Name: determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method
Uploaded: 2022-03-31T13:20:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom CNRS, der Université de Lille CNRS und den ANR-Zuschüssen "MathTest" (ANR-18-CE13-0027) unterstützt.

1. Inkubation mit abzweigenden Enzymen
<ol><li>Mischen Sie 200 μL gereinigtes Glykogen bei 0,5-2 mg/ml mit 200 μL 100 mM Acetatpuffer (pH 4,8). 2 μL Isoamylase (180 E/mg Protein) und 1,5 μL Pullulanase (30 U/mg Protein) (siehe Materialtabelle) hinzufügen, vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren mischen und bei 42 °C für 16 h in einem 1,5 ml-Röhrchen inkubieren. HINWEIS: Während des Glykogenreinigungsprozesses kann eine Abbau- oder Amylasekontamination auftreten. Um das Vorhandensein von freien Malto-Oligosacchariden zu schätzen, können Proben ohne den entzweigenden Enzymcocktail parallel inkubiert werden. Ein Standard (z. B. Maltoheptaose) wird in die Analyse einbezogen, um die Beziehung zwischen der Elutionszeit und dem Polymerisationsgrad zu bestimmen.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie bei 95 °C für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 16.100 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletieren und zu entfernen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Überstände mit einer Pipette und übertragen Sie sie auf neue kommentierte Röhren. Entsalzen Sie die Überstände durch Zugabe von 100 μL Anionen-/Kationenaustauscherharzperlen (AG-501-X8, siehe Materialtabelle) und rühren Sie.<ol>
<li>Rühren Sie die Perlen regelmäßig für 5 min. Sammeln Sie die Proben durch Pipettieren und legen Sie sie in neue kommentierte Röhrchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gefriertrocknen oder verwenden Sie einen Vakuumverdampfer (siehe Materialtabelle) bei 30 °C, um die Proben zu trocknen.</li>
	<li>Lagern Sie getrocknete Proben bei Raumtemperatur oder bei -20 °C. HINWEIS: Die Proben können für 1 Monat gelagert werden.</li>
</ol>2. Reduktive Aminierung
<ol><li>Mischen Sie die getrockneten Proben mit 2 μL 1 M Natriumcyanoborhydrid in Tetrahydrofuran (THF) und 2 μL APTS (5 mg APTS resuspendiert in 48 μL 15% Essigsäure) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bei 42 °C für 16 h im Dunkeln inkubieren. ACHTUNG: Natriumcyanoborhydrid wird mit angepasster persönlicher Schutzausrüstung und unter einer chemischen Haube behandelt. Inhalation und Kontakt mit der Haut sind hochgiftig und können tödlich sein, was zu schweren Hautverbrennungen und Augenschäden führen kann. Beim Mischen von Natriumcyanoborhydrid mit Essigsäure können hochgiftige Gase entstehen. In Kontakt mit Wasser setzt Natriumcyanoborhydrid brennbare Gase frei, die sich spontan entzünden können. Konzentrierte Proben werden unter einer chemischen Haube und mit angepasster persönlicher Schutzausrüstung ab diesem Schritt gehandhabt.</li>
</ol>3. GESICHTSANALYSE
<ol><li>46 μL Reinstwasser zu jeder Probe geben.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Proben direkt auf 1/50 in Mikrofläschchen von 100 μL, indem Sie 1 μL der Probe zu 49 μL Reinstwasser hinzufügen. Halten Sie die Proben im Dunkeln, während Sie das FACE einstellen (5-10 min).</li>
	<li>Führen Sie eine Rotpolaritätselektrophorese mit einem Kapillarelektrophoreseinstrument mit einem laserinduzierten Fluoreszenzdetektor (LIF) durch (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Polarität für die Trennung auf "Reverse Mode", stellen Sie das LIF auf 488 nm Emissionswellenlänge und den Detektor auf 512 nm ein.</li>
	<li>Stellen Sie die Einspritzzeit auf 10 s und den Einspritzdruck auf 0,5 psi ein.</li>
	<li>Führen Sie die APTS-markierte Glucan-Trennung bei 30 kV in einer nackten Quarzglaskapillare von 60,2 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 50 μm (375 μm Außendurchmesser) im N-verknüpften Kohlenhydrattrennpuffer durch, der in Reinstwasser auf 1/3 verdünnt ist (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Der N-verknüpfte Kohlenhydrat-Trennpuffer wird alle 20 Durchläufe ausgetauscht.</li>
</ol>4. DATENVERARBEITUNG
<ol><li>Exportieren Sie die ". ASC "und ". CDF "Dateien, die das Elektropherogrammprofil bzw. die Integrationsdaten enthalten.</li>
	<li>Öffnen Sie die . ASC-Datei und zeichnen Sie die relative Fluoreszenzeinheit gemäß dem Zeitdiagramm.</li>
	<li>Öffnen Sie die . CDF-Datei , fahren Sie mit einer ersten automatischen Integration fort und passen Sie die folgenden Parameter an: Breite; Integration von Tal zu Tal; Mindestfläche.</li>
	<li>Überprüfen und korrigieren Sie jedes fehlerhafte Integrationsereignis manuell.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+randomly+hyperbranched+polymers:+Theory+and+simulation.">Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation.</a> The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).</li><li>Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers,+exemplified+by+glycogen.">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li><li>Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. 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A problem of physical constraints in structure building.</a> Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).</li><li>Mel&#233;ndez, R., Mel&#233;ndez-Hevia, E., Canela, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+structure+of+glycogen:+A+clever+solution+to+optimize+cell+metabolism.">The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism.</a> Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).</li><li>Wang, L., Wise, M. 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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die mit dieser Arbeit verbunden sind.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Glykogenpartikeln (z. B. Größe, Morphologie, Löslichkeit) sind direkt mit der Länge der Glucane verbunden, aus denen die Partikel bestehen. Jedes Ungleichgewicht zwischen biosynthetischen und katabolen Enzymen führt zur Veränderung der Kettenlängenverteilung und per se zur Ansammlung von abnormalem Glykogen, das für die Zelle gefährlich sein kann11. Die FACE-Analyse ist eine Methode der Wahl zur Bestimmung der Glykogenkettenlängenverteilung (CLD). Wie in Abbildung 2 dargestellt, erlaubt die Bestimmung von CLD den Rückschluss auf den durchschnittlichen Kettenlängenwert von Glykogen (ACL), der die Struktur von Glykogenpartikeln widerspiegelt. Tierische Glykogene mit hohen ACL-Werten sind mit dem Auftreten abnormaler Partikel verbunden. Die subtraktive Analyse ist eine hilfreiche Methode, um zwei Glykogenproben aus verschiedenen genetischen Hintergründen (Mutant versus Wildtyp) zu vergleichen. Durch die Darstellung auf einer logarithmischen Skala haben CLDs, die auf den maximalen Peak normiert sind, den Vorteil, dass CLD unabhängig von einer Referenz verglichen werden können und uns Informationen über den wachsenden Glykogenmechanismus geben.
Darüber hinaus ist die FACE-Analyse eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der katalytischen Eigenschaften von Glykogenmetabolisierungsenzymen. Zum Beispiel spalten alle Glykogen-verzweigenden Enzyme (1 → 4)-α Bindungen und übertragen Oligomaltosylgruppen auf eine (1 → 6)-α Position oder Verzweigungspunkte. Verzweigte Enzyme sind aufgrund ihrer Affinität zu Polysacchariden (z.B. Amylopektin, Glykogen) und der Länge der übertragenen Glucane trotz des ähnlichen katalytischen Mechanismusunterscheidbar 22. So können verschiedene Quellen von verzweigten Enzymen (Mensch, Pflanze, Bakterien) durch eine Reihe von Inkubationsexperimenten und CLD-Vergleichen mittels FACE-Analyse23 charakterisiert und klassifiziert werden.
Wie in der Einleitung erwähnt, ist HPAEC-PAD auch eine alternative Methode zur Bestimmung der Kettenlängenverteilung18. Beide Techniken erfordern die vollständige Hydrolyse von (1 → 6)-α Verknüpfungen oder Verzweigungspunkten durch Isoamylase-artige Entzweigungsenzyme, bevor der Pool linearer Glucane entsprechend ihrem Polymerisationsgrad (DP) getrennt wird. Die HPAEC-PAD-Methode hat jedoch zwei Nachteile gegenüber FACE: (1) Die amperometrische Pulsantwort nimmt mit zunehmender Zunahme der Glucanketten ab, was keine quantitativen Informationen liefert. Dieses Problem der Massenverzerrung kann mit HPAEC-ENZ-PAD umgangen werden, das einen Post-Column-Enzymreaktor zwischen der Anionenaustauschsäule und PAD24 beinhaltet. Der Säulenenzymreaktor hydrolysiert Malto-Oligosaccharide zu Glukoseresten, was eine konstante amperometrische Pulsreaktion ermöglicht. (2) Das HPAEC-PAD ermöglicht die Trennung von Glucanketten mit einem Polymerisationsgrad von bis zu 70. Obwohl die Auflösung für die Bestimmung der CLD von Glykogenproben ausreicht, trennt FACE Ketten mit DPs bis zu 150, geeignet für Stärkeproben17. Es ist wichtig zu bedenken, dass sowohl die HPAEC-PAD- als auch die FACE-Analyse Vor- und Nachteile haben. Zum Beispiel erfordert die Aminierungsreaktion eine freie hemiacetale Gruppe, um mit der primären Aminfunktion des APTS zu reagieren. Dies bedeutet, dass die APTS-Kennzeichnung nicht für Glucanketten ohne reduzierende Enden (z. B. Inulin) verwendet werden kann. Die HPAEC-PAD-Methode erfordert nicht das Vorhandensein von reduzierenden Enden. Ein zweiter interessanter Aspekt der HPAEC-PAD-Methode ist, dass die Anionenaustauschsäule mit einigen Milligramm linearen Glucanen belastet werden kann, was die Reinigung von Malto-Oligosaccharid mit einem spezifischen DP oder 14C-radioaktiv markierten Malto-Oligosaccharid für den enzymatischen Assay 18,25 ermöglicht. Obwohl die Massenspektrometrie (z. B. MALDI-TOF) eine schnelle und empfindliche Technik zur Bestimmung der Kettenlängenverteilung ist, scheint diese Technik weniger reproduzierbar zu sein. Es überschätzt die Menge an langen Glucanketten26. Letzteres kann jedoch für eine spezifische Anwendung wie die MALDI-Bildgebung verwendet werden, um das Vorhandensein von Glykogen im Zellgewebe abzubilden27.

Glykogen, das als Kohlenstoff- und Energiespeicher verwendet wird, ist ein Homopolymer aus Glukose, das aus linearen Ketten von Glucosyleinheiten besteht, die durch (1 → 4)-α-Bindungen verbunden und durch (1 → 6)-α glykosidische Bindungen oder Verzweigungspunkte gebunden sind. Sie erscheinen als β- und α-Partikel im Zytosol einer Vielzahl von Organismen. β-Partikel sind winzige wasserlösliche Partikel, die hauptsächlich in Prokaryoten beobachtet werden. Ihr Durchmesser reicht von 20-40 nm, wahrscheinlich diktiert durch die Glykogenmetabolisierungsenzyme und das sterische Hindernis 1,2.
Erstmals in tierischen Zellen beschrieben, weisen die größeren α-Partikel einen Durchmesser von bis zu 300 nm mit einer blumenkohlartigen Form auf. Diese besondere Organisation kann aus der Aggregation mehrerer β-Teilchen entstehen oder durch Ausknuten aus einem einzigen β-Partikel3 entstehen. Interessanterweise hat eine aktuelle Studie über das Vorhandensein von α-Partikeln in Escherichia coli4 berichtet. Im Gegensatz zu α-Partikeln aus tierischen Zellen fallen letztere jedoch während des Extraktionsprozesses schnell auseinander, was den Mangel an Daten in der Literaturerklären könnte 4. Das Auftreten von α-Partikeln in Eukaryoten und Prokaryoten beinhaltet phylogenetisch nicht verwandte Glykogen-metabolisierende Enzyme5. Dies wirft Fragen hinsichtlich der Funktion solcher Teilchen und der Art potenzieller Vernetzer zwischen β-Teilchenauf 5.
Obwohl zwei gegensätzliche mathematische Modelle für die Bildung von Glykogenmolekülen 6,7,8,9 vorgeschlagen wurden, ist es allgemein anerkannt, dass sich β-Teilchen als Reaktion auf ihre metabolische Funktion als hocheffiziente Brennstoffreserve für die schnelle Freisetzung großer Mengen Glukose entwickelt haben. Eine große Anzahl von Beweisen deutet darauf hin, dass Glykogeneigenschaften wie Verdaulichkeit und Löslichkeit in Wasser mit der durchschnittlichen Kettenlänge (ACL) korreliert sind, die dann den Prozentsatz der Verzweigungspunkte und die Partikelgröße 2,6,7,8,10,11 bestimmt. . ACL wird durch das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl der Glukoserückstände und der Anzahl der Verzweigungspunkte definiert. Typischerweise variieren die ACL-Werte von 11-14 und 7-23 Glukoseresten in Eukaryoten undProkaryoten bzw. 10. Beim Menschen sind mehrere Glykogenstörungskrankheiten auf eine abnormale Glykogenakkumulation zurückzuführen. Zum Beispiel ist die Andersen-Krankheit mit der mangelhaften Aktivität eines Glykogen-verzweigenden Enzyms verbunden, was zur Anhäufung von abnormalem Glykogen11 führt. Bei Prokaryoten deuten kumulative Studien darauf hin, dass ACL ein kritischer Faktor ist, der die Abbaurate von Glykogen und die bakterielle Überlebensfähigkeit beeinflusst12,13. Es wurde berichtet, dass Bakterien, die β-Partikel mit einem niedrigen ACL-Wert synthetisieren, langsamer abgebaut werden und daher den Hungerbedingungen länger standhalten. Daher ist die Kenntnis der Architektur von β-Partikeln unerlässlich, um die Bildung abnormaler Glykogenpartikel bei menschlichen Glykogenspeicherkrankheiten und das Überleben von Prokaryoten in einer nährstoffarmen Umgebung zu verstehen.
Seit der ersten Isolierung von Glykogen aus der Hundeleber durch den französischen Physiologen Claude Bernard im späten neunzehnten Jahrhundert14 wurden viele Techniken entwickelt, um Glykogenpartikel im Detail zu charakterisieren. Zum Beispiel Transmissionselektronenmikroskopie für die Glykogenmorphologie (α- oder β-Partikel)15, Protonen-NMR-Spektrometrie zur Bestimmung des Prozentsatzes von α-1,6 Verknüpfungen16, Größenausschlusschromatographie mit Multidetektoren zur Ableitung des Molekulargewichts, Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE)17 oder Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) sowohl für die Kettenlängenverteilung (CLD) als auch für ACL Feststellung18.
Diese Arbeit konzentriert sich auf die fluorophorunterstützte Kohlenhydratelektrophorese-Methode, die auf der reduktiven Aminierung der hemiacetalen Gruppe durch primäre Aminfunktion beruht. Historisch gesehen wurde 8-Amino-1,3,6-naphthalintrisulfonsäure (ANTS) erstmals zur Markierung verwendet. Später wurde es durch das empfindlichere Fluorophor, 8-Amino 1,3,6 pyrentrisulfonsäure (APTS)19, ersetzt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig01.jpg"> Abbildung 1: Die reduktive Aminierungsreaktion mit 8-Amino 1,3,6 Pyrentrisulfonsäure (APTS). Reduktive Aminierungsreaktion der hemiacetalen Gruppe durch primäre Aminfunktion von 8-Amino 1,3,6 Pyrentrisulfonsäure (APTS) unter reduktiven Bedingungen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Wie in Abbildung 1 dargestellt, interagiert die hemiacetale Funktion des reduzierenden Endes einer Glucankette unter reduzierenden Bedingungen mit dem primären Amin von APTS. Die Sulfongruppen von APTS tragen negative Ladungen, die die Trennung von Glucanketten nach ihrem Polymerisationsgrad (DP) ermöglichen. Die reduktive Aminreaktion ist hochgradig reproduzierbar und effizient. Für DP3 bis DP135 wird ein durchschnittlicher Wirkungsgrad von 80 % und für Maltose (DP2) und Glukose von bis zu 88 % bzw.97 % für 17,20 % erreicht. Da ein APTS-Molekül mit dem reduzierenden Ende jeder Glucankette reagiert, konnten einzelne Ketten quantifiziert und molar miteinander verglichen werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AG-501-X8 Resin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1436424</td>
			<td>Storage Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water&#8212;storage at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS stock solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>09341-5MG</td>
			<td>Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>select :File&#62;import/restore&#62;ANDI/chromatography in the open window: select &#34;add&#34; select cdf&#160; file &#62; import &#62; next 
			Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software&#62; finish click on QNT-Editor&#62; parameter &#34;Min Area&#34; select &#34;Range&#34; 0.05 [Signal]*min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Open Excel&#62; New file&#62; save the file &#62; File menu click on Import &#62; In the open window choose &#34;csv.&#34; as type file &#62; select your asc file &#62; a new window appears Step 1: choose Macintosh or&#160; Window and then used default setting for the steps 2 and 3. &#62; Y values appear in column A&#62; Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Dry apparatus</td>
			<td>Christ</td>
			<td>alpha 2-4 LO plus</td>
			<td>before the freezing-drying process, samples are stored at -80 &#176;C for 1 h.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-ISAMY</td>
			<td>180 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltoheptaose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Linked carbohydrate separation buffer</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td>477623</td>
			<td>Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pullulanase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-PULKP</td>
			<td>30 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296813-100ML</td>
			<td>1 M Sodium cyanoborohydride in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum-evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Set the temperature at 30 &#176;C. Centrifuge until the samples are dried</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method

Glykogenpartikel sind verzweigte Polysaccharide, die aus linearen Ketten von Glucosyleinheiten bestehen, die durch α-1,4-Glucosidbindungen verbunden sind. Letztere sind durch α-1,6 Glucosidverbindungen, die als Zweigpunkte bezeichnet werden, miteinander verbunden. Unter den verschiedenen Formen der Kohlenstoffspeicherung (d.h. Stärke, β-Glucan) ist Glykogen wahrscheinlich eines der ältesten und erfolgreichsten Speicherpolysaccharide, die in der lebenden Welt zu finden sind. Glucanketten sind so organisiert, dass eine große Menge Glukose bei Bedarf schnell in einer Zelle gespeichert oder betankt werden kann. In den letzten Jahrzehnten wurden zahlreiche komplementäre Techniken entwickelt, um die Feinstruktur von Glykogenpartikeln zu lösen. Dieser Artikel beschreibt Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE). Diese Methode quantifiziert die Population von Glucanketten, aus denen ein Glykogenpartikel besteht. Dieser Parameter, der auch als Kettenlängenverteilung (CLD) bezeichnet wird, spiegelt die Partikelgröße und den Prozentsatz der Verzweigung wider. Es ist auch eine wesentliche Voraussetzung für die mathematische Modellierung der Glykogenbiosynthese.

Bestimmung der mittleren Kettenlänge von Glykogen Abbildung 2 zeigt den Workflow, der erforderlich ist, um die Kettenlängenverteilung und die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) von Glykogen abzuleiten.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig02.jpg"> Abbildung 2: Workflow zur Bestimmung der Kettenlängenverteilung (CLD) und der durchschnittlichen Kettenlänge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Abbildung 3 zeigt die Elektropherogramme von kommerziellem Maltohexaose und verzweigtem Rinderleberglykogen. Die Fluoreszenzsignale, die in allen Experimenten zwischen 4,13 und 4,67 min beobachtet wurden, stammten von den nicht reagierenden APTS. Die Elutionszeit von markiertem Maltohexaose (DP6) wurde auf 8,49 min geschätzt (Abbildung 3A). Die APTS-markierten Glucane des Rinderglykogens wurden anhand der Elutionszeit von DP6 identifiziert (Abbildung 3B). In der Kontrollprobe wurde keine Spur von freiem Malto-Oligosaccharid nachgewiesen (Glykogen wurde nicht mit abzweigenden Enzymen inkubiert) (Abbildung 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig03.jpg"> Abbildung 3: Elektropherogramme eines Standard- und Rinderleberglykogens. (A) Die Zeitelution (8,49 min) eines Glucanstandards, Maltohexaose (DP6), wurde als Referenz verwendet, um den Grad der Polymerisation (DP) von APTS-markierten Glucanen zu bestimmen, die nach der Wirkung von abzweigenden Enzymaktivitäten aus Rinderleberglykogen freigesetzt wurden (B ). Das Inset-Panel zeigt eine Trennung von Glucanketten bis zu 44 DP. Parallel dazu wurde unbehandeltes Rinderglykogen mit APTS markiert, um mögliche Spuren von freien Malto-Oligosacchariden in der Probe nachzuweisen (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Es kann gefolgert werden, dass die Freisetzung von APTS-markiertem Glucan auf die Spaltung von Verzweigungspunkten sowohl durch Isoamylase- als auch durch Pullulanase-Aktivitäten zurückzuführen ist. Es sollte beachtet werden, dass das Kapillarelektrophoreseprofil in einem geeigneteren Format neu gezeichnet werden kann, um eine Mosaikfigur mit mehreren Profilen zu erstellen. Dazu werden DATA-Dateien, die Fluoreszenzwerte enthalten, mit der Erweiterung "asc" generiert und im Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet, indem das CSV-Format (kommagetrennter Wert) gewählt wird. Leider sind die exportierten Fluoreszenzwerte nicht mit der entsprechenden Elutionszeit verbunden. Folglich müssen sie manuell entsprechend der Einstellung der Erfassungsfrequenz am FACE-Gerät hinzugefügt werden (4 Hz bedeutet eine Werterfassung alle 0,25 s).
Peak-Bereiche wurden dann mit der nativen Anwendung des FACE-Instruments abgeleitet oder als DATA-Datei mit der Erweiterung "cdf" exportiert, um eine andere Anwendung zu verwenden. Die Flächenwerte werden in ein Tabellenkalkulationsprogramm exportiert und normalisiert, indem die EP als Prozentsatz der Gesamtfläche ausgedrückt wird (Abbildung 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig04.jpg"> Abbildung 4: Datennormalisierung, Kettenlängenverteilung und durchschnittlicher Kettenlängenwert. Fluoreszenzspitzenbereiche wurden importiert und in einer Tabellenkalkulation normalisiert. Die Kettenlängenverteilung wird als Prozentsatz der DP für jede DP angezeigt. Die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) wird berechnet, indem jede prozentuale Kette multipliziert mit dem entsprechenden Polymerisationsgrad summiert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Schließlich wird die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) abgeleitet, indem die Summe jeder prozentualen Kette multipliziert mit dem entsprechenden Polymerisationsgrad berechnet wird. Ähnliche Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung an Kaninchenleberglykogen (Abbildung 5A), an Rinderleberglykogen (Abbildung 5B) und Austernglykogen (Abbildung 5C) durchgeführt.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig05.jpg"> Abbildung 5: Kettenlängenverteilung von kommerziellem Glykogen. Die Kaninchenleber (A), die Rinderleber (B) und das Austernglykogen (C) wurden in Gegenwart von abzweigenden Enzymen (Isoamylase und Pullulanase) inkubiert. Die APTS-markierten Glucane wurden dann nach ihrem Polymerisationsgrad (DP) mittels FACE-Analyse getrennt. Maltose (DP2), Maltohexaose (DP6) Maltopoetaose (DP7) stellen die am häufigsten vorkommenden Glucane in Kaninchenleber, Austern und Rinderleberglykogen dar. Der Standard Error of Mean (SEM) wurde aus drei unabhängigen Experimenten abgeleitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Kettenlängenverteilung von Kaninchenleberglykogen zeigte deutlich einen höheren Gehalt an kurzem Malto-Oligosaccharid (DP2) als an Rinderleberglykogen (DP 7) oder Austernglykogen (DP6). Infolgedessen besitzt das Kaninchenleberglykogen die niedrigste durchschnittliche Kettenlänge (ACL = 9,8) im Vergleich zu Rinderleberglykogen (ACL = 11,9) und Austernglykogen (ACL = 12,6). Es ist zu beachten, dass diese kommerziellen Glykogene normalerweise zur Bestimmung der Glykogenphosphorylase- oder Glykogensynthaseaktivität verwendet werden. Dies deutet darauf hin, dass die Bestimmung der kinetischen Parameter (Vmax und Km) der glykogenmetabolisierenden Enzymaktivitäten je nach Glykogenquelle variiert.
Subtraktive Analysen Die subtraktive Analyse ist eine einfache Methode, um die Glucankettenverteilung zweier Proben zu vergleichen. Zum Beispiel wurden CLDs von Glykogen, die durch den Wildtyp (WT) Synechocystis PCC6803-Stamm und einzelne isogene glgA1- und glgA2-Mutantenstämme produziert wurden, bestimmt (Abbildung 6A).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig06.jpg"> Abbildung 6: Vergleich der Kettenlängenverteilungen mittels subtraktiver Analyse. (A) Die Kettenlängenverteilungen von Glykogen, das von Cyanobakterienstämmen gereinigt wurde: Wildtyp (WT) Synechocystis PCC6803 und einzelne isogene glgA1 und glgA2 mutierte Stämme wurden mittels FACE-Analyse bestimmt. Der Standard Error of Mean (SEM) wurde aus drei unabhängigen Experimenten abgeleitet. (B) Subtraktive Analysen wurden durchgeführt, indem der Prozentsatz jeder EP von WT auf den % jedes DP von ΔglgA1 und der % jedes DP von WT zu dem % jedes DP von DP ΔglgA2 subtrahiert wurde. Diese einfache mathematische Manipulation zeigt die Veränderung von Glucanketten in mutierten Stämmen (schwarze Linien). (C) Die durchschnittlichen Kettenlängenverteilungen von Glykogen aus Wildtypen und Mutanten von Synechocystis wurden entsprechend dem für jede CLD beobachteten maximalen Peak (DP6 für alle Proben) normalisiert. Zwei Komponenten werden durch die Darstellung der normierten CLD auf einer logarithmischen Skala (Nde (DP)) nachgewiesen. Jede Komponente weist auf einen anderen Mechanismus des Wachstumsstopps hin (weitere Informationen finden Sie unter Referenz2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Zur Erinnerung: Die meisten Cyanobakterienstämme besitzen zwei Gene, die für Glykogensynthaseaktivitäten kodieren: GlgA1 und GlgA221. Beide Enzyme übertragen die Restglukose von ADP-Glucose auf die nicht reduzierenden Enden linearer Glucanketten. Wie in Abbildung 6A dargestellt, ist es schwierig, Proben zu vergleichen, indem nur die Verteilungsprofile der Kettenlänge betrachtet werden. Die subtraktive Analyse besteht aus der Subtraktion des Prozentsatzes jeder DP zwischen den Proben (Abbildung 6B). Die subtraktive Analyse von %DP von WT minus % der DP ΔglgA1-Mutante zeigt einen Überschuss von DP3, 4 und 5 (negative Werte) und einen verringerten Gehalt an DP 10-20. Im Gegensatz dazu zeigt die subtraktive Analyse zwischen %DP von WT und % der DP ΔglgA2-Mutante einen entgegengesetzten Effekt an. Da sich die subtraktiven Analyseprofile zwischen GlgA1 und GlgA2 unterscheiden, deutet dies auf eine spezifische Funktion jeder Glykogensynthase-Isoform in der Glykogenbiosynthesehin 21.
Es ist wichtig zu beachten, dass die subtraktive Analyse nur auf Experimente anwendbar ist, bei denen eine Referenzstichprobe parallel zu den Proben durchgeführt wird. Andernfalls kann die subtraktive Analyse empirisch sein, da sie auf der normierten CLD der Referenz liegt. Im Jahr 2015 schlugen Deng und Mitarbeiter, die Stoppmechanismen des Glykogenwachstums bei Mäusen und Menschen untersuchten, eine alternative Darstellung und Interpretation von Glykogen-CLDs vor, um dieses Problem anzugehen. Dieses Diagramm verwendet die maximale Peakfläche, um jede CLD zu normalisieren. Die Daten werden dann auf einer logarithmischen Skala dargestellt, wobei zwei Komponenten hervorgehoben werden. Letztere veranschaulichen zwei verschiedene Mechanismen für das Stoppen der Kettendehnung2. Durch das Zeichnen von Linien, die an die höhere DP-Komponente angepasst sind, können absolute Parameter (d. h. Steigungen und Schnittpunkte der Linien) für den CLD-Vergleich ohne Normalisierung auf ein Referenzprofil verwendet werden. CLDs des Wildtyps (WT) Synechocystis PCC6803-Stammes und der einzelnen isogenen glgA1- und glgA2-Mutanten wurden auf einer logarithmischen Skala aufgetragen und Passlinien für jedes Profil bestimmt (Abbildung 6C). Die erste Komponente war zwischen den Proben sehr ähnlich und erreichte ihren Höhepunkt mit einem Maximum bei DP 6. Dies zeigt, dass das verzweigte Enzym explizit ein Maximum solcher Ketten produziert. Die zweite Komponente erschien als breite Schulter, die bereits für Mäuse und menschliche Glykogene beschriebenwurde 2. Die Neigung der zweiten Komponente entstand bei einer höheren DP in ΔglgA1 und die Steigung der entsprechenden Formlinie (rote Linie) war geringer als das Wildtypprofil. So verlangsamt der Mangel an GlgA1 den Stillstand der Kettenverlängerung während der Biosynthese, die durch sterische Behinderung für Mäuse und menschliches Glykogen2 auftreten sollte. Diese Daten deuten darauf hin, dass das verbleibende längliche Enzym (d.h. GlgA2) längere Ketten vor dem Überfüllen der Kette produziert. In Δ glgA2 wurde der gegenteilige Effekt mit einem dramatischeren Abfall der passenden Linie beobachtet, was bestätigt, dass die vom verbleibenden GlgA1 erzeugten Ketten insgesamt kürzer sind als die, die von GlgA2 allein vor sterischer Behinderung synthetisiert wurden. Diese Analyse legt nahe, dass beide Isoformen eine unterschiedliche Kinetik besitzen und/oder dass sich ihre jeweilige Konzertierung mit der verzweigten Enzymaktivität unterscheidet.

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Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Im vorliegenden Protokoll wird die Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) -Technik verwendet, um die Kettenlängenverteilung (CLD) und die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) von Glykogen zu bestimmen.

Bestimmung der Glucankettenlängenverteilung von Glykogen mit der Fluorophor-gestützten Kohlenhydratelektrophorese-Methode (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Diese Methode ermöglicht ein besseres Verständnis der strukturellen Organisationen von Glykogenpartikeln. Es ist ein wichtiges Thema, weil die Population der Glucan-Ketten, die sogenannte Kettenlängenverteilung, die physikalischen chemischen Eigenschaften der Glykogenpartikel bestimmt. Wie z.B. Wasserlöslichkeit.Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass die Fluoreszenz unabhängig von der Glucan-Kettenlänge konstant ist. Es gibt nur ein APTS-Molekül, das durch Glucan gebunden ist. Somit ist die Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Anzahl der Glucan-Ketten.Das Gebiet der assistierten Kapillarelektrophorese eignet sich zur Lösung des medizinischen Mechanismus von Glykogenmetabolisierungsenzymen. Zum Beispiel können wir den Grad der Polymerisation von Glucan-Ketten bestimmen, die durch Verzweigen von Enzymen auf akzeptiertes Glucan übertragen werden. Die Reaktion muss unter Bedingungen durchgeführt werden.Daher müssen Regionen vor Feuchtigkeit geschützt werden. Mischen Sie 200 Mikroliter 0,5-2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes Glykogen mit 200 Mikrolitern 100 Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,8. Fügen Sie 2 Mikroliter Isoamylase und 1,5 Mikroliter Pullulanase hinzu.Vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mischen. Dann bei 42 Grad Celsius für 16 Stunden in einem 1,5-Milliliter-Rohr inkubieren. Stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten inkubieren.Zentrifugieren Sie bei 16, 100 mal G'für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletieren und zu entfernen. Entfernen Sie die Superwartung mit einer Pipette und übertragen Sie sie auf neue kommentierte Rohre. Nach Zugabe von Harzperlen in ein leeres Mikrofugenröhrchen entsalzen Sie die Überstände, indem Sie das Äquivalent von 100 Mikrolitern eines Anionenkationenaustauschharzes hinzufügen und rühren.Sammeln Sie die Proben durch Pipettieren und legen Sie sie in neue kommentierte Röhrchen. Gefriertrocknen Sie die Proben. Lagern Sie getrocknete Proben bei Raumtemperatur oder 20 Grad Celsius.Mischen Sie die getrockneten Proben mit 2 Mikrolitern 1 molaren Natriumcyanoborhydrid und Tetrahydrofuran und 2 Mikrolitern 8 Amino 1-3-6 Pyrentrisulfonsäure. Bei 42 Grad Celsius 16 Stunden im Dunkeln inkubieren. Geben Sie 46 Mikroliter Reinstwasser zu jeder Probe.Um die Proben 50 Mal zu verdünnen, fügen Sie einen Mikroliter der Probe zu 49 Mikrolitern Reinstwasser in 100-Mikroliter-Mikrofläschchen hinzu. Im Wirbel, um gründlich zu mischen. Legen Sie die Proben für 5 bis 10 Minuten ins Dunkel, während Sie das Gesicht einstellen.Um eine Elektrophorese mit umgekehrter Polarität durchzuführen, richten Sie die Methode ein und stellen Sie den Einspritzdruck auf 0,5 Pfund Kraft pro Quadratzoll ein. Stellen Sie dann die Polarität für die Trennung in den umgekehrten Modus ein. Verdünnen Sie den N-verknüpften Kohlenhydrat-Trennpuffer in Reinstwasser auf ein Drittel.Führen Sie die APTS-gekennzeichnete Glucan-Trennung im verdünnten Puffer bei 30 Kilovolt in einer blanken Quarzglaskapillare durch. Richten Sie dann die Injektionszeit ein und starten Sie die Analyse. Exportieren Sie die ASC- und CDF-Dateien, die das Elektropherogrammprofil bzw. die Integrationsdaten enthalten.Öffnen Sie die ASC-Datei und zeichnen Sie die relative Fluoreszenzeinheit gemäß dem Zeitdiagramm. Öffnen Sie die Datei CDF. Fahren Sie mit einer ersten automatischen Integration fort und passen Sie die folgenden Parameter mit Tal-zu-Tal-Integration und Mindestfläche an.Überprüfen und korrigieren Sie jedes fehlerhafte Integrationsereignis manuell. Die zwischen 4,13 und 4,67 Minuten beobachteten Fluoreszenzsignale stammten von den nicht reagierenden APTS. Die Aleutenzeit des markierten Maltohexaose DP 6 wurde auf 8,49 Minuten geschätzt.Die mit APTS gekennzeichneten Glucane aus Rinderglykogen wurden anhand der Aleutenzeit von DP 6 identifiziert. In der Kontrollprobe, in der Glykogen nicht mit abzweigenden Enzymen inkubiert wurde, wurde keine Spur von freiem Maltooligosaccharid nachgewiesen. Das Inset-Panel zeigt eine Trennung von Glucan-Ketten bis zu 44 DP. Die Kettenlängenverteilung wird als Prozentsatz der DP für jede DP angezeigt. Die durchschnittliche Kettenlänge wurde berechnet, indem jeder Prozentsatz der Kette mal den entsprechenden Polymerisationsgrad summiert wurde.Gesichtsanalysen zeigten, dass die am häufigsten vorkommenden Glucane Maltose- und Kaninchenleber, Maltohexaose in der Auster und Maltoheptaose in der Rinderleber sind. Die Kettenlängenverteilungen von Glykogen, das von Wildtyp- und mutierten Cyanobakterienstämmen gereinigt wurde, wurden mittels Gesichtsanalyse bestimmt. Subtraktive Analysen wurden durchgeführt, indem der Prozentsatz jedes DP des Wildtyps vom Prozentsatz jedes DP der Mutanten subtrahiert wurde.Die durchschnittlichen Kettenlängenverteilungen von Glykogen aus Wildtypen und Mutanten von Synechocystis wurden entsprechend dem für jede CLD beobachteten maximalen Peak normalisiert. Diese Technik ermöglicht ein besseres Verständnis menschlicher Krankheiten, die mit einem Defekt im Glykogenstoffwechsel verbunden sind, insbesondere der Andersen-Krankheit, reiche Ergebnisse aus der Ansammlung abnormaler Glykogenpartikel in Zellen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Ein Rapid-Laser Probing Verfahren erleichtert die Nicht-invasive und berührungslose Bestimmung der Blatt Thermische Eigenschaften

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

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