Name: determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method
Uploaded: 2022-03-31T13:20:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method at JoVE.com

इस काम को CNRS, Université de Lille CNRS, और ANR अनुदान "MathTest" (ANR-18-CE13-0027) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. debranching एंजाइमों के साथ इनक्यूबेशन
<ol><li>एसीटेट बफर (पीएच 4.8) के 100 mM के 200 μL के 200 μL के साथ 0.5-2 mg/mL पर शुद्ध ग्लाइकोजन के 200 μL को मिलाएं। isoamylase के 2 μL जोड़ें (प्रोटीन के 180 U / mg) और pullulanase के 1.5 μL (प्रोटीन के 30 U / mg) ( सामग्री की तालिका देखें), ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण, और एक 1.5 mL ट्यूब में 16 घंटे के लिए 42 °C पर incubate। नोट: ग्लाइकोजन शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान गिरावट या एमाइलेज संदूषण हो सकता है। मुक्त माल्टो-ओलिगोसेकेराइड्स की उपस्थिति की सराहना करने के लिए, नमूनों को समानांतर में डिब्रांचिंग एंजाइम कॉकटेल के बिना ऊष्मायन किया जा सकता है। एक मानक (उदाहरण के लिए, माल्टोहेप्टोज़) को विश्लेषण में शामिल किया गया है ताकि क्षालन समय और पोलीमराइजेशन की डिग्री के बीच संबंध निर्धारित किया जा सके।</li>
	<li>5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा प्रतिक्रियाओं को रोकें।</li>
	<li>गोली और किसी भी अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 16,100 x g पर सेंट्रीफ्यूज।</li>
	<li>एक पिपेट का उपयोग करके supernatants निकालें और उन्हें नए एनोटेट ट्यूबों के लिए स्थानांतरित करें। अनियन / धनायन विनिमय राल मोतियों (एजी -501-X8, सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL के बराबर जोड़कर supernatants desalt और आंदोलन।<ol>
<li>नियमित रूप से 5 मिनट के लिए मोतियों को उत्तेजित करें। pipetting द्वारा नमूने ले लीजिए और उन्हें नए एनोटेटेड ट्यूबों में जगह.</li>
	</ol>
</li>
	<li>फ्रीज-सूखा या नमूनों को सुखाने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम वाष्पीकरणकर्ता सेट अप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।</li>
	<li>सूखे नमूनों को कमरे के तापमान पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नोट: नमूने 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।</li>
</ol>2. रिडक्टिव एमिनेशन
<ol><li>टेट्राहाइड्रोफुरान (THF) में 1 M सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड के 2 μL और APTS के 2 μL (15% एसिटिक एसिड के 48 μL में पुन: निलंबित APTS के 5 मिलीग्राम) के साथ सूखे नमूनों को मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।</li>
	<li>अंधेरे में 16 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सावधानी: सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड को अनुकूलित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण ों के साथ और रासायनिक हुड के तहत संभाला जाता है। साँस लेना और त्वचा के साथ संपर्क अत्यधिक विषाक्त हैं और घातक हो सकते हैं, जिससे गंभीर त्वचा जलती है और आंखों को नुकसान होता है। एसिटिक एसिड के साथ सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड को मिलाते समय अत्यधिक जहरीली गैसें उत्पन्न की जा सकती हैं। पानी के संपर्क में, सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड ज्वलनशील गैसों को छोड़ता है, जो अनायास प्रज्वलित हो सकता है। केंद्रित नमूनों को एक रासायनिक हुड के तहत संभाला जाता है और इस चरण से शुरू होने वाले अनुकूलित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणका उपयोग किया जाता है।</li>
</ol>3. चेहरा विश्लेषण
<ol><li>प्रत्येक नमूने के लिए अल्ट्राप्योर पानी के 46 μL जोड़ें।</li>
	<li>100 μL की सूक्ष्म शीशियों में 1/50 के लिए सीधे नमूनों को पतला करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी के 49 μL करने के लिए नमूने के 1 μL जोड़ने के द्वारा. चेहरे (5-10 मिनट) को सेट करते समय नमूनों को अंधेरे में रखें।</li>
	<li>एक लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति (LIF) डिटेक्टर के साथ एक केशिका वैद्युतकणसंचलन उपकरण के साथ रिवर्स polarity वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन ( सामग्री की तालिका देखें)। पृथक्करण के लिए ध्रुवीयता को "रिवर्स मोड" पर सेट करें, 488 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर LIF और 512 एनएम पर डिटेक्टर सेट करें।</li>
	<li>10 s और 0.5 साई पर इंजेक्शन दबाव के लिए इंजेक्शन समय सेट करें।</li>
	<li>50 μm (375 μm बाहरी व्यास) के आंतरिक व्यास के साथ लंबाई में 60.2 सेमी की एक नंगे फ्यूज्ड सिलिका केशिका में 30 kV पर APTS-लेबल-ग्लूकन पृथक्करण पृथक्करण को पूरा करें, एन-लिंक्ड कार्बोहाइड्रेट पृथक्करण बफर में अल्ट्राप्योर पानी में 1/3 तक पतला ( सामग्री की तालिका देखें)। नोट:: एन-लिंक्ड कार्बोहाइड्रेट पृथक्करण बफ़र हर 20 रन बदल दिया है।</li>
</ol>4. डेटा प्रसंस्करण
<ol><li>निर्यात करें ". एएससी "और"। CDF "इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रोफ़ाइल और एकीकरण डेटा युक्त फ़ाइलें, क्रमशः।</li>
	<li>खोलें । ASC फ़ाइल और समय चार्ट के अनुसार सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाई आरेखित करें।</li>
	<li>खोलें । CDF फ़ाइल, एक पहले स्वचालित एकीकरण के साथ आगे बढ़ें और निम्न पैरामीटर समायोजित करें: चौड़ाई; घाटी से घाटी एकीकरण; न्यूनतम क्षेत्र।</li>
	<li>किसी भी अनुचित एकीकरण ईवेंट को मैन्युअल रूप से जाँचें और सही करें.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+randomly+hyperbranched+polymers:+Theory+and+simulation.">Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation.</a> The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).</li><li>Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers,+exemplified+by+glycogen.">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li><li>Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice.">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+glycogen+in+escherichia+coli.">Molecular structure of glycogen in escherichia coli.</a> BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li><li>Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+glycogen+and+starch+metabolism+in+eukaryotes+gives+molecular+clues+to+understand+the+establishment+of+plastid+endosymbiosis.">The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis.</a> Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).</li><li>Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+glycogen+biosynthesis+through+Monte+Carlo+simulation.">Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).</li><li>Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+molecular+design+in+the+evolution+of+metabolism:+The+glycogen+molecule.">Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule.</a> Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).</li><li>Mel&#233;ndez, R., Mel&#233;ndez-Hevia, E., Cascante, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+glycogen+structure+evolve+to+satisfy+the+requirement+for+rapid+mobilization+of+glucose?+A+problem+of+physical+constraints+in+structure+building.">How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building.</a> Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).</li><li>Mel&#233;ndez, R., Mel&#233;ndez-Hevia, E., Canela, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+structure+of+glycogen:+A+clever+solution+to+optimize+cell+metabolism.">The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism.</a> Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).</li><li>Wang, L., Wise, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+with+short+average+chain+length+enhances+bacterial+durability.">Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability.</a> Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).</li><li>Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+and+glycogen+storage+disorders.">Glycogen metabolism and glycogen storage disorders.</a> Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+of+glycogen+serving+as+a+durable+energy+reserve+in+bacteria.">Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+in+situ+progressive+N-terminal+is+still+controversial+truncation+of+glycogen+branching+enzyme+in+Escherichia+coli+DH5&#945;+on+glycogen+structure,+accumulation,+and+bacterial+viability.">Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5&#945; on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).</li><li>Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+physiological+mechanism+of+sugar+formation+in+the+liver.">On the physiological mechanism of sugar formation in the liver.</a> Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).</li><li>Liu, Q. -. H., Tang, J. -. W., Wen, P. -. B., Wang, M. -. M., Zhang, X., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+prokaryotes+to+eukaryotes:+Insights+into+the+molecular+structure+of+glycogen+particles.">From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).</li><li>Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1+H+NMR+visibility+of+mammalian+glycogen+in+solution.">1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).</li><li>O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-assisted+carbohydrate+electrophoresis+(FACE)+of+oligosaccharides:+Efficiency+of+labelling+and+high-resolution+separation.">Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation.</a> Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).</li><li>Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+distributions+of+chain+length+of+amylopectins+by+high-performance+liquid+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection.">Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection.</a> Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).</li><li>Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+starch+structure.">Analysis of starch structure.</a> Electrophoresis. 19, 2603-2611 (1998).</li><li>Guttman, A., Chen, F. -. T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+capillary+gel+electrophoresis+of+reducing+oligosaccharides+labeled+with+1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate.">High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate.</a> Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).</li><li>Kadouche, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+function+of+the+GlgA2+glycogen/starch+synthase+in+cyanobacterium+sp.+clg1+highlights+convergent+evolution+of+glycogen+metabolism+into+starch+granule+aggregation.">Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).</li><li>Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bound+substrate+in+the+structure+of+cyanobacterial+branching+enzyme+supports+a+new+mechanistic+model.">Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model.</a> The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).</li><li>Sawada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+reaction+characteristics+of+glucan+branching+enzymes+and+the+fine+structure+of+&#945;-glucan+from+various+sources.">Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of &#945;-glucan from various sources.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).</li><li>Wong, K. S., Jane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+debranched+amylopectin+by+HPAEC-PAD+with+a+post-column+enzyme+reactor.">Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).</li><li>Colleoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+chlamydomonas+reinhardtii+a-1,4+glucanotransferase+supports+a+direct+function+in+amylopectin+biosynthesis.">Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis.</a> Plant Physiology. 120, 9 (1999).</li><li>Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+MALDI-TOF+mass+spectrometry+and+HPAEC-PAD+analysis+of+debranched+starch.">A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch.</a> Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+glycogen+serves+as+a+critical+glucosamine+cache+required+for+protein+glycosylation.">Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation.</a> Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).</li></ol>

लेखकों के पास इस काम से जुड़े हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

ग्लाइकोजन कणों के भौतिक-रासायनिक गुण (जैसे, आकार, आकृति विज्ञान, घुलनशीलता) सीधे कणों की रचना करने वाले ग्लूकन की लंबाई से जुड़े होते हैं। बायोसिंथेटिक और कैटाबोलिक एंजाइमों के बीच किसी भी असंतुलन के परिणामस्वरूप श्रृंखला की लंबाई वितरण में परिवर्तन होता है और, प्रति से, असामान्य ग्लाइकोजन का संचय जो सेल11 के लिए खतरनाक हो सकता है। फेस विश्लेषण ग्लाइकोजन की श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) को निर्धारित करने के लिए पसंद की एक विधि है। जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है, सीएलडी का निर्धारण ग्लाइकोजन (एसीएल) के औसत श्रृंखला लंबाई मूल्य के अनुमान की अनुमति देता है, जो ग्लाइकोजन कणों की संरचना को प्रतिबिंबित करता है। उच्च एसीएल मूल्यों के साथ पशु ग्लाइकोजन असामान्य कणों की उपस्थिति से जुड़े होते हैं। subtractive विश्लेषण विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि (उत्परिवर्ती बनाम wildtype) से दो ग्लाइकोजन नमूनों की तुलना करने के लिए एक सहायक विधि है। दूसरी ओर, अधिकतम शिखर पर सामान्यीकृत लॉगरिदमिक पैमाने पर सीएलडी की साजिश रचकर, एक संदर्भ से स्वतंत्र रूप से सीएलडी की तुलना करने का लाभ है और हमें बढ़ते ग्लाइकोजन तंत्र के बारे में जानकारी दी है।
इसके अलावा, फेस विश्लेषण ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइमों के उत्प्रेरक गुणों की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। उदाहरण के लिए, सभी ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम (1 → 4) - लिंकेज α और ओलिगोमाल्टोसिल समूहों को (1 → 6) पर स्थानांतरित करते हैं - α स्थिति या ब्रांचिंग बिंदु। ब्रांचिंग एंजाइम पॉलीसेकेराइड (जैसे, एमाइलोपेक्टिन, ग्लाइकोजन) के लिए उनकी आत्मीयता और समान उत्प्रेरक तंत्र22 के बावजूद स्थानांतरित ग्लूकन की लंबाई के कारण अलग-अलग होते हैं। इस प्रकार, ब्रांचिंग एंजाइमों (मानव, पौधे, बैक्टीरिया) के विभिन्न स्रोतों को फेस विश्लेषण23 का उपयोग करके इनक्यूबेशन प्रयोगों और सीएलडी तुलनाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से विशेषता और वर्गीकृत किया जा सकता है।
जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, HPAEC-PAD भी श्रृंखला लंबाई वितरण18 को निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक विधि है। दोनों तकनीकों के पूर्ण हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता होती है (1 → 6) - α लिंकेज या ब्रांचिंग बिंदुओं को आइसोएमाइलेज-प्रकार के डिब्रांचिंग एंजाइमों द्वारा उनके पोलीमराइजेशन (डीपी) की डिग्री के अनुसार रैखिक ग्लूकन के पूल को अलग करने से पहले। हालांकि, HPAEC-PAD विधि चेहरे की तुलना में दो नुकसान ों को आश्रय देती है: (1) amperometric पल्स प्रतिक्रिया कम हो जाती है क्योंकि ग्लूकन श्रृंखलाएं बढ़ जाती हैं, जो मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करती हैं। इस बड़े पैमाने पर पूर्वाग्रह के मुद्दे को HPAEC-ENZ-PAD का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है जिसमें अनियन एक्सचेंज कॉलम और पीएडी24 के बीच एक पोस्ट-कॉलम एंजाइम रिएक्टर शामिल है। स्तंभ एंजाइम रिएक्टर ग्लूकोज अवशेषों में माल्टो-ओलिगोसेकेराइड्स को हाइड्रोलाइज़ करता है जिससे एक निरंतर नाड़ी एम्पेरोमेट्रिक प्रतिक्रिया की अनुमति मिलती है। (2) एचपीएईसी-पीएडी 70 तक पोलीमराइजेशन की डिग्री के साथ ग्लूकन चेन के अलगाव की अनुमति देता है। यद्यपि संकल्प ग्लाइकोजन नमूनों के सीएलडी को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है, फेस 150 तक डीपी के साथ श्रृंखलाओं को अलग करता है, जो स्टार्च के नमूनों के लिए उपयुक्तहै। यह ध्यान में रखना आवश्यक है कि एचपीएईसी-पीएडी और फेस विश्लेषण दोनों में पेशेवरों और विपक्ष हैं। उदाहरण के लिए, एमिनेशन प्रतिक्रिया को एपीटीएस के प्राथमिक अमाइन फ़ंक्शन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एक मुक्त हेमीएसिटल समूह की आवश्यकता होती है। इसका तात्पर्य यह है कि एपीटीएस लेबलिंग का उपयोग ग्लूकन चेन के लिए नहीं किया जा सकता है, जिसमें कम करने वाले सिरों की कमी होती है (उदाहरण के लिए, इनुलिन)। HPAEC-PAD विधि को सिरों को कम करने की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है। HPAEC-PAD विधि का एक दूसरा दिलचस्प पहलू यह है कि अनियन एक्सचेंज कॉलम को रैखिक ग्लूकन के कुछ मिलीग्राम के साथ लोड किया जा सकता है, जिससे एक विशिष्ट डीपी या 14सी-रेडियोलेबल माल्टो-ओलिगोसेकेराइड के साथ माल्टो-ओलिगोसेकेराइड के शुद्धिकरण की अनुमति मिलती है एंजाइमेटिक परख18,25 के लिए। अंत में, हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जैसे, MALDI-TOF) श्रृंखला की लंबाई वितरण को निर्धारित करने के लिए एक तेज और संवेदनशील तकनीक है, यह तकनीक कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतीत होती है। यह लंबी ग्लूकन चेन26 की मात्रा को अतिरंजित करता है। फिर भी, उत्तरार्द्ध का उपयोग सेलुलर ऊतक27 में ग्लाइकोजन की उपस्थिति को मैप करने के लिए MALDI इमेजिंग जैसे एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए किया जा सकता है।

ग्लाइकोजन, कार्बन और ऊर्जा भंडारण के रूप में उपयोग किया जाता है, ग्लूकोज का एक होमोपॉलिमर है जिसमें ग्लूकोसिल इकाइयों की रैखिक श्रृंखलाएं शामिल हैं जो (1 → 4) से जुड़ी होती हैं - α बांड और (1 → 6) के माध्यम से जुड़ी होती हैं - α ग्लाइकोसिडिक बांड या ब्रांचिंग पॉइंट्स। वे जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के साइटोसोल में β- और α-कणों के रूप में दिखाई देते हैं। β कण छोटे पानी में घुलनशील कण होते हैं जो मुख्य रूप से प्रोकैरियोट्स में देखे जाते हैं। उनका व्यास 20-40 एनएम से होता है, संभवतः ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइमों और स्टेरिक बाधा 1,2 द्वारा निर्धारित किया जाता है।
सबसे पहले पशु कोशिकाओं में वर्णित, बड़े α-कण एक फूलगोभी जैसे आकार के साथ व्यास में 300 एनएम तक प्रदर्शित होते हैं। यह विशेष संगठन कई β-कणों के एकत्रीकरण से उत्पन्न हो सकता है या एक एकल β-कण 3 से बाहर निकलने से उत्पन्न हो सकताहै। दिलचस्प बात यह है कि हाल ही के एक अध्ययन ने एस्चेरिचिया कोलाई4 में α-कणों की उपस्थिति की सूचना दी है। हालांकि, पशु कोशिकाओं से α-कणों के विपरीत, निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान उत्तरार्द्ध जल्दी से अलग हो जाता है, जो साहित्य 4 में डेटा की कमी की व्याख्या कर सकताहै। यूकेरियोट्स और प्रोकैरियोट्स में α-कणों की उपस्थिति में फाइलोजेनेटिक रूप से असंबंधित ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइमशामिल हैं 5। यह ऐसे कणों के कार्य और β-कणों के बीच संभावित क्रॉस-लिंकर एजेंटों की प्रकृति के बारे में सवाल उठाताहै।
यद्यपि ग्लाइकोजन अणु गठन 6,7,8,9 के लिए दो विरोधी गणितीय मॉडल प्रस्तावित किए गए थे, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि β-कण बड़ी मात्रा में ग्लूकोज की तेजी से रिहाई के लिए एक अत्यधिक कुशल ईंधन भंडार के रूप में अपने चयापचय समारोह के जवाब में विकसित हुए हैं। साक्ष्य का एक बड़ा शरीर इंगित करता है कि ग्लाइकोजन गुण जैसे कि पानी में पाचन और घुलनशीलता औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) के साथ सहसंबद्ध हैं, जो तब ब्रांचिंग बिंदुओं के प्रतिशत और कण आकार 2,6,7,8,10,11 को निर्देशित करेगा। . एसीएल को ग्लूकोज अवशेषों की कुल संख्या और ब्रांचिंग बिंदुओं की संख्या के बीच के अनुपात से परिभाषित किया गया है। आमतौर पर, एसीएलमान यूकेरियोट्स और प्रोकैरियोट्स में क्रमशः 11-14 और 7-23 ग्लूकोज अवशेषों से भिन्न होते हैं। मनुष्यों में, कई ग्लाइकोजन विकार रोग असामान्य ग्लाइकोजन संचय के कारण होते हैं। उदाहरण के लिए, एंडरसन की बीमारी ग्लाइकोजन ब्रांचिंग एंजाइम की कमी गतिविधि से जुड़ी हुई है, जिसके परिणामस्वरूप असामान्य ग्लाइकोजन11 का संचय होता है। प्रोकैरियोट्स में, संचयी अध्ययनों से पता चलता है कि एसीएल एक महत्वपूर्ण कारक है जो ग्लाइकोजन और बैक्टीरियल जीवित रहने की क्षमता12,13 की गिरावट दर को प्रभावित करता है। यह बताया गया है कि कम एसीएल मूल्य के साथ β-कणों को संश्लेषित करने वाले बैक्टीरिया अधिक धीरे-धीरे कम हो जाते हैं और इसलिए भुखमरी की स्थिति का सामना करते हैं। इस प्रकार, मानव ग्लाइकोजन भंडारण रोगों में असामान्य ग्लाइकोजन कणों के गठन को समझने के लिए β-कणों की वास्तुकला का ज्ञान आवश्यक है और पोषक तत्वों की कमी वाले वातावरण में प्रोकैरियोट्स जीवित रहते हैं।
उन्नीसवीं शताब्दी के अंत में फ्रांसीसी फिजियोलॉजिस्ट क्लाउड बर्नार्ड द्वारा कुत्ते के जिगर से ग्लाइकोजन के पहले अलगाव के बाद से,ग्लाइकोजन कणों को विस्तार से चिह्नित करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया था। उदाहरण के लिए, ग्लाइकोजन आकृति विज्ञान (α- या β-कणों) के लिए संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 15, α-1,6 लिंकेज16 के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए प्रोटॉन-एनएमआर स्पेक्ट्रोमेट्री, आणविक वजन का अनुमान लगाने के लिए बहु-डिटेक्टरों के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (फेस) 17 या चेन लंबाई वितरण (सीएलडी) दोनों के लिए स्पंदित एम्पेरोमेट्रिक डिटेक्शन (एचपीएईसी-पैड) के साथ उच्च-प्रदर्शन अनियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी दोनों श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) और एसीएल के लिए स्पंदित एम्पेरोमेट्रिक डिटेक्शन (एचपीएईसी-पीएडी) के साथ उच्च प्रदर्शन अनियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी निर्धारण18.
यह काम फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन विधि पर केंद्रित है, जो प्राथमिक अमाइन फ़ंक्शन द्वारा हेमीएसिटल समूह के रिडक्टिव एमिनेशन पर निर्भर करता है। ऐतिहासिक रूप से, 8-एमिनो-1,3,6-नेप्थलीन ट्राइसल्फोनिक एसिड (एएनटी) का उपयोग पहली बार लेबलिंग के लिए किया गया था। बाद में, इसे अधिक संवेदनशील फ्लोरोफोर, 8-एमिनो 1,3,6 पाइरेनी ट्राइसल्फोनिक एसिड (एपीटीएस) 19 द्वारा बदल दिया गया था।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig01.jpg"> चित्रा 1: 8-एमिनो 1,3,6 पाइरेनी ट्राइसल्फोनिक एसिड (एपीटीएस) के साथ रिडक्टिव एमिनेशन प्रतिक्रिया। 8-एमिनो 1,3,6 पाइरेनी ट्राइसल्फोनिक एसिड (एपीटीएस) के प्राथमिक अमाइन फ़ंक्शन द्वारा हेमिसीटल समूह की रिडक्टिव एमिनेशन प्रतिक्रिया कम करने वाली स्थितियों के तहत <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
जैसा कि चित्रा 1 में दर्शाया गया है, एक ग्लूकन श्रृंखला के कम करने वाले अंत का हेमीसेटल फ़ंक्शन कम करने की स्थिति में एपीटीएस के प्राथमिक अमाइन के साथ बातचीत करता है। एपीटीएस के सल्फोनिक समूह नकारात्मक आवेश लेते हैं जो पोलीमराइजेशन (डीपी) की अपनी डिग्री के अनुसार ग्लूकन चेन के अलगाव को सक्षम करते हैं। रिडक्टिव अमाइन प्रतिक्रिया अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य और कुशल है। DP3 से DP135 के लिए 80% की औसत दक्षता लेबलिंग प्राप्त की जाती है और माल्टोज (DP2) और ग्लूकोज के लिए क्रमशः88% और 97% तक प्राप्त की जाती है, क्रमशः 17,20। क्योंकि एपीटीएस का एक अणु प्रत्येक ग्लूकन श्रृंखला के कम करने के अंत के साथ प्रतिक्रिया करता है, व्यक्तिगत श्रृंखलाओं को एक दाढ़ के आधार पर एक दूसरे की तुलना में परिमाणित और तुलना की जा सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AG-501-X8 Resin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1436424</td>
			<td>Storage Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water&#8212;storage at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS stock solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>09341-5MG</td>
			<td>Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>select :File&#62;import/restore&#62;ANDI/chromatography in the open window: select &#34;add&#34; select cdf&#160; file &#62; import &#62; next 
			Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software&#62; finish click on QNT-Editor&#62; parameter &#34;Min Area&#34; select &#34;Range&#34; 0.05 [Signal]*min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Open Excel&#62; New file&#62; save the file &#62; File menu click on Import &#62; In the open window choose &#34;csv.&#34; as type file &#62; select your asc file &#62; a new window appears Step 1: choose Macintosh or&#160; Window and then used default setting for the steps 2 and 3. &#62; Y values appear in column A&#62; Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Dry apparatus</td>
			<td>Christ</td>
			<td>alpha 2-4 LO plus</td>
			<td>before the freezing-drying process, samples are stored at -80 &#176;C for 1 h.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-ISAMY</td>
			<td>180 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltoheptaose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Linked carbohydrate separation buffer</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td>477623</td>
			<td>Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pullulanase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-PULKP</td>
			<td>30 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296813-100ML</td>
			<td>1 M Sodium cyanoborohydride in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum-evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Set the temperature at 30 &#176;C. Centrifuge until the samples are dried</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method

ग्लाइकोजन कण शाखित पॉलीसेकेराइड होते हैं जो ग्लूकोसिल इकाइयों की रैखिक श्रृंखलाओं से बने होते हैं जो α-1,4 ग्लूकोसाइड बांड से जुड़े होते हैं। उत्तरार्द्ध α-1,6 ग्लूकोसाइड लिंकेज द्वारा एक-दूसरे से जुड़े होते हैं, जिन्हें शाखा बिंदुओं के रूप में संदर्भित किया जाता है। कार्बन भंडारण के विभिन्न रूपों (यानी, स्टार्च, β-ग्लूकन) के बीच, ग्लाइकोजन शायद जीवित दुनिया भर में पाए जाने वाले सबसे पुराने और सबसे सफल भंडारण पॉलीसेकेराइड में से एक है। ग्लूकन चेन को व्यवस्थित किया जाता है ताकि आवश्यकता पड़ने पर बड़ी मात्रा में ग्लूकोज को जल्दी से सेल में संग्रहीत या ईंधन दिया जा सके। ग्लाइकोजन कणों की ठीक संरचना को हल करने के लिए पिछले दशकों में कई पूरक तकनीकों को विकसित किया गया है। यह आलेख फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (FACE) का वर्णन करता है। यह विधि ग्लूकन चेन की आबादी को निर्धारित करती है जो ग्लाइकोजन कण की रचना करती है। श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) के रूप में भी जाना जाता है, यह पैरामीटर कण आकार और ब्रांचिंग के प्रतिशत को प्रतिबिंबित करता है। यह ग्लाइकोजन जैवसंश्लेषण के गणितीय मॉडलिंग के लिए भी एक आवश्यक आवश्यकता है।

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Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

वर्तमान प्रोटोकॉल में, फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (फेस) तकनीक का उपयोग श्रृंखला लंबाई वितरण (सीएलडी) और ग्लाइकोजन की औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

Glucan श्रृंखला लंबाई का निर्धारण Fluorophore-Assisted कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (FACE) विधि का उपयोग कर ग्लाइकोजन के वितरण

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

यह विधि ग्लाइकोजन कणों के संरचनात्मक संगठनों की बेहतर समझ प्रदान करती है। यह एक महत्वपूर्ण मुद्दा है क्योंकि ग्लूकन श्रृंखलाओं की आबादी, तथाकथित श्रृंखला लंबाई वितरण, ग्लाइकोजन कणों के भौतिक रासायनिक गुणों को निर्धारित करता है। जैसे पानी की घुलनशीलता।इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि ग्लूकोन श्रृंखला की लंबाई की परवाह किए बिना प्रतिदीप्ति स्थिर है। ग्लूकन द्वारा बाध्य केवल एक एपीटीएस अणु है। इस प्रकार, प्रतिदीप्ति तीव्रता सीधे ग्लूकन श्रृंखलाओं की संख्या के लिए आनुपातिक है।सहायक केशिका वैद्युतकणसंचलन के लिए क्षेत्र ग्लाइकोजन चयापचय एंजाइमों के चिकित्सा तंत्र को हल करने के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए, हम स्वीकार किए गए ग्लूकन पर एंजाइमों को ब्रांच करके स्थानांतरित ग्लूकन चेन के पोलीमराइजेशन की डिग्री निर्धारित कर सकते हैं। प्रतिक्रिया को परिस्थितियों में किया जाना चाहिए।इसलिए, क्षेत्रों को नमी से बचाया जाना चाहिए। पीएच 4.8 के 100 एसीटेट बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ शुद्ध ग्लाइकोजन के प्रति मिलीलीटर 0.5-2 मिलीग्राम के 200 माइक्रोलीटर को मिलाएं। Isoamylase के 2 माइक्रोलीटर, और Pullulanase के 1.5 माइक्रोलीटर जोड़ें।ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण. फिर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 16 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा प्रतिक्रियाओं को रोकें।16 पर सेंट्रीफ्यूज, 100 बार जी 'कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गोली और किसी भी अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए। एक पिपेट के साथ सुपर रखरखाव निकालें और उन्हें नए एनोटेट ट्यूबों में स्थानांतरित करें। खाली माइक्रो-फ्यूज ट्यूब में राल मोतियों को जोड़ने के बाद, एक अनियन धनायन विनिमय राल मोतियों के 100 माइक्रोलीटर के बराबर जोड़कर supernatants desalt और आंदोलन।pipetting द्वारा नमूनों को ले लीजिए, और उन्हें नए एनोटेटेड ट्यूबों में जगह है। फ्रीज के नमूनों को सूखा. सूखे नमूनों को कमरे के तापमान या 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।सूखे नमूनों को 1 दाढ़ सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड और टेट्राहाइड्रोफ्यूरन के 2 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं, और 8 अमीनो 1-3-6 पाइरेनी ट्राइसल्फोनिक एसिड के 2 माइक्रोलीटर। अंधेरे में 16 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक नमूने के लिए अल्ट्रा शुद्ध पानी के 46 माइक्रोलीटर जोड़ें।नमूनों को 50 बार पतला करने के लिए, 100 माइक्रोलीटर माइक्रोवियल्स में अल्ट्रा शुद्ध पानी के 49 माइक्रोलीटर में नमूने का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर में अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए। चेहरे को सेट करते समय नमूनों को 5 से 10 मिनट के लिए अंधेरे में रखें।रिवर्स ध्रुवीयता वैद्युतकणसंचलन करने के लिए, विधि स्थापित करें, इंजेक्शन दबाव को प्रति वर्ग इंच 0.5 पाउंड बल पर सेट करें। फिर ध्रुवीयता को पृथक्करण के लिए रिवर्स मोड पर सेट करें। अल्ट्रा शुद्ध पानी में एन-लिंक्ड कार्बोहाइड्रेट पृथक्करण बफर को एक-तिहाई तक पतला करें।एक नंगे फ्यूज्ड सिलिका केशिका में 30 किलोवोल्ट पर पतला बफर में GUTCANS पृथक्करण लेबल वाले APTS को पूरा करें। फिर इंजेक्शन का समय सेट करें, और विश्लेषण शुरू करें। एएससी और सीडीएफ फ़ाइलों को क्रमशः इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रोफ़ाइल और एकीकरण डेटा वाले निर्यात करें।ASC फ़ाइल खोलें और समय चार्ट के अनुसार सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाई आरेखित करें। CDF फ़ाइल खोलें। पहले स्वचालित एकीकरण के साथ आगे बढ़ें और घाटी के साथ घाटी एकीकरण और न्यूनतम क्षेत्र के साथ निम्नलिखित मापदंडों को समायोजित करें।किसी भी अनुचित एकीकरण ईवेंट को मैन्युअल रूप से जाँचें और सही करें. 4.13 और 4.67 मिनट के बीच देखे गए प्रतिदीप्ति संकेतों की उत्पत्ति अप्रभावित एपीटीएस से हुई थी। लेबल माल्टोहेक्साओस डीपी 6 के अलेउटियन समय का अनुमान 8.49 मिनट लगाया गया था।गोजातीय ग्लाइकोजन के Glucans लेबल वाले APTS की पहचान DP 6 के Aleutian समय के आधार पर की गई थी। नियंत्रण नमूने में मुक्त माल्टोओलिगोसेकेराइड का कोई निशान नहीं पाया गया था जिसमें ग्लाइकोजन को डिब्रांचिंग एंजाइमों के साथ इनक्यूबेट नहीं किया गया था। इनसेट पैनल 44 डीपी तक ग्लूकन चेन का एक अलगाव दिखाता है। श्रृंखला लंबाई वितरण प्रत्येक डीपी के लिए डीपी के प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है। औसत श्रृंखला लंबाई की गणना प्रत्येक प्रतिशत श्रृंखला समय को संक्षेप में करके की गई थी पोलीमराइजेशन की इसी डिग्री।चेहरे के विश्लेषण से पता चला है कि सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लूकन माल्टोज और खरगोश जिगर, सीप में माल्टोहेक्साओस, और गोजातीय जिगर में माल्टोहेप्टोज़ हैं। जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती साइनोबैक्टीरिया बैक्टीरिया उपभेदों से शुद्ध ग्लाइकोजन की श्रृंखला लंबाई वितरण को चेहरे के विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। Subtractive विश्लेषण उत्परिवर्ती के प्रत्येक डीपी के प्रतिशत से जंगली प्रकार के प्रत्येक डीपी के प्रतिशत को घटाकर किया गया था।जंगली प्रकार से ग्लाइकोजन की औसत श्रृंखला लंबाई वितरण और Synechocystis के उत्परिवर्ती प्रत्येक CLD के लिए मनाया अधिकतम चोटी के अनुसार सामान्यीकृत किया गया था। यह तकनीक ग्लाइकोजन चयापचय में दोष से जुड़े मानव रोगों की बेहतर समझ की अनुमति देती है, विशेष रूप से एंडरसन रोग रोग, कोशिकाओं में असामान्य ग्लाइकोजन कणों के संचय से समृद्ध परिणाम।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

कार्बोहाइड्रेट अपमानजनक एंजाइमों की उच्च throughput स्क्रीनिंग उपन्यास अघुलनशील chromogenic सब्सट्रेट परख किट का उपयोग

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

एक रैपिड लेजर जांच विधि पत्ता तापीय गुणों की गैर-आक्रामक और संपर्क मुक्त निर्धारण की सुविधा

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी isoforms की केशिका वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण एक तटस्थ केशिका का उपयोग

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी काइनेटिक्स का निर्धारण चार Biosensor प्लेटफार्मों का उपयोग

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

मूल विलासितालयों, इन-जेल एसेज़ और इलेक्ट्रोलाउशन के साथ मिटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन के सुपरकॉम्प्लेक्सेस का विश्लेषण करना

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyanobacteria में ग्लाइकोजन सामग्री का निर्धारण

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

उच्च प्रवाह, मात्रात्मक डॉट दाग विश्लेषण का उपयोग ऊतक के स्तर पर एक चयनित प्रोटीन की सामग्री का निरपेक्ष निर्धारण (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

हाइब्रिड स्पष्ट/माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला Supercomplexes के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए प्राकृतिक इलेक्ट्रोफोरेसिस

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

डीएनए वैद्युतिडियम या वैकल्पिक रंजक के बजाय Thiazole ऑरेंज का उपयोग कर Electrophoresis

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...