Name: determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method
Uploaded: 2022-03-31T13:20:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal CNRS, dall'Université de Lille CNRS e dalle sovvenzioni ANR "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).

1. Incubazione con enzimi di deramificazione
<ol><li>Miscelare 200 μL di glicogeno purificato a 0,5-2 mg/mL con 200 μL di 100 mM di tampone acetato (pH 4,8). Aggiungere 2 μL di isoamilasi (180 U/mg di proteine) e 1,5 μL di pullulanasi (30 U/mg di proteine) (vedere Tabella dei materiali), mescolare delicatamente per pipettatura su e giù e incubare a 42 °C per 16 ore in un tubo da 1,5 ml. NOTA: la degradazione o la contaminazione da amilasi potrebbero verificarsi durante il processo di purificazione del glicogeno. Per apprezzare la presenza di malto-oligosaccaridi liberi, i campioni possono essere incubati senza il cocktail enzimatico di deristrazione in parallelo. Uno standard (ad esempio, maltoeptasio) è incluso nell'analisi per determinare la relazione tra il tempo di eluizione e il grado di polimerizzazione.</li>
	<li>Interrompere le reazioni incubando a 95 °C per 5 minuti.</li>
	<li>Centrifugare a 16.100 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare e rimuovere qualsiasi materiale insolubile.</li>
	<li>Rimuovere i supernatanti utilizzando una pipetta e trasferirli in nuovi tubi annotati. Dissalare i supernatanti aggiungendo l'equivalente di 100 μL di perle di resina a scambio anionico/cationico (AG-501-X8, vedi Tabella dei materiali) e agitare.<ol>
<li>Agitare regolarmente le perline per 5 minuti. Raccogliere i campioni mediante pipettaggio e inserirli in nuovi tubi annotati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizzare o utilizzare un evaporatore sottovuoto impostato (vedi Tabella dei materiali) a 30 °C per asciugare i campioni.</li>
	<li>Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente o a -20 °C. NOTA: I campioni possono essere conservati per 1 mese.</li>
</ol>2. Aminazione riduttiva
<ol><li>Mescolare i campioni essiccati con 2 μL di cianoboroidruro di sodio 1 M in tetraidrofurano (THF) e 2 μL di APTS (5 mg di APTS risospeso in 48 μL di acido acetico al 15%) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare a 42 °C per 16 ore al buio. ATTENZIONE: Il cianoboroidruro di sodio viene maneggiato con dispositivi di protezione individuale adattati e sotto un cappuccio chimico. L'inalazione e il contatto con la pelle sono altamente tossici e possono essere fatali, causando gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Gas altamente tossici possono essere generati quando si mescola cianoboroidruro di sodio con acido acetico. A contatto con l'acqua, il cianoboroidruro di sodio rilascia gas infiammabili, che possono infiammarsi spontaneamente. I campioni concentrati vengono maneggiati sotto un cappuccio chimico e utilizzando dispositivi di protezione individuale adattati a partire da questa fase.</li>
</ol>3. Analisi DEL VISO
<ol><li>Aggiungere 46 μL di acqua ultrapura a ciascun campione.</li>
	<li>Diluire i campioni direttamente a 1/50 in micro flaconcini da 100 μL aggiungendo 1 μL del campione a 49 μL di acqua ultrapura. Tenere i campioni al buio mentre si imposta il VISO (5-10 min).</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi a polarità inversa con uno strumento di elettroforesi capillare con un rivelatore a fluorescenza indotta da laser (LIF) (vedere Tabella dei materiali). Impostare la polarità su "modalità inversa" per la separazione, impostare l'LIF a 488 nm di lunghezza d'onda di emissione e il rivelatore a 512 nm.</li>
	<li>Impostare il tempo di iniezione per 10 s e la pressione di iniezione a 0,5 psi.</li>
	<li>Effettuare la separazione dei glucani marcati APTS a 30 kV in un capillare di silice fusa nuda di 60,2 cm di lunghezza con un diametro interno di 50 μm (diametro esterno 375 μm) nel tampone di separazione dei carboidrati N-linked diluito a 1/3 in acqua ultrapura (vedi Tabella dei materiali). NOTA: il buffer di separazione dei carboidrati legato all'N viene sostituito ogni 20 corse.</li>
</ol>4. TRATTAMENTO DEI DATI
<ol><li>Esporta il file ". ASC "e ". CDF "file contenenti rispettivamente il profilo dell'elettroferogramma e i dati di integrazione.</li>
	<li>Aprire il file . ASC e disegnare l'unità di fluorescenza relativa in base al grafico temporale.</li>
	<li>Aprire il file . CDF , procedere con una prima integrazione automatica e regolare i seguenti parametri: larghezza; integrazione da valle a valle; area minima.</li>
	<li>Controllare e correggere manualmente qualsiasi evento di integrazione improprio.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+randomly+hyperbranched+polymers:+Theory+and+simulation.">Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation.</a> The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).</li><li>Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers,+exemplified+by+glycogen.">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li><li>Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice.">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+glycogen+in+escherichia+coli.">Molecular structure of glycogen in escherichia coli.</a> BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li><li>Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. 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A problem of physical constraints in structure building.</a> Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).</li><li>Mel&#233;ndez, R., Mel&#233;ndez-Hevia, E., Canela, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+structure+of+glycogen:+A+clever+solution+to+optimize+cell+metabolism.">The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism.</a> Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).</li><li>Wang, L., Wise, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+with+short+average+chain+length+enhances+bacterial+durability.">Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability.</a> Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).</li><li>Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+and+glycogen+storage+disorders.">Glycogen metabolism and glycogen storage disorders.</a> Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+of+glycogen+serving+as+a+durable+energy+reserve+in+bacteria.">Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+in+situ+progressive+N-terminal+is+still+controversial+truncation+of+glycogen+branching+enzyme+in+Escherichia+coli+DH5&#945;+on+glycogen+structure,+accumulation,+and+bacterial+viability.">Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5&#945; on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).</li><li>Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+physiological+mechanism+of+sugar+formation+in+the+liver.">On the physiological mechanism of sugar formation in the liver.</a> Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).</li><li>Liu, Q. -. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+glycogen+serves+as+a+critical+glucosamine+cache+required+for+protein+glycosylation.">Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation.</a> Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse associati a questo lavoro.

Le proprietà fisico-chimiche delle particelle di glicogeno (ad esempio, dimensioni, morfologia, solubilità) sono direttamente associate alla lunghezza dei glucani che compongono le particelle. Qualsiasi squilibrio tra enzimi biosintetici e catabolici provoca l'alterazione della distribuzione della lunghezza della catena e, di per sé, l'accumulo di glicogeno anormale che può essere pericoloso per la cellula11. L'analisi FACE è un metodo di scelta per determinare la distribuzione della lunghezza della catena del glicogeno (CLD). Come illustrato nella Figura 2, la determinazione del CLD consente l'inferenza del valore medio di lunghezza della catena del glicogeno (LCA), che rispecchia la struttura delle particelle di glicogeno. I glicogeni animali con alti valori di LCA sono associati alla comparsa di particelle anormali. L'analisi sottrattiva è un metodo utile per confrontare due campioni di glicogeno provenienti da diversi background genetici (mutante contro wildtype). Tracciando su scala logaritmica i CLD normalizzati al picco massimo, d'altra parte, hanno il vantaggio di confrontare CLD indipendentemente da un riferimento e ci hanno dato informazioni sul meccanismo del glicogeno in crescita.
Inoltre, l'analisi FACE è una potente tecnica per caratterizzare le proprietà catalitiche degli enzimi che metabolizzano il glicogeno. Ad esempio, tutti gli enzimi ramificati del glicogeno scisdono (1 → 4)-α legami e trasferiscono gruppi oligomaltosilici su una posizione (1 → 6)-α o punti di ramificazione. Gli enzimi ramificati sono distinguibili per la loro affinità con i polisaccaridi (ad esempio, amilopectina, glicogeno) e la lunghezza dei glucani trasferiti nonostante il meccanismo catalitico simile22. Pertanto, varie fonti di enzimi ramificati (umani, vegetali, batteri) possono essere caratterizzate e classificate attraverso una serie di esperimenti di incubazione e confronti CLD utilizzando l'analisi FACE23.
Come accennato nell'introduzione, HPAEC-PAD è anche un metodo alternativo per determinare la distribuzione della lunghezza della catena18. Entrambe le tecniche richiedono l'idrolisi completa di (1 → 6)-α collegamenti o punti di ramificazione da parte di enzimi di debranching di tipo isoamilasi prima di separare il pool di glucani lineari in base al loro grado di polimerizzazione (DP). Tuttavia, il metodo HPAEC-PAD presenta due svantaggi rispetto a FACE: (1) la risposta amperometrica all'impulso diminuisce all'aumentare delle catene glucano, il che non fornisce informazioni quantitative. Questo problema di polarizzazione di massa può essere aggirato utilizzando HPAEC-ENZ-PAD che coinvolge un reattore enzimatico post-colonna tra la colonna di scambio anionico e PAD24. Il reattore enzimatico a colonna idrolizza i malto-oligosaccaridi in residui di glucosio consentendo una risposta amperometrica a impulsi costanti. (2) L'HPAEC-PAD consente la separazione di catene di glucano con un grado di polimerizzazione fino a 70. Sebbene la risoluzione sia sufficiente per determinare il CLD dei campioni di glicogeno, FACE separa le catene con DP fino a 150, adatto per campioni di amido17. È essenziale tenere presente che sia l'analisi HPAEC-PAD che FACE hanno pro e contro. Ad esempio, la reazione di aminazione richiede un gruppo emiacetale libero per reagire con la funzione amminica primaria dell'APTS. Ciò implica che l'etichettatura APTS non può essere utilizzata per catene di glucani prive di estremità riducenti (ad esempio, inulina). Il metodo HPAEC-PAD non richiede la presenza di estremità riducenti. Un secondo aspetto interessante del metodo HPAEC-PAD è che la colonna a scambio anionico può essere caricata con pochi milligrammi di glucani lineari, consentendo la purificazione del malto-oligosaccaride con uno specifico DP o 14C-radiomarcato malto-oligosaccaride per il saggio enzimatico 18,25. Infine, sebbene la spettrometria di massa (ad esempio, MALDI-TOF) sia una tecnica veloce e sensibile per determinare la distribuzione della lunghezza della catena, questa tecnica sembra essere meno riproducibile. Sovrastima la quantità di lunghe catene di glucani26. Tuttavia, quest'ultimo può essere utilizzato per un'applicazione specifica come l'imaging MALDI per mappare la presenza di glicogeno attraverso il tessuto cellulare27.

Il glicogeno, usato come accumulo di carbonio ed energia, è un omopolimero del glucosio costituito da catene lineari di unità glucosiliche collegate da legami (1 → 4)-α e attaccate attraverso (1 → 6)-α legami glicosidici o punti di ramificazione. Appaiono come particelle β e α nel citosol di una vasta gamma di organismi. β particelle sono minuscole particelle solubili in acqua osservate principalmente nei procarioti. Il loro diametro varia da 20-40 nm, probabilmente dettato dagli enzimi che metabolizzano il glicogeno e dall'ostacolo sterico 1,2.
Descritte per la prima volta nelle cellule animali, le particelle α più grandi mostrano fino a 300 nm di diametro con una forma simile al cavolfiore. Questa particolare organizzazione può avere origine dall'aggregazione di più particelle β o può sorgere dal germogliamento di una singola particella β3. È interessante notare che un recente studio ha riportato la presenza di particelle di α in Escherichia coli4. Tuttavia, a differenza delle particelle α provenienti da cellule animali, queste ultime cadono rapidamente a pezzi durante il processo di estrazione, il che può spiegare la mancanza di dati nella letteratura4. La comparsa di particelle di α negli eucarioti e nei procarioti coinvolge enzimi che metabolizzano il glicogeno filogeneticamente non correlati5. Ciò solleva interrogativi riguardanti la funzione di tali particelle e la natura dei potenziali agenti reticolanti tra β particelle5.
Sebbene siano stati proposti due modelli matematici opposti per la formazione di molecole di glicogeno 6,7,8,9, è generalmente accettato che le particelle di β si siano evolute in risposta alla loro funzione metabolica come riserva di carburante altamente efficiente per il rapido rilascio di grandi quantità di glucosio. Un ampio corpus di prove indica che le proprietà del glicogeno come la digeribilità e la solubilità in acqua sono correlate con la lunghezza media della catena (LCA), che determinerà quindi la percentuale di punti di ramificazione e la dimensione delle particelle 2,6,7,8,10,11 . L'ACL è definito dal rapporto tra il numero totale di residui di glucosio e il numero di punti di ramificazione. Tipicamente, i valori ACL variano da 11-14 e 7-23 residui di glucosio in eucarioti e procarioti, rispettivamente10. Nell'uomo, diverse malattie da disturbo del glicogeno sono dovute all'accumulo anormale di glicogeno. Ad esempio, la malattia di Andersen è associata all'attività carente di un enzima di ramificazione del glicogeno, con conseguente accumulo di glicogeno11 anormale. Nei procarioti, studi cumulativi suggeriscono che l'ACL è un fattore critico che influisce sul tasso di degradazione del glicogeno e sulla capacità di sopravvivenza batterica12,13. È stato riportato che i batteri che sintetizzano particelle β con un basso valore ACL si degradano più lentamente e quindi resistono più a lungo alle condizioni di fame. Pertanto, la conoscenza dell'architettura delle particelle di β è essenziale per comprendere la formazione di particelle di glicogeno anormali nelle malattie da accumulo di glicogeno umano e la sopravvivenza dei procarioti in un ambiente carente di nutrienti.
Dal primo isolamento del glicogeno dal fegato di cane da parte del fisiologo francese Claude Bernard alla fine del XIX secolo14, sono state sviluppate molte tecniche per caratterizzare in dettaglio le particelle di glicogeno. Ad esempio, microscopia elettronica a trasmissione per la morfologia del glicogeno (α o β particelle)15, spettrometria protone-NMR per determinare la percentuale di collegamenti α-1,616, cromatografia di esclusione dimensionale con multi-rivelatori per dedurre il peso molecolare, elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)17 o cromatografia a scambio anionico ad alte prestazioni con rilevamento amperometrico pulsato (HPAEC-PAD) sia per la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) che per l'ACL determinazione18.
Questo lavoro si concentra sul metodo di elettroforesi dei carboidrati assistiti da fluorofori, che si basa sull'aminazione riduttiva del gruppo emiacetale per funzione ammiacetale primaria. Storicamente, l'acido trisolfonico 8-ammino-1,3,6-naftalene (ANTS) è stato utilizzato per la prima volta per l'etichettatura. Successivamente, è stato sostituito dal fluoroforo più sensibile, acido 8-ammino 1,3,6 pirene trisolfonico (APTS)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig01.jpg"> Figura 1: La reazione di aminazione riduttiva con acido 8-ammino 1,3,6 pirene trisolfonico (APTS). Reazione di aminazione riduttiva del gruppo emiacetale per funzione ammiminativa primaria dell'acido 8-ammino 1,3,6 pirene trisolfonico (APTS) in condizioni riduttive <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Come illustrato nella Figura 1, la funzione emiacetale dell'estremità riducente di una catena glucano interagisce con l'ammina primaria di APTS in condizioni riducenti. I gruppi solfonici di APTS portano cariche negative che consentono la separazione delle catene di glucano in base al loro grado di polimerizzazione (DP). La reazione riduttiva dell'ammina è altamente riproducibile ed efficiente. Un'etichettatura di efficienza media dell'80% si ottiene per DP3 a DP135 e fino all'88% e 97% per maltosio (DP2) e glucosio, rispettivamente17,20. Poiché una molecola di APTS reagisce con l'estremità riducente di ciascuna catena glucanica, le singole catene potrebbero essere quantificate e confrontate tra loro su base molare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AG-501-X8 Resin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1436424</td>
			<td>Storage Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water&#8212;storage at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS stock solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>09341-5MG</td>
			<td>Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>select :File&#62;import/restore&#62;ANDI/chromatography in the open window: select &#34;add&#34; select cdf&#160; file &#62; import &#62; next 
			Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software&#62; finish click on QNT-Editor&#62; parameter &#34;Min Area&#34; select &#34;Range&#34; 0.05 [Signal]*min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Open Excel&#62; New file&#62; save the file &#62; File menu click on Import &#62; In the open window choose &#34;csv.&#34; as type file &#62; select your asc file &#62; a new window appears Step 1: choose Macintosh or&#160; Window and then used default setting for the steps 2 and 3. &#62; Y values appear in column A&#62; Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Dry apparatus</td>
			<td>Christ</td>
			<td>alpha 2-4 LO plus</td>
			<td>before the freezing-drying process, samples are stored at -80 &#176;C for 1 h.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-ISAMY</td>
			<td>180 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltoheptaose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Linked carbohydrate separation buffer</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td>477623</td>
			<td>Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pullulanase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-PULKP</td>
			<td>30 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296813-100ML</td>
			<td>1 M Sodium cyanoborohydride in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum-evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Set the temperature at 30 &#176;C. Centrifuge until the samples are dried</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method

Le particelle di glicogeno sono polisaccaridi ramificati composti da catene lineari di unità glucosiliche legate da legami glucosidi α-1,4. Questi ultimi sono attaccati l'uno all'altro da legami α-1,6 glucosidi, indicati come punti di diramazione. Tra le diverse forme di stoccaggio del carbonio (cioè amido, β-glucano), il glicogeno è probabilmente uno dei polisaccaridi da accumulo più antichi e di maggior successo trovati in tutto il mondo vivente. Le catene di glucano sono organizzate in modo che una grande quantità di glucosio possa essere rapidamente immagazzinata o alimentata in una cella quando necessario. Numerose tecniche complementari sono state sviluppate negli ultimi decenni per risolvere la struttura fine delle particelle di glicogeno. Questo articolo descrive l'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE). Questo metodo quantifica la popolazione di catene di glucani che compongono una particella di glicogeno. Conosciuto anche come distribuzione della lunghezza della catena (CLD), questo parametro rispecchia la dimensione delle particelle e la percentuale di ramificazione. È anche un requisito essenziale per la modellizzazione matematica della biosintesi del glicogeno.

Determinazione della lunghezza media della catena del glicogeno La Figura 2 rappresenta il flusso di lavoro necessario per dedurre la distribuzione della lunghezza della catena e la lunghezza media della catena (LCA) del glicogeno.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro per determinare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) e la lunghezza media della catena. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La Figura 3 mostra gli elettroferogrammi della maltoesasio commerciale e del glicogeno epatico bovino ramificato. I segnali di fluorescenza osservati tra 4,13-4,67 minuti in tutti gli esperimenti hanno avuto origine dall'APTS non reagito. Il tempo di eluizione del maltoesaoso marcato (DP6) è stato stimato in 8,49 minuti (Figura 3A). I glucani marcati con APTS del glicogeno bovino sono stati identificati in base al tempo di eluizione di DP6 (Figura 3B). Nessuna traccia di malto-oligosaccaride libero è stata rilevata nel campione di controllo (glicogeno non incubato con enzimi di derisaggio) (Figura 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig03.jpg"> Figura 3: Elettroferogrammi di un glicogeno epatico standard e bovino. (A) L'eluizione temporale (8,49 min) di uno standard glucano, il maltoesaosio (DP6), è stata utilizzata come riferimento per determinare il grado di polimerizzazione (DP) dei glucani marcati con APTS rilasciati dal glicogeno epatico bovino dopo l'azione delle attività enzimatiche di detrassorbimento (B ). Il pannello inserto mostra una separazione delle catene glucaniche fino a 44 DP. Parallelamente, il glicogeno bovino non trattato è stato etichettato con APTS per rilevare possibili tracce di malto-oligosaccaridi liberi nel campione (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Si può concludere che il rilascio di glucano marcato con APTS è dovuto alla scissione dei punti di ramificazione da parte delle attività di isoamilasi e pullulanasi. Va notato che il profilo di elettroforesi capillare può essere ridisegnato in un formato più appropriato per creare una figura a mosaico contenente più profili. Per fare ciò, i file DATA contenenti valori di fluorescenza vengono generati con estensione "asc" e aperti nel programma di fogli di calcolo scegliendo il formato CSV (valore separato da virgole). Sfortunatamente, i valori di fluorescenza esportati non sono associati al corrispondente tempo di eluizione. Di conseguenza, devono essere aggiunti manualmente in base alla configurazione della frequenza di acquisizione sull'apparecchio FACE (4 Hz significa un'acquisizione di valore ogni 0,25 s).
Le aree di picco sono state quindi dedotte utilizzando l'applicazione nativa dello strumento FACE o esportate come file DATA con estensione "cdf" per utilizzare un'altra applicazione. I valori dell'area vengono esportati in un programma di fogli di calcolo e normalizzati esprimendo il DP come percentuale della superficie totale (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig04.jpg"> Figura 4: Normalizzazione dei dati, distribuzione della lunghezza della catena e valore medio della lunghezza della catena. Le aree di picco di fluorescenza sono state importate e normalizzate in un foglio di calcolo. La distribuzione della lunghezza della catena è mostrata come percentuale di DP per ogni DP. La lunghezza media della catena (ACL) viene calcolata sommando ogni catena percentuale per il corrispondente grado di polimerizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Infine, la lunghezza media della catena (ACL) viene dedotta calcolando la somma di ciascuna catena percentuale per il corrispondente grado di polimerizzazione. Esperimenti simili sono stati condotti nel tripliceto sul glicogeno epatico di coniglio (Figura 5A), sul glicogeno epatico bovino (Figura 5B) e sul glicogeno delle ostriche (Figura 5C).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig05.jpg"> Figura 5: Distribuzione della lunghezza della catena del glicogeno commerciale. Il fegato di coniglio (A), il fegato bovino (B) e il glicogeno delle ostriche (C) sono stati incubati in presenza di enzimi disincrostanti (isoamilasi e pullulanasi). I glucani marcati con APTS sono stati quindi separati in base al loro grado di polimerizzazione (DP) utilizzando l'analisi FACE. Il maltosio (DP2), il maltoesasio (DP6) il maltoeptasio (DP7) rappresentano i glucani più abbondanti nel fegato di coniglio, nell'ostrica e nel glicogeno epatico bovino, rispettivamente. L'errore standard di media (SEM) è stato dedotto da tre esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La distribuzione a catena del glicogeno epatico di coniglio ha mostrato chiaramente un contenuto più elevato di malto-oligosaccaride corto (DP2) rispetto al glicogeno epatico bovino (DP 7) o al glicogeno ostrica (DP6). Di conseguenza, il glicogeno epatico di coniglio possiede la lunghezza media della catena più bassa (ACL = 9,8) rispetto al glicogeno epatico bovino (ACL = 11,9) e al glicogeno delle ostriche (ACL = 12,6). Va notato che questi glicogeni commerciali sono solitamente utilizzati per valutare l'attività della glicogeno fosforilasi o della glicogeno sintasi. Ciò suggerisce che la determinazione dei parametri cinetici (Vmax e Km) delle attività enzimatiche di metabolizzazione del glicogeno varierà a seconda della fonte di glicogeno.
Analisi sottrattive L'analisi sottrattiva è un metodo semplice per confrontare la distribuzione delle catene glucaniche di due campioni. Ad esempio, sono stati determinati CLD di glicogeno prodotti dal ceppo wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 e singoli ceppi isogenici glgA1 e glgA2 mutanti (Figura 6A).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig06.jpg"> Figura 6: Confronto delle distribuzioni di lunghezza della catena utilizzando l'analisi sottrattiva. (A) Le distribuzioni di lunghezza della catena del glicogeno purificato da ceppi cianobatterici: Wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 e singoli ceppi isogenici glgA1 e glgA2 mutanti sono stati determinati utilizzando l'analisi FACE. L'errore standard di media (SEM) è stato dedotto da tre esperimenti indipendenti. (B) Le analisi sottrattive sono state eseguite sottraendo la % di ciascun DP di WT alla % di ciascun DP di ΔglgA1 e sottraendo la % di ciascun DP di WT alla % di ciascun DP di DP ΔglgA2. Questa semplice manipolazione matematica mostra l'alterazione delle catene glucaniche nei ceppi mutanti (linee nere). (C) Le distribuzioni medie di lunghezza della catena del glicogeno da wildtype e mutanti di Synechocystis sono state normalizzate in base al picco massimo osservato per ciascun CLD (DP6 per tutti i campioni). Due componenti sono evidenziate tracciando il CLD normalizzato su una scala logaritmica (Nde (DP)). Ogni componente indica un diverso meccanismo di arresto della crescita (per ulteriori informazioni, vedere riferimento2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per ricordare, la maggior parte dei ceppi di cianobatteri possiede due geni che codificano per le attività della glicogeno sintasi: GlgA1 e GlgA221. Entrambi gli enzimi trasferiscono il glucosio residuo di ADP-glucosio sulle estremità non riducenti delle catene lineari di glucano. Come illustrato nella Figura 6A, è difficile confrontare i campioni osservando solo i profili di distribuzione della lunghezza della catena. L'analisi sottrattiva consiste nel sottrarre la percentuale di ciascun DP tra i campioni (Figura 6B). L'analisi sottrattiva di %DP di WT meno % di DP ΔglgA1 mutante rivela un eccesso di DP3, 4 e 5 (valori negativi) e un contenuto ridotto di DP 10-20. Al contrario, l'analisi sottrattiva tra %DP di WT e % di DP ΔglgA2 mutante indica un effetto opposto. Poiché i profili di analisi sottrattiva sono diversi tra GlgA1 e GlgA2, ciò suggerisce una funzione specifica di ciascuna isoforma di glicogeno sintasi nella biosintesi del glicogeno21.
È importante notare che l'analisi sottrattiva è applicabile solo agli esperimenti che coinvolgono un campione di riferimento eseguito in parallelo con i campioni. Altrimenti, l'analisi sottrattiva può essere empirica poiché si trova sul CLD normalizzato del riferimento. Nel 2015, Deng e collaboratori, che hanno studiato i meccanismi di arresto della crescita del glicogeno nei topi e negli esseri umani, hanno proposto un diagramma alternativo e l'interpretazione dei CLD di glicogeno per affrontare questo problema. Questo plottaggio utilizza l'area massima di picco per normalizzare ogni CLD. I dati vengono quindi tracciati su una scala logaritmica evidenziando due componenti. Questi ultimi illustrano due diversi meccanismi per l'arresto dell'allungamento della catena2. Disegnando linee che si adattano al componente DP superiore, i parametri assoluti (ad esempio, pendenze e intercettazioni delle linee) possono essere utilizzati per il confronto CLD senza normalizzazione a un profilo di riferimento. I CLD del ceppo Wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 e dei singoli mutanti isogenici glgA1 e glgA2 sono stati tracciati su una scala logaritmica e sono state determinate linee di adattamento per ciascun profilo (Figura 6C). Il primo componente era molto simile tra i campioni, con un picco massimo a DP 6. Ciò dimostra che l'enzima ramificato produce esplicitamente un massimo di tali catene. Il secondo componente è apparso come una spalla larga, che era già stata descritta per topi e glicogeni umani2. L'inclinazione del secondo componente è sorta a un DP più elevato in ΔglgA1 e la pendenza della corrispondente linea di raccordo (linea rossa) era inferiore al profilo wildtype. Pertanto, la mancanza di GlgA1 rallenta l'arresto dell'allungamento della catena durante la biosintesi che è stato proposto per effetto di un ostacolo sterico per topi e glicogenoumano 2. Questi dati suggeriscono che il rimanente enzima allungante (cioè GlgA2) produce catene più lunghe prima dell'affollamento della catena. In ΔglgA2, l'effetto opposto è stato osservato con una caduta più drammatica della linea di raccordo, confermando che le catene prodotte dal glgA1 rimanente sono complessivamente più corte di quelle sintetizzate dal solo GlgA2 prima dell'ostacolo sterico. Questa analisi suggerisce che entrambe le isoforme possiedono una cinetica distinta e/o che la loro rispettiva concertazione con l'attività enzimatica ramificata differisce.

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Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Nel presente protocollo, la tecnica di elettroforesi dei carboidrati assistiti da fluorofori (FACE) viene utilizzata per determinare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) e la lunghezza media della catena (ACL) del glicogeno.

Determinazione della distribuzione della lunghezza della catena glucano del glicogeno utilizzando il metodo dell'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Questo metodo fornisce una migliore comprensione delle organizzazioni strutturali delle particelle di glicogeno. È una questione importante perché la popolazione delle catene glucaniche, la cosiddetta distribuzione della lunghezza della catena, determina le proprietà chimiche fisiche delle particelle di glicogeno. Come la solubilità in acqua.Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che la fluorescenza è costante indipendentemente dalla lunghezza della catena glucano. C'è solo una molecola APTS legata dal glucano. Pertanto, l'intensità della fluorescenza è direttamente proporzionale al numero di catene di glucano.Il campo per l'elettroforesi capillare assistita è adatto a risolvere il meccanismo medico degli enzimi che metabolizzano il glicogeno. Ad esempio, possiamo determinare il grado di polimerizzazione delle catene di glucano trasferite dagli enzimi ramificati sul glucano accettato. La reazione deve essere eseguita in condizioni.Pertanto, le regioni devono essere protette dall'umidità. Mescolare 200 microlitri di 0,5-2 milligrammi per millilitro di glicogeno purificato con 200 microlitri di tampone di acetato 100 di pH 4,8. Aggiungere 2 microlitri di isoamilasi e 1,5 microlitri di pullulanasi.Mescolare delicatamente pipettando su e giù. Quindi incubare a 42 gradi Celsius per 16 ore in un tubo da 1,5 millilitri. Interrompere le reazioni incubando a 95 gradi Celsius per 5 minuti.Centrifugare a 16, 100 volte G'per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettificare e rimuovere qualsiasi materiale insolubile. Rimuovere la super manutenzione con una pipetta e trasferirli su nuovi tubi annotati. Dopo aver aggiunto perline di resina in un tubo di micro-fuga vuoto, dissalare i supernatanti aggiungendo l'equivalente di 100 microlitri di un perle di resina a scambio cationico anionico e agitare.Raccogliere i campioni mediante pipettaggio e inserirli in nuovi tubi annotati. Congelare i campioni. Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente o 20 gradi Celsius.Mescolare i campioni essiccati con 2 microlitri di 1 cianoboroidruro di sodio molare e tetraidrofurano e 2 microlitri di 8 aminoacidi 1-3-6 pirene trisolfonico. Incubare a 42 gradi Celsius per 16 ore al buio. Aggiungere 46 microlitri di acqua ultra pura a ciascun campione.Per diluire i campioni 50 volte, aggiungere un microlitro del campione a 49 microlitri di acqua ultra pura in 100 microlitri. In vortice per mescolare accuratamente. Posizionare i campioni al buio per 5-10 minuti mentre si imposta il viso.Per eseguire l'elettroforesi a polarità inversa, impostare il metodo, impostare la pressione di iniezione su una forza di 0,5 libbre per pollice quadrato. Quindi impostare la polarità in modalità inversa per la separazione. Diluire il tampone di separazione dei carboidrati legati all'N a un terzo in acqua ultra pura.Effettuare la separazione apts labelta Glucans nel tampone diluito a 30 kilovolt in un capillare di silice fusa nuda. Quindi impostare il tempo di iniezione e avviare l'analisi. Esportare i file ASC e CDF contenenti rispettivamente il profilo dell'elettroferogramma e i dati di integrazione.Aprire il file ASC e disegnare l'unità di fluorescenza relativa in base al grafico temporale. Aprire il file CDF. Procedere con una prima integrazione automatica e regolare i seguenti parametri con integrazione da valle a valle e superficie minima.Controllare e correggere manualmente qualsiasi evento di integrazione improprio. I segnali di fluorescenza osservati tra 4,13 e 4,67 minuti hanno avuto origine dall'APTS non reagito. Il tempo aleutino della maltoesadose DP 6 etichettato è stato stimato in 8,49 minuti.I glucani marcati APTS del glicogeno bovino sono stati identificati in base al tempo aleutino di DP 6. Nessuna traccia di maltooligosaccharide libero è stata rilevata nel campione di controllo in cui il glicogeno non è stato incubato con enzimi di deramificazione. Il pannello di incasso mostra una separazione delle catene glucani fino a 44 DP. La distribuzione della lunghezza della catena è mostrata come percentuale di DP per ogni DP. La lunghezza media della catena è stata calcolata sommando ogni percentuale di catena volte il corrispondente grado di polimerizzazione.L'analisi del viso ha mostrato che i glucani più abbondanti sono il maltosio e il fegato di coniglio, il maltoesaosio nell'ostrica e il maltoeptaosio nel fegato bovino. Le distribuzioni della lunghezza della catena del glicogeno purificato da ceppi batterici cianobatterici selvatici e mutanti sono state determinate utilizzando l'analisi del viso. Le analisi sottrattive sono state eseguite sottraendo la percentuale di ogni DP di tipo selvatico dalla percentuale di ogni DP di mutanti.Le distribuzioni medie di lunghezza della catena del glicogeno da wild type e mutanti di Synechocystis sono state normalizzate in base al picco massimo osservato per ogni CLD. Questa tecnica consente una migliore comprensione delle malattie umane associate a un difetto nel metabolismo del glicogeno, in particolare la malattia di Andersen, ricchi risultati dall'accumulo di particelle di glicogeno anormali nelle cellule.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

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