändringar som beskrivs nedan kan tillämpas på detta protokoll för att förbättra dess mångsidighet och tillgänglighet.
Anpassning av analysen till mindre eller större insekter: Vid användning av mindre eller större prover rekommenderas att man applicerar en mindre eller större dosvolym insektsmedel. Som ett exempel anpassade vi myggprotokollet till bananflugor genom att minska dosen 0,5 μL till en dos på 0,2 μL. Se till att rätt sprutstorlek är vald för den valda dosvolymen.
Anpassa analysen till fältinsekter: Vid användning av fältinsekter kan det finnas mer variation i insektsstorlek. Därför skulle vägning av insekterna i mindre grupper (t.ex. per kopp) rekommenderas istället för som en stor grupp (t.ex. alla insekter som används för ett experiment). Detta kan hjälpa till att fånga den potentiella variationen i insekticidkänslighet i samband med skillnaderna i fältinsektmassa.
Modifieringar av utrustning: Insektshanteringstält: Doseringen av provet kan slutföras under ett insektshanteringstält som helt enkelt är konstruerat med PVC-rör och myggnät. Detta kan vara ett alternativ till ett slutet rum (t.ex. insektsmedel) och bidra till att eliminera potentiell insekticidförorening i områden där insektsuppfödning kan förekomma. Detta insektshanteringstält är lätt att bygga och billigt (~ $ 70). Alternativt kan en insektshanteringsbur köpas (~ $ 425).
Kylbord: Ispaket eller isbrickor kan användas för att slå ner provet och / eller hålla provet nedslaget.
Inkubator: Inkubatorer rekommenderas för uppfödning av provet och hållande provet i 24 timmar efter insekticidbehandling. Om en inkubator inte är tillgänglig kan den konstrueras. Utrustning som behövs för att bygga inkubatorn inkluderar en isolerad behållare, luftfuktare, värmekablar, fuktighets- och temperaturregulator och ett ljus, vilket bör ge upp till en total kostnad på ~ $ 170, som följer och utökar tidigare metoder44.
Hållkoppar: Även om plastkoppar används för att sortera och hålla det behandlade provet, skulle vaxfodrade papperskoppar eller glasbehållare vara lämpliga alternativ.
Organism och livsstadium modifiering: Denna metod är mycket anpassningsbar för användning med andra vektorer, insekter och / eller leddjur som Culex quinquefasciatus myggor32, husflugor32 och kackerlackor45, liksom icke-vuxna livsstadier, såsom mygglarver46.
Aktuell ändring av programplats: Denna metod beskriver applicering av insekticiden på den ventrala bröstkorgen och bukregionen för myggor (och dorsum för fruktflugor). Andra applikationsplatser kan dock användas så länge exponeringsplatsen är konsekvent. Konsistens är viktigt eftersom insekticidkänsligheten kan variera beroende på applikationsplats32.
Felsökningsråd: Den här metoden har flera steg som initialt är utmanande. Nedan beskrivs några av de vanligaste problemen man kan stöta på.
Läckande/avdunstande insektsmedel: Insekticider löses vanligen i aceton, en mycket flyktig förening. Detta innebär att aceton avdunstar snabbt vid rumstemperatur, vilket ökar insekticidkoncentrationerna över tiden. Om insekticidlösningarna verkar läcka eller avdunsta, gör om lösningarna, se till att rörets lock är på tätt och dubbelkontrollera att lagringsprotokollen följs korrekt (t.ex. parafilm används och rören förvaras upprätt). Om läckage kvarstår, försök att fylla rören med en lägre volym för att ge mer utrymme för volymförändringen som acetonen upplever vid olika temperaturer. Dessutom, om du använder aceton som lösningsmedel, se till att rören är klassade för acetonlagring (t.ex. FEP-, TFE- och PFA-plast). Om du använder hydrofoba insekticider, förvara lösningarna i glasflaskor (eftersom hydrofoba insekticider fäster vid glas mindre än plast). Det är också god praxis att markera lösningens menisk före lagring för att övervaka avdunstningen.
Vikt som driver på mikrobalans vid vägning av organismer: Om viktavläsningen på vågen driver (långsamt går upp eller ner) kan detta bero på statisk. Drift uppstår oftast vid vägning av organismer i plastartiklar, eftersom plast lätt kan hålla en statisk laddning. För att undvika detta kan ett vägningspapper placeras under plastbehållaren som vägs, eller en icke-plastbehållare som glas kan användas.
Onormala dödlighetsresultat: Det finns många sätt på vilka dödlighetsresultaten kan verka onormala, till exempel att observera hög dödlighet i kontrollerna eller hög / låg dödlighet under alla insekticiddoser. Granska följande fall för felsökning av varje scenario.
Hög kontrolldödlighet Om det finns hög dödlighet i kontrollgruppen (10% eller mer), utvärdera knockdown-metoden och hur länge proverna slås ner. Om möjligt, förkorta den tid under vilken proverna slås ner. Andra potentiella faktorer att ta hänsyn till för hög dödlighet i kontrollerna inkluderar i) kontroll av om inkubatorinställningarna är korrekta - onormala temperaturer och / eller fuktighet kan leda till ökad dödlighet. Temperatur och luftfuktighet bör kontrolleras med en oberoende datalogger. ii) Bedömning av insektshantering. Att hantera insekter för mycket eller för grovt kan leda till hög dödlighet. iii) Kontrollera om det inte finns någon insekticidkontaminering i 100% aceton som används för att behandla kontrollgruppen eller på instrumenteringen. Byt ut aceton och rengör alla instrument med aceton eller etanol. Undvik kontaminering genom att ofta byta handskar, förhindra spill och rengöra instrument. Observera att i tilläggsfil 3 dog högst två myggor inom kontrollkopparna (endast aceton). Denna dödlighetsnivå anses inte vara hög (den är mindre än 10%), och därför fanns det ingen anledning till oro.
Hög dödlighet i alla exponerade grupper (men inte i kontrollgrupper) Använd lägre koncentrationer av insektsmedel eller mindre dosvolymer för testning. De doser som används kan vara över den minsta dosen som inte kommer att inducera dödlighet. Använd flera 10-faldiga utspädningar för att identifiera rätt dosintervall och utesluta kontaminering. För att undvika kontaminering, börja dosera med den lägsta koncentrationen och arbeta mot den högsta koncentrationen. Se dessutom till att all utrustning som används rengörs regelbundet med aceton och / eller etanol, doserna som appliceras på provet är mycket små och även den minsta korskontaminering kan påverka resultaten.
Låg dödlighet i alla utsatta grupper Använd högre insekticidkoncentrationer. De doser som används kan alla vara för låga för att orsaka dödlighet i befolkningen. För att identifiera rätt dosintervall, utsätt proverna för flera fler 10-faldiga koncentrerade doser. Se till att insekticidlösningarna inte har gått ut eller försämrats (eventuellt på grund av hög temperatur eller ljusexponering). Om lösningarna har gått ut eller misstänks ha försämrats, gör om lösningarna och se till att lämpliga lagringsförhållanden följs.
Inkonsekvent dödlighet mellan replikat/dagar Den tid på dagen då insekter utsätts för insektsmedlet kan påverka den resistensnivå som uttrycks, särskilt för metabolisk resistens34. Upprepa detta protokoll under samma tidsfönster varje dag för att undvika tid på dagen som en potentiell variabel som bidrar till förändringar i dödligheten. Andra potentiella faktorer som bidrar till inkonsekvent dödlighet mellan replikat inkluderar i) prover som är differentiellt uppfödda mellan experiment. Se till att alla exemplar är av samma åldersintervall, uppfödda vid samma temperatur och liknande densiteter och livsmedelstillgänglighet. ii) insekticidkoncentrationer som försämras med tiden eller blir mer koncentrerade på grund av acetonavdunstning. Gör om lösningarna och säkerställ korrekta lagringsförhållanden. iii) Inkonsekvent dödlighetspoäng. Se till att samma person får dödlighet eller utveckla ett tydligt protokoll som ska användas konsekvent i hela teamet. Använd blind scoring för att minska bias i dödlighetspoäng.
Insekter som fastnar på sorteringsbrickans yta: Aceton reagerar på plast som används i detta protokoll, såsom petriskålar. Provet kommer sannolikt att fästa vid ytan om man använder aceton på petriskålar eller liknande plastytor. Denna vidhäftning kan undvikas genom att fodra sorteringsbrickan med vägningspapper eller använda en sorteringsbricka som inte är av plast. Dessutom kan kondens på ytan av plast i sorteringsbrickan eller hållarkopparna leda till att insekter fäster vid kondensationen, eller provet kan vara för kallt och potentiellt frysa till ytan. Justera knockdown-metoden för att minska kondens samtidigt som du förhindrar att proverna blir för kalla/frysta (t.ex. placera vägningspapper mellan proverna och plastsorteringsbrickan).
R-analysfel: När mortalitetsdata har samlats in kan en mängd komplikationer uppstå under analysen. Den vanligaste orsaken till att en R-kod inte kan slutföra åtgärderna för datafilen är att dataformatet inte matchar koden (t.ex. kolumnrubriker och/eller tomma celler). Om allvarligare komplikationer uppstår, se R-hjälpsidorna som är inbyggda i Rstudio35.
Begränsningar av den ovan beskrivna aktuella tillämpningsmetoden: Insekticidabsorption via topisk appliceringsmetod efterliknar inte naturlig exponering: Topisk applicering på den primära kroppen är inte det naturliga sättet att absorbera insektsmedel. I fältet absorberar insekter mestadels insekticider genom benen under den tid de är i kontakt med den insekticidbehandlade ytan eller på sina vingar genom små aerosolpartiklar47,48, snarare än en snabb exponering på den ventrala ytan. Den direkta appliceringen av en känd insekticiddos kommer emellertid att exakt fastställa ett fenotypiskt svar på insekticider, som behövs för genetiska och evolutionära studier eller jämförelser av insekticidkänslighet över rymden eller tiden. Därför är detta tillvägagångssätt fördelaktigt för att testa tekniskt motstånd men kommer inte direkt att mäta praktiskt motstånd (effekten av det faktiska interventionsverktyget i en fältinställning15). Det är dock viktigt att notera att de nuvarande standardmetoderna (t.ex. WHO-rörtester och CDC-flaskbioassays) inte heller kan fånga eller efterlikna aerosolexponering (dvs. genom dimma) insekticidexponering i fältet.
Aktuella applikationsanalyser kan endast bedöma kontaktabsorptionsinsekticider: Denna metod är avsedd för insekticider som arbetar genom kontakt och absorption av insektsmedlet och inte för användning med orala insekticider, såsom borsyra som vanligen används i attraktiva giftiga sockerbeten49.
Metodens betydelse: Den aktuella appliceringsmetoden bygger vidare på väletablerade standarder för insekticidbioassays genom att beräkna den dödliga dosen (inte koncentrationen) och mäta teknisk (inte praktisk) resistens15. Nedan ges fördelarna och nackdelarna med denna metod jämfört med befintliga insekticidkänslighetsanalyser.
Beräkning av dödlig dos: Denna metod bestämmer den dödliga dosen av insektsmedlet, snarare än den dödliga koncentrationen som CDC och WHO bioassays använder för att fastställa den diskriminerande dosen11. Den dödliga dosen är mer meningsfull eftersom det är en kvantifierad mängd insektsmedel som är känd för att framkalla dödlighet. Däremot tar den dödliga koncentrationen inte hänsyn till hur mycket insektsmedel organismen faktiskt förvärvar. Vid användning av den dödliga dosberäkningen kan skillnader mellan köns- eller storleksberoende känslighetsprofiler observeras och kvantifieras mer exakt, vilket gör denna mätning ännu mer mångsidig.
Tekniskt motstånd: Denna metod bedömer teknisk resistans, vilket är motstånd mätt i standardiserade, kontrollerade miljöer. Sådana mätningar är lämpliga för övervakning av spridningen av insekticidresistens och koppling av fenotypisk resistens med potentiella markörer15. På grund av den minskade variationen i dödlighet till följd av den aktuella applikationsbioassayn möjliggör det bättre identifiering av nya resistensmarkörer. På grund av den onaturliga exponeringen av insekticider för myggan är denna analys emellertid inte lämplig för uppskattning av effekten av en specifik intervention i en specifik population. Andra analyser behövs för mätningar av sådant praktiskt motstånd15.
Provets anpassningsförmåga: Denna metod kan praktiseras på andra viktiga leddjur som skadedjur (t.ex. Colorado potatisbagge), husskadedjur (t.ex. kackerlackor och vägglöss) eller pollinatorer (t.ex. bin) med enkla förändringar av knockdown-metoden och / eller insekticiddosen, volymen och / eller koncentrationen (som beskrivits ovan). Den enkla anpassningsförmågan kan hjälpa till att analogisera forskning om insekticidresistens inom olika forskningsområden. Användningen av ett LD50-värde istället för en dödlig koncentration som dödar 50% av proverna (LC50) möjliggör noggrann jämförelse mellan arter.
Kostnad: I likhet med CDC-flaskbioassays och WHO-rörtester är kostnaderna för att köra den aktuella applikationsanalysen minimala (se materialförteckningen). De viktigaste delarna av utrustningen är sprutan (cirka $ 70) och dispensern (cirka $ 100), som kan återanvändas över analyser.
Antal exemplar som behövs: Minst 20-25 prover bör användas per topisk applikationsanalyskopp. Minst fem insekticidkoncentrationer rekommenderas att testas per experiment, med minst tre replikat som rekommenderas för proceduren. Sammantaget resulterar detta i minst 300-375 prover som behövs för ett komplett test, jämförbart med antalet prover som behövs för att utföra resistensintensitetstester med HJÄLP av WHO-rörtester eller CDC-flaskbioassays. Men om minskad variabilitet uppnås med den aktuella applikationsbioassay, kan samma antal prover leda till mer statistisk kraft för att jämföra känslighetsdata över tid eller rum.

Myggor är ansvariga för över 700 000 dödsfall varje år på grund av de sjukdomar de överför till människor, med över hälften av dessa dödsfall på grund av malariaensam 1. Den huvudsakliga förebyggande metoden mot överföring av malaria och andra vektorburna sjukdomar är användningen av insekticider, ofta i form av långvariga insekticidnät eller inomhusrestsprutning2. Insekticidresistens är emellertid utbredd bland myggor och andra insektsvektorer, liksom jordbruksskadedjur 3,4. För att effektivt hantera motstånd är övervakning av central betydelse5. För detta behövs mycket exakta och höggenomströmningsresistensdetekteringsmetoder. För närvarande är de mest utbredda övervakningsverktygen för insekticidresistens för myggor WHO: s rörtest6 och CDC-flaskans bioassay7. För fruktflugor är den återstående kontaktapplikationsmetoden (liknande CDC-flaskbioassay) en vanlig insekticidbioassay 8,9,10. Variationen i data från dessa metoder är emellertid vanligtvis hög, med mätningar av samma laboratoriemyggstam som sträcker sig från ~ 20-70% dödlighet i CDC-flaskanalyser och 0-50% i WHO-rörtester när de utsätts för subletala doser11. Sådan variation är förvånande eftersom den begränsade genetiska variationen i de flesta laboratoriestammar förväntas leda till begränsad variation i insekticidkänsligheten i befolkningen. Ändå finns det fortfarande en hög grad av variation observerad i bioassay-resultaten.
Potentiella källor till denna variation kan vara ett resultat av heterogen insekticidexponering mellan prover inom bioassay på grund av indirekt exponering för insektsmedel via ytan, heterogena miljöeffekter, normal biologisk variation mellan individer av samma genotyp och variation i massan av prover av samma population12 . En sällan använd metod med högre replikerbarhet är den aktuella applikationsbioassay. I denna analys appliceras insektsmedlet direkt på varje insekt13,14, vilket avlägsnar faktorn för heterogen exponering av olika prover inom samma analys. På grund av den långsamma genomströmningen av denna metod används den emellertid inte rutinmässigt som ett övervakningsverktyg för insekticidkänslighet för myggpopulationer. Detta dokument presenterar ett modifierat protokoll för den aktuella applikationsbioassay som möjliggör exponeringar med högre genomströmning samtidigt som den korrigerar för variation i insektsmassa, en parameter som korrelerar med förändringar i insekticidkänslighet12. En minskning av buller och massrelaterad variation i dödlighetsdata från variabel exponering för insektsmedel skulle möjliggöra mer exakt teknisk resistensövervakning11,15. Sådana data skulle kunna användas för att mer exakt associera fenotypisk resistens med genetiska markörer, konditionsparametrar och/eller vektorkompetens. Dessutom visar vi hur denna analys lätt kan anpassas till andra insektsarter genom att använda den aktuella applikationsbioassay på fruktflugor, en mindre insektsart.
Huvudbegränsningen för de ovannämnda återstående kontaktapplikationerna är att exponeringen för insektsmedel kan variera från prov till prov inom samma analys. När det gäller CDC-flaskbioassays och kontaktmetoden kan exponeringen för insektsmedel variera mellan replikat av samma analys. Insekterna utsätts för insektsmedel som antingen fördelas på insidan av en glasflaska (CDC-flaska bioassay och kontaktmetod) eller på impregnerade papper (WHO-rörtest). Koncentrationen av insektsmedel på båda ytorna (glas och papper) är känd och förutbestämd genom screening av olika arter av kända genotyper. Den mängd som är tillgänglig för att potentiellt absorberas av insekten kan emellertid variera kraftigt beroende på vilken yta som används, insekticidblandningens komponenter och hur homogent insektsmedlet fördelas över ytmaterialet16,17. I CDC-flaskans bioassay är insekticidbeläggningen på insidan av flaskan beroende av procedurer som används av varje laboratorium och användare. I WHO:s rörtest produceras de insekticidbehandlade papperen centralt och därmed troligen ganska homogena över laboratorier. I WHO:s rörtest tillåter exponeringsröret emellertid prover att landa och vila på icke-insekticidexponerat metallnät, vilket leder till potentiell heterogen exponering för insektsmedel bland proverna i varje test. Den faktiska mängden insektsmedel som plockas upp och absorberas av prover via varje metod behöver fortfarande undersökas ytterligare18.
Dessutom används CDC-flaskans bioassay, WHO-rörtest och kontaktmetod oftast som tröskelanalyser som testar endast en förutbestämd insekticidkoncentration. Detta tillvägagångssätt kan exakt detektera förekomsten av motstånd och är värdefullt för motståndsövervakning (särskilt när motståndet sprider sig). Tröskelanalyser kan dock inte kvantifiera styrkan hos resistensen, vilket kan vara mer prediktivt för effekten av interventionsverktyg. Om flera insekticidkoncentrationer används med dessa metoder kan de användas som intensitetsanalyser. Intensitetsanalyser för CDC-flaskbioassay och WHO-rörtestet har introducerats genom att testa 5x och 10x de förutbestämda diskriminerande doserna för att ta itu med detta gap i övervakning 6,19. Samtidigt som det ger större förmåga att skilja mellan resistenta populationer, ger 3-5 (förutbestämda) doser begränsad upplösning för att beräkna dödliga koncentrationer. Dessutom används myggor av olika storlekar i sådana analyser. Ändå är massan viktig att mäta eftersom större prover kan behöva en högre dos för att dödas eftersom den effektiva dosen per massenhet kommer att vara mycket lägre än för en mindre organism12. Att beräkna en massrelativiserad dödlig dos (mängd insektsmedel per insektsmassa) skulle vara ett mer användbart mått än den vanligare dödliga koncentrationen (t.ex. mängden insektsmedel per yta) eftersom den tar hänsyn till variationen av insektsmassa mellan kön, populationer och genotyper. Sådana data skulle bidra till att fylla klyftan mellan genotypisk och fenotypisk resistens inom laboratoriet och fältet och kan också ge ett enkelt sätt att beräkna den nödvändiga applikationskoncentrationen för att behandla en population av insekter med en känd genomsnittlig massa.
Användningen av massrelativiserade dödliga doser som dödar 50% av proverna (LD50) innehåller också flera andra fördelar. Bedömning av toxiciteten hos en specifik förening i mg/kg (= ng/mg) är standard inom human- och veterinärtoxikologi14, och LD50-värden finns på materialsäkerhetsdatablad. Dödliga doser möjliggör också direkt jämförelse av toxicitet mellan olika kemikalier mot en viss art eller samma kemikalie mot olika arter20, samt högkvalitativ utvärdering av nya insekticider och kemikalier13. Dessutom kan LD50 ge mer meningsfulla och exakta resistensförhållanden än de som härrör från diagnostiska dosdödlighetsresultat, vilket kan resultera i en överskattning av resistensnivån som finns i en population. Därför skulle denna analys vara lämplig för rutinmässiga övervakningsprogram genom att tillhandahålla mer rigorös resistensövervakning baserad på massrelaterade dödliga doser härledda från fler prover än vad som rekommenderas för andra bioassays21.
Den aktuella appliceringsmetoden har använts vid övervakning av insekticidkänslighet för myggor och flugor som ett alternativ till bioassaysen för standardkänslighet för insekticider när resistens redan är känd eller misstänkt22,23, samt för övervakning hos vissa skadegörare24 för att mer exakt bedöma resistensprofiler och insekticids inneboende toxicitet21 . I aktuella applikationsbioassays appliceras insektsmedlet på varje organism, vilket resulterar i minimal variation i exponering för insektsmedel. Detta dokument presenterar en något anpassad och förbättrad metod som gör det möjligt att applicera insekticidexponering på ett stort antal insekter på kort tid samtidigt som den kontrollerar insektsmassa22. Denna metod med högre genomströmning med goda replikerbarhetsnivåer kan vara ett användbart ytterligare verktyg för rutinmässig övervakning av insekticidkänslighet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

Den fortsatta användningen av insektsmedel för folkhälsa och jordbruk har lett till utbredd resistens mot insektsmedel och hindrande av kontrollmetoder. Insekticidresistensövervakning av myggpopulationer görs vanligtvis genom Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flaskbioassays eller Världshälsoorganisationens (WHO) rörtester. Dessa metoder kan emellertid resultera i en hög grad av variation i dödlighetsdata på grund av variabel insekticidkontakt med insekten, det relativt lilla antalet testade organismer, omfattande variation i massa mellan populationer och ständigt föränderliga miljöförhållanden, vilket leder till varierande resultat. Detta dokument presenterar den aktuella applikationsbioassay, anpassad som en fenotypisk bioassay med hög genomströmning för både myggor och fruktflugor, för att testa ett stort antal insekter längs en rad insekticidkoncentrationer.
Denna analys 1) säkerställer konsekvent behandling och insekticidkontakt med varje organism, 2) producerar mycket specifika dos-responskurvor som tar hänsyn till skillnader i genomsnittlig massa mellan stammar och kön (vilket är särskilt viktigt för fältinsamlade organismer), och 3) möjliggör beräkning av statistiskt rigorösa median dödliga doser (LD50 ), som är nödvändiga för jämförelser av resistenskvoter – en alternativ övervakningsmetod från diagnostisk dosdödlighet, som också används för övervakning av larvicidresistens. Denna analys kommer att vara ett kompletterande verktyg för exakt fenotypning av myggpopulationer och, som illustreras med hjälp av fruktflugor, är lätt anpassningsbar för användning med andra insekter. Vi hävdar att denna analys kommer att bidra till att fylla klyftan mellan genotypisk och fenotypisk insekticidresistens hos flera insektsarter.

Dessa representativa resultat har två olika stammar av Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) och en isolerad fältstam från Florida med kända knockdown-resistensmutationer F1534C och V1016I (IICC-genotyp). Dessutom presenteras Drosophila melanogaster (Kanton: S-stam).
Figur 2 och figur 3 illustrerar dosresponsen för varje organism per stam och kön som testats enligt ovanstående protokoll. Eftersom inga skillnader observerades mellan dos-responskurvorna för manliga och kvinnliga myggor inom varje stam (t = 1,70, p = 0,098 för ROCK och t = 0,64, p = 0,527 för IICC) samlades data från båda könen inom varje myggstam. Den massrelatiserade LD50 för ROCK och IICC är 0,008 ng/mg (95% CI: 0-0,104) respektive 0,336 ng/mg (95% CI: 0,235-0,438). De 95% CI av dessa värden överlappar inte varandra, vilket indikerar signifikant olika dossvar av stammarna. RR för IICC-stammen (i förhållande till ROCK-stammen) är 41,7, vilket enligt WHO anses vara mycket resistent5. För Canton-S-fruktflugorna är den massrelativiserade LD50 0,213 ng / mg (95% CI: 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Figur 2: Representativa data om myggor med hjälp av aktuell applikationsbioassay. Representativa dos-responsdata från topikal applicering bioassay enligt ovanstående protokoll med användning av deltametrin och myggor: (A) kvinnlig Ae. aegypti ROCK (n = 880) och IICC (n = 550) stammar, (B) manliga Ae. aegypti ROCK (n = 880) och IICC (n = 569) stammar. Testkoncentrationerna av deltametrin varierade från 0,00075 ng/μL till 9,68705 ng/μL, och dosen av deltametrin som applicerades (ng) per genomsnittlig myggmassa (mg) återspeglas på x-axeln. Dödligheten visas som en andel på y-axeln. Den svarta linjen genom varje datapunktskluster representerar den stam- och könsspecifika linjära regressionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Figur 3: Representativa data för bananflugor med hjälp av topisk applicering bioassay. Representativa dos-responsdata från topikal applicering bioassay enligt ovanstående protokoll med användning av deltametrin och fruktflugor: D. melanogaster Canton-S stam (n = 1014). Testkoncentrationerna av deltametrin varierade från 0,00499 till 5,02876 ng/μL, och dosen av applicerat deltametrin (ng) per genomsnittlig bananflugemassa (mg) återspeglas på x-axeln. Dödligheten visas som en andel på y-axeln. Den svarta linjen representerar den linjära regressionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tilläggsfigur S1: Insektshanteringstält på bänkskiva. Benchtop insektshanteringstält används för att lättare fånga flyende myggor eller flugor under den aktuella applikationsanalysen. Strukturen är stängd i A och öppen i B. Denna struktur byggdes med PVC-rör och finmaskigt tyg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur S2: Sprut- och repeaterapplikatorenhet. Sprut- och repeaterapplikatorenhet som används för dosering av insekter. Huvuddelarna inkluderar 1) nål, 2) sprutfat, 3) kolv, 4) repeater och 5) repeaterknapp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 1: Randomiseringsskript: Randomiseringsskript för att skapa icke-partiska etiketter för alla koppar i varje experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 2: Resultatblad för dödlighet: Resultatblad för dödlighet för att underlätta bedömningen av dödligheten. Arket innehåller också platser för att registrera all annan viktig information att spela in, som det hänvisas till i protokollet, till exempel start- och sluttider för insekticidapplikationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 3: Exempel på dödlighetsdata: Exempel på datafil som används för att skapa figur 2. Kolumnrubrikbeskrivningarna är följande: "id" = identifieringskod för varje datapunkt; "art" = artnamn (t.ex. Aedes aegypti), "insekticid" = namnet på insektsmedel som appliceras lokalt (t.ex. Deltametrin); "stam" = namn på myggstam (t.ex. ROCK); "datum" = startdatum aktuell ansökan; "kön" = myggens kön; "ålder" = ålder av myggor (ung = 3-5 dagar gammal; gammal = 4 veckor gammal); "total.mosq" = totalt antal myggor som vägs i sats; "vikt" = vikt (mg) av alla myggor inom sats; "koncentration" = koncentration av insektsmedel (μg/ml), "spruta" = droppvolym (ml) spruta; "dos" = mängd insekticid aktiv ingrediens applicerad på varje mygga (ng); "totalt" = antal myggor i varje kopp; "död" = antal döda myggor i varje kopp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 4: R-analyskod: Exempel på R-kod som kan användas för att slutföra Probit-analysen (enligt beskrivningen i steg 8 i protokollet). De representativa resultaten (tillgängliga via den kompletterande exempeldatafilen) kan användas med denna R-kod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Vi beskriver metodiken och betydelsen av den aktuella appliceringen bioassay för att mäta insekticidkänslighet hos myggor och bananflugor. Den presenterade analysen är hög genomströmning, använder insektsmassa - vilket möjliggör beräkning av en massrelativiserad dödlig dos istället för koncentration - och har sannolikt lägre variabilitet än andra liknande metoder.

Aktuell applikationsbioassay för att kvantifiera insekticidtoxicitet för myggor och fruktflugor

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Genom att direkt applicera insektsmedel på insekten snarare än genom ytkontakt finns det minimal variation i exponering för insektsmedel, och detta gör att vi kan mäta känslighetsprofilen för myggpopulationer mer exakt. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter oss att beräkna massrelativiserade dödliga doser av ett insektsmedel snarare än dödliga koncentrationer, vilket avsevärt förbättrar jämförelser av resistensförhållanden. Var noga med att förvara insekticiderna ordentligt, undvik att förorena dina verktyg och se till att sprutdelarna är i gott skick.Detta hjälper dig att få konsekventa resultat. För att börja, ta bort de nödvändiga insekticidlösningarna från frysen. Omedelbart virvla lösningen eller invertera fem gånger och placera den i en ljusbeständig behållare vid rumstemperatur för att låta insekticiderna värmas till rumstemperatur före användning.Ställ ut fem mikrocentrifugrör med 0,5 ml aceton vardera. Fyll sprutfatet helt med aceton från det första röret. Utvisa sedan acetonen i en avfallsbehållare genom att snabbt trycka ner kolven och upprepa ytterligare fyra gånger för att slutföra totalt fem acetontvättar från samma acetonalitquot.Fyll sedan sprutfatet helt med luft och utvisa luften och potentiella acetonrester i avfallsbehållaren. Upprepa ytterligare två gånger för att slutföra tre tvättar med luft. Skapa en luftficka i pipan mellan sprutkolven och toppen av nålen genom att dra upp kolven cirka fem millimeter i pipan.Märk plasthållkopparna med slumpmässigt ID för blind dödlighetsbedömning. Använd en aspirator som drivs av sug från inandning, aspirera det önskade antalet tre till fem dagar gamla vuxna myggor. Placera andningsspetsen i röret med bomull lindad runt spetsen.Andas försiktigt ut och knacka på aspiratorn för att överföra myggorna till ett koniskt rör. Använd bomullen för att plugga röret när andningsspetsen tas bort och täck sedan med locket. Slå kort ner myggorna i rören genom att placera dem i minst 10 minuter vid fyra grader Celsius eller begrava dem under isen i en isbricka.Överför de nedslagna myggorna till insektshanteringstältet. Tippa försiktigt myggorna ut på en plastbricka placerad på isen och häll cirka 50 myggor åt gången för att säkerställa att var och en rör vid den svala brickan under den och förblir nedslagen. Sortera myggorna efter kön genom att försiktigt plocka upp dem vid benen eller vingarna med pincett, följt av att placera varje kön i en separat hållkopp och sluta när önskat antal uppnås.Ta bort eventuella myggor som är skadade eller är extra stora eller små när du sorterar. För att registrera myggkoppens vikt, placera en tom kopp med en petriskål som lock på vågen och tara vågen. Häll myggorna i behållaren och lägg locket ovanpå.Placera behållaren på vågen och registrera den slutliga vikten tillsammans med antalet myggor. Placera omedelbart koppen med exemplar tillbaka på isen för att hålla dem immobiliserade tills alla koppar av provet vägs. Dela de beredda myggorna i fem till 10 separata koppar placerade på is, märkta med slumpmässiga ID.Använd pincett och en handhållen disk för att uppnå 20 till 25 myggor per kopp. För att sortera fruktflugorna, bedöva flugorna med koldioxid i sju sekunder. Häll flugorna på ett ispaket inslaget i bänkpapper.Använd en finspetsad pensel, separera och räkna män och kvinnor. Använd penseln för att försiktigt plocka upp de valda flugorna och placera dem i en ren, tom lagerflaska. Efter att ha valt lika många manliga och kvinnliga fruktflugor, märk buljongflaskorna med stamnamnet och fruktflugan totalt.Bedöva flaskan med fruktflugor med koldioxid i sju sekunder. Häll fruktflugorna på vägpapper och använd papperet som en tratt för att införa flugorna i en tjärad flaska märkt med ett slumpmässigt ID.Efter att ha placerat petriskållocket ovanpå flaskan med fruktflugor, placera den på vågen. Registrera den sammanlagda vikten och antalet exemplar på poängbladet.Placera omedelbart flaskan med fruktflugor i en bricka med is med locket fortfarande ovanpå för att förhindra att flugorna flyr. Ladda sprutan med rätt insekticidkoncentration, börja med den minst koncentrerade dosen och arbeta mot den mest koncentrerade dosen med varje grupp av organismer. Tippa proverna på vägpapper som placeras ovanpå en bricka på isen.Separera proverna som ligger nära varandra med en ren insekticidfri pensel eller bomullspinne för att ge enkel åtkomst till varje prov för dosering. Använd sprutan och applicera en droppe insekticidlösning på den ventrala bröstkorgen och bukområdet för myggor och dorsum för fruktflugor. Häll omedelbart proverna tillbaka i den märkta plastkoppen.Täck koppen med nät och ett gummiband. Observera ett uppdaterat provantal på koppen om några exemplar dödades, skadades eller flydde i denna process. Lägg den färdiga koppen i en hållbricka.För den första koppen, registrera tiden då dosningen är klar. Upprepa dosningen för varje kopp tills alla prover har doserats med rätt insekticidkoncentrationer och registrera sluttiden när alla prover har doserats. Ge 10% sackaroslösning till varje kopp via en våt bomullstuss och förvara myggorna och fruktflugorna vid önskad temperatur och fuktighet.Registrera provdödlighet vid 24 timmar efter starten av exponering för insektsmedel. Klassificera myggor som levande om de kan flyga och hålla sig upprätt och döda om de är orörliga eller ataxiska, som beskrivs av WHO. Följ samma dödlighetsbedömning för bananflugor.Efter att ha utfört bioassay erhölls dosresponsdata med två stammar som är Rockefeller- och IICC-genotyp för manliga och kvinnliga Aedes aegypti. Den massrelativismiserade mediandödliga dosen för Rockefeller och IICC var 0,008 respektive 0,336 nanogram per milligram. Resultaten avslöjade inga skillnader mellan dosresponskurvorna för kvinnliga och manliga myggor inom varje stam.Därför kombinerades data från båda könen för att beräkna de genomsnittliga dödliga dosvärdena. Eftersom de 95 % konfidensintervallen för den genomsnittliga dödliga dosen av dessa två stammar inte överlappade varandra, ansågs dessa värden vara signifikant olika. Vid beräkning av de resistenta förhållandena var IICC-stammen dessutom över 40 gånger mer motståndskraftig än den mottagliga Rockefeller-stammen.Dosresponsdata för bananfluga, Drosophila melanogaster, Canton-S-stammen, erhölls också, och den massrelativismiserade mediandödliga dosen befanns vara 0,213 nanogram per milligram. Konsistens är avgörande, särskilt vid lagring och applicering av insektsmedlet och bedömning av dödligheten. Var också försiktig när du hanterar provet för att undvika skada eller död som inte induceras av insektsmedlet.Med denna metod kan vi nu exakt bestämma den tekniska resistensen hos en myggpopulation och hur miljöförhållandena påverkar motståndet eller hur tekniskt motstånd förutsäger praktiskt motstånd.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studera Aggression i Drosophila (fruktflugor)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Biologiska testsystem för övervakning Insektsmedel Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Ett optimerat protokoll för uppfödning Fopius arisanus Flugor ett parasitod av Tephritid frukt

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolering och Biofysikalisk studie av frukt nagelband

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-detektion analys för Malaria Överföring Myggor

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Tekniker för att inducera och kvantifiera cellulärt åldrande

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Laboratoriet uppfödning av stabil flugor och andra Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoll för testning av romanen insektsbekämpning kemier mygg toxicitet

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potentialskillnaden att kvantifiera Trans-epitelial Ion Transport i möss

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvingade salivering som en metod att analysera vektor kompetens av myggor

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...