Name: determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method
Uploaded: 2022-03-31T13:20:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av CNRS, Université de Lille CNRS, og ANR gir "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).

1. Inkubasjon med debranching enzymer
<ol><li>Bland 200 μL renset glykogen ved 0,5-2 mg/ml med 200 μL 100 mM acetatbuffer (pH 4,8). Tilsett 2 μL isoamylase (180 U/mg protein) og 1,5 μL pullulanase (30 U/mg protein) (se Materialbord), bland forsiktig ved pipettering opp og ned, og inkuber ved 42 °C i 16 timer i et 1,5 ml rør. MERK: Forringelse eller amylaseforurensning kan oppstå under glykogenrenseprosessen. For å sette pris på tilstedeværelsen av gratis malto-oligosakkarider, kan prøver inkuberes uten debranching enzymcocktail parallelt. En standard (f.eks. maltoheptaose) er inkludert i analysen for å bestemme forholdet mellom elutiontiden og graden av polymerisasjon.</li>
	<li>Stopp reaksjonene ved å inkubere ved 95 °C i 5 minutter.</li>
	<li>Sentrifuge ved 16.100 x g i 5 min ved romtemperatur til pellets og fjern eventuelt uoppløselig materiale.</li>
	<li>Fjern supernatantene ved hjelp av en pipette og overfør dem til nye kommenterte rør. Avsalt supernatantene ved å tilsette tilsvarende 100 μL anion/kationutvekslingharpiksperler (AG-501-X8, se Materialtabell) og agitate.<ol>
<li>Agitate perlene regelmessig i 5 min. Samle prøvene ved pipettering og legg dem i nye kommenterte rør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frysetørk eller bruk en vakuumfordamper satt opp (se Materialtabell) ved 30 °C for å tørke prøvene.</li>
	<li>Oppbevar tørkede prøver ved romtemperatur eller ved -20 °C. MERK: Prøvene kan lagres i 1 måned.</li>
</ol>2. Reduktiv aminasjon
<ol><li>Bland de tørkede prøvene med 2 μL 1 M natriumcyoborohydrid i tetrahydrofuran (THF) og 2 μL APTS (5 mg APTS resuspendert i 48 μL 15% eddiksyre) (se materialtabellen).</li>
	<li>Inkuber ved 42 °C i 16 timer i mørket. FORSIKTIG: Natriumcyoborohydrid håndteres med tilpasset personlig verneutstyr og under en kjemisk hette. Innånding og kontakt med huden er svært giftig og kan være dødelig, noe som forårsaker alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Svært giftige gasser kan genereres ved blanding av natriumcyoborohydrid med eddiksyre. I kontakt med vann frigjør natriumcyoborohydrid brannfarlige gasser, som kan antennes spontant. Konsentrerte prøver håndteres under en kjemisk hette og ved hjelp av tilpasset personlig verneutstyr fra dette trinnet.</li>
</ol>3. FACE-analyse
<ol><li>Tilsett 46 μL ultrarent vann i hver prøve.</li>
	<li>Fortynn prøvene direkte til 1/50 i mikroflasker på 100 μL ved å tilsette 1 μL av prøven til 49 μL ultrarent vann. Hold prøvene i mørket mens du stiller inn FACE (5-10 min).</li>
	<li>Utfør omvendt polaritetselektrose med et kapillært elektroforeseinstrument med laserindusert fluorescensdetektor (LIF) (se Materialfortegnelse). Sett polariteten i "reverse mode" for separasjon, sett LIF på 488 nm utslippsbølgelengde og detektoren på 512 nm.</li>
	<li>Still injeksjonstiden i 10 s og injeksjonstrykket på 0,5 psi.</li>
	<li>Utfør APTS-merket glukans separasjon ved 30 kV i en bar smeltet silika kapillær på 60,2 cm i lengde med en indre diameter på 50 μm (375 μm ytre diameter) i den N-tilknyttede karbohydratseparasjonsbufferen fortynnet til 1/3 i ultrapure vann (se Materialtabellen). MERK: Den N-koblede karbohydratseparasjonsbufferen erstattes hver 20.</li>
</ol>4. DATABEHANDLING
<ol><li>Eksporter .. ASC "og ". CDF "filer som inneholder elektropherogram profil og integrasjonsdata, henholdsvis.</li>
	<li>Åpne . ASC fil og tegne den relative fluorescens enheten i henhold til tidstabellen.</li>
	<li>Åpne . CDF-fil , fortsett med en første automatisk integrasjon og juster følgende parametere: bredde; dal-til-dal-integrasjon; minimumsområdet.</li>
	<li>Kontroller og korriger eventuelle feilaktige integreringshendelser manuelt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+randomly+hyperbranched+polymers:+Theory+and+simulation.">Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation.</a> The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901 (2008).</li><li>Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers,+exemplified+by+glycogen.">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li><li>Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice.">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+glycogen+in+escherichia+coli.">Molecular structure of glycogen in escherichia coli.</a> BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li><li>Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+glycogen+and+starch+metabolism+in+eukaryotes+gives+molecular+clues+to+understand+the+establishment+of+plastid+endosymbiosis.">The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis.</a> Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).</li><li>Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+glycogen+biosynthesis+through+Monte+Carlo+simulation.">Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).</li><li>Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+molecular+design+in+the+evolution+of+metabolism:+The+glycogen+molecule.">Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule.</a> Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).</li><li>Mel&#233;ndez, R., Mel&#233;ndez-Hevia, E., Cascante, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+glycogen+structure+evolve+to+satisfy+the+requirement+for+rapid+mobilization+of+glucose?+A+problem+of+physical+constraints+in+structure+building.">How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building.</a> Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).</li><li>Mel&#233;ndez, R., Mel&#233;ndez-Hevia, E., Canela, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+structure+of+glycogen:+A+clever+solution+to+optimize+cell+metabolism.">The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism.</a> Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).</li><li>Wang, L., Wise, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+with+short+average+chain+length+enhances+bacterial+durability.">Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability.</a> Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).</li><li>Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+and+glycogen+storage+disorders.">Glycogen metabolism and glycogen storage disorders.</a> Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+of+glycogen+serving+as+a+durable+energy+reserve+in+bacteria.">Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+in+situ+progressive+N-terminal+is+still+controversial+truncation+of+glycogen+branching+enzyme+in+Escherichia+coli+DH5&#945;+on+glycogen+structure,+accumulation,+and+bacterial+viability.">Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5&#945; on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).</li><li>Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+physiological+mechanism+of+sugar+formation+in+the+liver.">On the physiological mechanism of sugar formation in the liver.</a> Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).</li><li>Liu, Q. -. H., Tang, J. -. W., Wen, P. -. B., Wang, M. -. M., Zhang, X., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+prokaryotes+to+eukaryotes:+Insights+into+the+molecular+structure+of+glycogen+particles.">From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315 (2021).</li><li>Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1+H+NMR+visibility+of+mammalian+glycogen+in+solution.">1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678 (1990).</li><li>O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-assisted+carbohydrate+electrophoresis+(FACE)+of+oligosaccharides:+Efficiency+of+labelling+and+high-resolution+separation.">Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation.</a> Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).</li><li>Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+distributions+of+chain+length+of+amylopectins+by+high-performance+liquid+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection.">Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection.</a> Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).</li><li>Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+starch+structure.">Analysis of starch structure.</a> Electrophoresis. 19, 2603-2611 (1998).</li><li>Guttman, A., Chen, F. -. T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+capillary+gel+electrophoresis+of+reducing+oligosaccharides+labeled+with+1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate.">High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate.</a> Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).</li><li>Kadouche, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+function+of+the+GlgA2+glycogen/starch+synthase+in+cyanobacterium+sp.+clg1+highlights+convergent+evolution+of+glycogen+metabolism+into+starch+granule+aggregation.">Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).</li><li>Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bound+substrate+in+the+structure+of+cyanobacterial+branching+enzyme+supports+a+new+mechanistic+model.">Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model.</a> The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).</li><li>Sawada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+reaction+characteristics+of+glucan+branching+enzymes+and+the+fine+structure+of+&#945;-glucan+from+various+sources.">Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of &#945;-glucan from various sources.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).</li><li>Wong, K. S., Jane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+debranched+amylopectin+by+HPAEC-PAD+with+a+post-column+enzyme+reactor.">Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).</li><li>Colleoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+chlamydomonas+reinhardtii+a-1,4+glucanotransferase+supports+a+direct+function+in+amylopectin+biosynthesis.">Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis.</a> Plant Physiology. 120, 9 (1999).</li><li>Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+MALDI-TOF+mass+spectrometry+and+HPAEC-PAD+analysis+of+debranched+starch.">A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch.</a> Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+glycogen+serves+as+a+critical+glucosamine+cache+required+for+protein+glycosylation.">Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation.</a> Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter knyttet til dette arbeidet.

De fysisk-kjemiske egenskapene til glykogenpartikler (f.eks. størrelse, morfologi, løselighet) er direkte forbundet med lengden på glukaner som komponerer partiklene. Enhver ubalanse mellom biosyntetiske og katabolske enzymer resulterer i endring av kjedelengdefordelingen og i seg selv opphopning av unormalt glykogen som kan være farlig for celle11. FACE-analysen er en metode for valg for å bestemme glykogens kjedelengdefordeling (CLD). Som avbildet i figur 2, tillater bestemmelsen av CLD slutningen av den gjennomsnittlige kjedelengdeverdien av glykogen (ACL), som speiler strukturen av glykogenpartikler. Dyreglykogener med høye ACL-verdier er forbundet med utseendet av unormale partikler. Den subtraktive analysen er en nyttig metode for å sammenligne to glykogenprøver fra forskjellige genetiske bakgrunner (mutant versus wildtype). Ved å plotte på en logaritmisk skala clds normalisert til maksimal topp, derimot, har fordelen av å sammenligne CLD uavhengig av en referanse og ga oss informasjon om den voksende glykogenmekanismen.
I tillegg, FACE analyse er en kraftig teknikk for å karakterisere katalytiske egenskaper av glykogen metaboliserende enzymer. For eksempel, alle glykogen forgrening enzymer cleave (1 → 4)-α koblinger og overføre oligomaltosyl grupper til en (1 → 6)-α posisjon eller forgreningspunkter. Forgreningsenzymer skiller seg ut på grunn av deres affinitet for polysakkarider (f.eks. amylopektin, glykogen) og lengden på overførte glukaner til tross for den lignende katalytiske mekanismen22. Dermed kan ulike kilder til forgreningsenzymer (menneske, plante, bakterier) karakteriseres og klassifiseres gjennom en rekke inkubasjonsforsøk og CLD-sammenligninger ved hjelp av FACE-analyse23.
Som nevnt i introduksjonen er HPAEC-PAD også en alternativ metode for å bestemme kjedelengdefordelingen18. Begge teknikkene krever fullstendig hydrolyse av (1 → 6)-α koblinger eller forgreningspunkter ved isoamylase-type debranching enzymer før de separerer bassenget av lineære glukaner i henhold til deres grad av polymerisering (DP). HPAEC-PAD-metoden har imidlertid to ulemper sammenlignet med FACE: (1) den amperometriske pulsresponsen reduseres etter hvert som glukankjedene øker, noe som ikke gir kvantitativ informasjon. Dette masseskjevhetsproblemet kan omgås ved hjelp av HPAEC-ENZ-PAD som involverer en postkolonne enzymreaktor mellom anionutvekslingskolonnen og PAD24. Søyleenzymreaktoren hydrolyserer malto-oligosakkarider i glukoserester, noe som gir en konstant puls amperometrisk respons. (2) HPAEC-PAD tillater separasjon av glukankjeder med en grad av polymerisasjon opp til 70. Selv om oppløsningen er nok til å bestemme CLD for glykogenprøver, skiller FACE kjeder med DPer opp til 150, egnet for stivelsesprøver17. Det er viktig å huske på at både HPAEC-PAD- og FACE-analyse har fordeler og ulemper. For eksempel krever aminasjonsreaksjonen en fri hemiacetal gruppe for å reagere med APTS's primære aminfunksjon. Dette innebærer at APTS-merking ikke kan brukes til glukankjeder som mangler reduksjonsender (f.eks. inulin). HPAEC-PAD-metoden krever ikke at det finnes reduksjonsender. Et annet interessant aspekt ved HPAEC-PAD-metoden er at anionutvekslingskolonnen kan lastes med noen få milligram lineære glukaner, slik at rensing av malto-oligosakkarid med en bestemt DP eller 14C-radiomerket malto-oligosakkarid for enzymatisk analyse18,25. Til slutt, selv om massespektrometri (f.eks. MALDI-TOF) er en rask og sensitiv teknikk for å bestemme kjedelengdedistribusjon, ser denne teknologien ut til å være mindre reproduserbar. Det overvurderer mengden lange glukankjeder26. Likevel kan sistnevnte brukes til en bestemt applikasjon som MALDI-avbildning for å kartlegge tilstedeværelsen av glykogen over cellulært vev27.

Glykogen, brukt som karbon- og energilagring, er en homopolymer av glukose som består av lineære kjeder av glukosylenheter forbundet med (1 → 4)-α bindinger og festet gjennom (1 → 6)-α glykosidiske bindinger eller forgreningspunkter. De fremstår som β- og α-partikler i cytosolen til et bredt spekter av organismer. β-partikler er små vannløselige partikler som hovedsakelig observeres i prokaryoter. Diameteren varierer fra 20-40 nm, sannsynligvis diktert av glykogenmetaboliserende enzymer og sterisk hindring 1,2.
Først beskrevet i dyreceller, viser de større α-partiklene opptil 300 nm i diameter med blomkållignende form. Denne spesielle organisasjonen kan stamme fra aggregering av flere β-partikler eller kan oppstå ved å spire ut av en enkelt β-partikkel3. Interessant nok har en nylig studie rapportert tilstedeværelsen av α-partikler i Escherichia coli4. Men i motsetning til α-partikler fra dyreceller, faller sistnevnte raskt fra hverandre under utvinningsprosessen, noe som kan forklare mangelen på data i litteraturen4. Utseendet til α-partikler i eukaryoter og prokaryoter innebærer fylogentisk ikke-relatert glykogenmetaboliserende enzymer5. Dette reiser spørsmål om funksjonen til slike partikler og arten av potensielle krysskoblingsmidler mellom β-partikler5.
Selv om to motsatte matematiske modeller ble foreslått for glykogenmolekyldannelse 6,7,8,9, er det generelt akseptert at β-partikler har utviklet seg som svar på deres metabolske funksjon som et svært effektivt drivstoffreserve for rask frigjøring av store mengder glukose. En stor mengde bevis indikerer at glykogenegenskaper som fordøyelighet og løselighet i vann er korrelert med gjennomsnittlig kjedelengde (ACL), som deretter vil diktere prosentandelen av forgreningspunkter og partikkelstørrelsen 2,6,7,8,10,11 . ACL er definert av forholdet mellom totalt antall glukoserester og antall forgreningspunkter. Vanligvis varierer ACL-verdienefra henholdsvis 11-14 og 7-23 glukoserester i eukaryoter og prokaryoter. Hos mennesker skyldes flere glykogensykdommer unormal glykogenakkumulering. For eksempel er Andersens sykdom forbundet med mangelfull aktivitet av et glykogenforgreningsenzym, noe som resulterer i opphopning av unormal glykogen11. I prokaryoter tyder kumulative studier på at ACL er en kritisk faktor som påvirker nedbrytningsgraden av glykogen og bakteriell overlevelsesevne12,13. Det har blitt rapportert at bakterier som syntetiserer β-partikler med lav ACL-verdi, forringes langsommere og tåler derfor sultforhold lenger. Dermed er kunnskap om arkitekturen til β-partikler avgjørende for å forstå dannelsen av unormale glykogenpartikler i menneskelige glykogenlagringssykdommer og prokaryoter overlevelse i et næringsmangelmiljø.
Siden den første isolasjonen av glykogen fra hundelever av den franske fysiologen Claude Bernard i slutten av det nittende århundre14, ble mange teknikker utviklet for å karakterisere glykogenpartikler i detalj. For eksempel overføringselektronmikroskopi for glykogenmorfologi (α- eller β-partikler)15, proton-NMR spektrometri for å bestemme prosentandelen av α-1,6 koblinger16, størrelse eksklusjon kromatografi med multi-detektorer for å utlede molekylvekten, Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE)17 eller High-Performance Anion exchange chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAEC-PAD) for både kjedelengdefordeling (CLD) og ACL besluttsomhet18.
Dette arbeidet fokuserer på fluoroforassistert karbohydratelektroforesemetode, som er avhengig av reduktiv aminering av hemiacetalgruppen ved primær aminfunksjon. Historisk ble 8-amino-1,3,6-naftalen trisulfonsyre (ANTS) først brukt til merking. Senere ble den erstattet av den mer følsomme fluoroforen, 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig01.jpg"> Figur 1: Den reduktive aminasjonsreaksjonen med 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS). Reduktiv amineringsreaksjon av hemiacetalgruppen ved primær aminfunksjon på 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS) under reduktive forhold <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Som avbildet i figur 1, samhandler hemiacetalfunksjonen til den reduserende enden av en glukankjede med den primære amin av APTS under reduserte forhold. De sulfoniske gruppene av APTS bærer negative ladninger som muliggjør separasjon av glukankjeder i henhold til deres grad av polymerisasjon (DP). Den reduktive aminreaksjonen er svært reproduserbar og effektiv. En gjennomsnittlig effektivitetsmerking på 80% oppnås for henholdsvis DP3 til DP135 og opptil 88% og 97% for maltose (DP2) og glukose, henholdsvis17,20. Fordi ett molekyl av APTS reagerer med den reduserende enden av hver glukankjede, kan individuelle kjeder kvantifiseres og sammenlignes med hverandre på molarbasis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AG-501-X8 Resin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1436424</td>
			<td>Storage Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water&#8212;storage at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS stock solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>09341-5MG</td>
			<td>Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>select :File&#62;import/restore&#62;ANDI/chromatography in the open window: select &#34;add&#34; select cdf&#160; file &#62; import &#62; next 
			Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software&#62; finish click on QNT-Editor&#62; parameter &#34;Min Area&#34; select &#34;Range&#34; 0.05 [Signal]*min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Open Excel&#62; New file&#62; save the file &#62; File menu click on Import &#62; In the open window choose &#34;csv.&#34; as type file &#62; select your asc file &#62; a new window appears Step 1: choose Macintosh or&#160; Window and then used default setting for the steps 2 and 3. &#62; Y values appear in column A&#62; Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Dry apparatus</td>
			<td>Christ</td>
			<td>alpha 2-4 LO plus</td>
			<td>before the freezing-drying process, samples are stored at -80 &#176;C for 1 h.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-ISAMY</td>
			<td>180 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltoheptaose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Linked carbohydrate separation buffer</td>
			<td>Sciex Separations, Les Ulis, France</td>
			<td>477623</td>
			<td>Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pullulanase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-PULKP</td>
			<td>30 U/mg of protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296813-100ML</td>
			<td>1 M Sodium cyanoborohydride in THF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum-evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator 5301</td>
			<td>Set the temperature at 30 &#176;C. Centrifuge until the samples are dried</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (face) method

Glykogenpartikler er forgrenede polysakkarider sammensatt av lineære kjeder av glukosylenheter forbundet med α-1,4 glukosidbindinger. Sistnevnte er festet til hverandre ved å α-1,6 glukosidkoblinger, referert til som grenpunkter. Blant de forskjellige former for karbonlagring (dvs. stivelse, β-glukan), er glykogen sannsynligvis en av de eldste og mest vellykkede lagringspolysakkaridene som finnes over hele den levende verden. Glucan kjeder er organisert slik at en stor mengde glukose raskt kan lagres eller drivstoff i en celle når det er nødvendig. Tallrike komplementære teknikker har blitt utviklet i løpet av de siste tiårene for å løse den fine strukturen av glykogenpartikler. Denne artikkelen beskriver Fluorophore-Assistert karbohydratelektroforese (FACE). Denne metoden kvantifiserer befolkningen i glukankjeder som komponerer en glykogenpartikkel. Denne parameteren, også kjent som kjedelengdefordeling (CLD), gjenspeiler partikkelstørrelsen og prosentandelen av forgrening. Det er også et viktig krav for matematisk modellering av glykogenbiosyntese.

Bestemmelse av gjennomsnittlig kjedelengde av glykogen Figur 2 representerer arbeidsflyten som kreves for å utlede kjedelengdefordelingen og gjennomsnittlig kjedelengde (ACL) for glykogen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig02.jpg"> Figur 2: Arbeidsflyt for å bestemme kjedelengdefordelingen (CLD) og gjennomsnittlig kjedelengde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Figur 3 viser elektroferogrammer av kommersiell maltohexaose og debranched bovin lever glykogen. Fluorescenssignalene som ble observert mellom 4.13-4.67 min i alle eksperimenter stammer fra det ikke-vedtatte APTS. Elutiontiden for merket maltohexaose (DP6) ble estimert til 8,49 min (figur 3A). De APTS-merkede glukanene av bovint glykogen ble identifisert basert på elutiontiden til DP6 (figur 3B). Det ble ikke påvist spor av fritt malto-oligosakkarid i kontrollprøven (glykogen inkuberes ikke med debranching enzymer) (figur 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig03.jpg"> Figur 3: Elektroferogrammer av en standard og bovin leverglykogen (A) Tidseluten (8,49 min) av en glukanstandard, maltohexaose (DP6), ble brukt som referanse for å bestemme graden av polymerisering (DP) av APTS-merkede glukaner frigjort fra bovin leverglykogen etter virkningen av debranching enzymaktiviteter (B ). Innsettpanelet viser en separasjon av glukankjeder opp til 44 DP. Parallelt ble ubehandlet bovint glykogen merket med APTS for å oppdage mulige spor av frie malto-oligosakkarider i prøven (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Det kan konkluderes med at utgivelsen av APTS-merket glukan skyldes spalting av forgreningspunkter av både isoamylase og pullulanase aktiviteter. Det skal legges merke til at den kapillære elektroforeseprofilen kan tegnes på nytt i et mer passende format for å lage en mosaikkfigur som inneholder flere profiler. For å gjøre dette genereres DATA-filer som inneholder fluorescensverdier med "asc" -utvidelse og åpnes i regnearkprogrammet ved å velge CSV-format (kommadelt verdi). Dessverre er de eksporterte fluorescensverdiene ikke knyttet til den tilsvarende elutiontiden. Følgelig må de legges manuelt i henhold til oppkjøpsfrekvensoppsettet på FACE-apparatet (4 Hz betyr ett verdianskaffelse hver 0,25 s).
Toppområder ble deretter utledet ved hjelp av FACE-instrumentets opprinnelige applikasjon eller eksportert som en DATA-fil med en "cdf" -utvidelse for å bruke et annet program. Områdeverdiene eksporteres i et regnearkprogram og normaliseres ved å uttrykke DP som en prosentandel av det totale overflatearealet (figur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig04.jpg"> Figur 4: Datanormalisering, kjedelengdefordeling og gjennomsnittlig kjedelengdeverdi. Fluorescens toppområder ble importert og normalisert i et regneark. Kjedelengdefordelingen vises som prosentandelen av DP for hver DP. Gjennomsnittlig kjedelengde (ACL) beregnes ved å summere hver prosentkjede ganger den tilsvarende graden av polymerisasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Til slutt utledes den gjennomsnittlige kjedelengden (ACL) ved å beregne summen av hver prosentkjede ganger den tilsvarende graden av polymerisasjon. Lignende eksperimenter ble utført i triplikat på kaninleverglykogen (figur 5A), på storfelevergllykogen (figur 5B) og østersgllykogen (figur 5C).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig05.jpg"> Figur 5: Kjedelengdefordeling av kommersielt glykogen. Kaninlever (A), storfelever (B) og østersglykogen (C) ble inkubert i nærvær av debranching enzymer (isoamylase og pullulanase). De APTS-merkede glukanene ble deretter separert i henhold til deres grad av polymerisasjon (DP) ved hjelp av FACE-analyse. Maltose (DP2), maltohexaose (DP6) maltoheptaose (DP7) representerer de mest tallrike glukanene i henholdsvis kaninlever, østers og bovin levergllykogen. Standardfeilen for gjennomsnitt (SEM) ble utledet fra tre uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Kjedelengdefordelingen av kaninlevergllykogen viste tydelig et høyere innhold av kort malto-oligosakkarid (DP2) enn bovin levergllykogen (DP 7) eller østersglykogen (DP6). Som et resultat har kaninlevergenet den laveste gjennomsnittlige kjedelengden (ACL = 9,8) sammenlignet med storfeleverglykogen (ACL = 11,9) og østersglykogen (ACL = 12,6). Det skal bemerkes at de kommersielle glykogenene vanligvis brukes til å analyse av glykogenfosforase eller glykogensyntaseaktivitet. Dette antyder at bestemmelse av kinetiske parametere (Vmaks og Km) av glykogen metaboliserende enzym aktiviteter vil variere i henhold til kilden til glykogen.
Subtraktive analyser Den subtraktive analysen er en enkel metode for å sammenligne glukankjederfordelingen av to prøver. For eksempel ble CLDer av glykogen produsert av wildtype (WT) Synechocystis PCC6803-stammen og enkle isogene glgA1 - og glgA2 mutantstammer bestemt (figur 6A).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig06.jpg"> Figur 6: Sammenligning av kjedelengdefordelinger ved hjelp av subtraktiv analyse. (A) Kjedelengdefordelingene av glykogen renset fra cyanobakterielle stammer: Wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 og enkeltisogen glgA1 og glgA2 mutantstammer ble bestemt ved hjelp av FACE-analyse. Standardfeilen for gjennomsnitt (SEM) ble utledet fra tre uavhengige eksperimenter. (B) Subtraktive analyser ble utført ved å trekke % av hver DP av WT til % av hver DP av ΔglgA1 og trekke % av hver DP av WT til % av hver DP på DP av DP ΔglgA2. Denne enkle matematiske manipulasjonen viser endringen av glukankjeder i mutante stammer (svarte linjer). (C) Gjennomsnittlig kjedelengdefordeling av glykogen fra wildtype og mutanter av Synechocystis ble normalisert i henhold til den maksimale toppen som ble observert for hver CLD (DP6 for alle prøver). To komponenter fremgår av plotting av normalisert CLD på en logaritmisk skala (Nde (DP)). Hver komponent angir en annen mekanisme for vekststans (hvis du vil ha mer informasjon, se referanse2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For å huske har de fleste cyanobakterier to gener som koder glykogensyntaseaktiviteter: GlgA1 og GlgA221. Begge enzymene overfører rester av glukose av ADP-glukose til de ikke-reduserende endene av lineære glukankjeder. Som vist i figur 6A er det utfordrende å sammenligne prøver ved bare å se på distribusjonsprofilene for kjedelengde. Den subtraktive analysen består i å trekke fra prosentandelen av hver DP mellom prøver (figur 6B). Den subtraktive analysen av %DP for WT minus % av DP ΔglgA1-mutanten avslører et overskudd på DP3, 4 og 5 (negative verdier) og et redusert innhold på DP 10-20. Den subtraktive analysen mellom %DP for WT og % av DP ΔglgA2-mutanten indikerer derimot en motsatt effekt. Fordi de subtraktive analyseprofilene er forskjellige mellom GlgA1 og GlgA2, antyder dette en bestemt funksjon av hver glykogensyntase isoform i glykogenbiosyntese21.
Det er viktig å merke seg at subtraktiv analyse bare gjelder for eksperimenter som involverer en referanseprøve utført parallelt med prøvene. Ellers kan subtraktiv analyse være empirisk siden den ligger på den normaliserte CLD av referansen. I 2015 foreslo Deng og samarbeidspartnere, som undersøkte stoppmekanismer for glykogenvekst hos mus og mennesker, en alternativ plotting og tolkning av glykogen-CLDer for å løse dette problemet. Denne plottet bruker det maksimale toppområdet til å normalisere hver CLD. Dataene tegnes deretter inn på en logaritmisk skala som uthever to komponenter. Sistnevnte illustrerer to forskjellige mekanismer for kjedeforlengelse som stopper2. Ved å tegne linjer som passer til den høyere DP-komponenten, kan absolutte parametere (dvs. bakker og avskjæringer av linjene) brukes til CLD-sammenligning uten normalisering til en referanseprofil. CLDer av wildtype (WT) Synechocystis PCC6803-stammen og de enkle isogene glgA1 - og glgA2-mutantene ble plottet på en loggskala, og monteringslinjer ble bestemt for hver profil (figur 6C). Den første komponenten var svært lik mellom prøver, og toppet seg med maksimalt DP 6. Dette illustrerer at forgreningsenzymet eksplisitt produserer maksimalt slike kjeder. Den andre komponenten dukket opp som en bred skulder, som allerede var beskrevet for mus og menneskelige glykogener2. Hellingen av den andre komponenten oppsto ved en høyere DP i ΔglgA1 og hellingen til den tilsvarende tilpasningslinjen (rød linje) var lavere enn wildtype-profilen. Dermed bremser mangelen på GlgA1 arrestasjonen av kjedeforlengelse under biosyntese som ble foreslått å oppstå ved sterisk hindring for mus og menneskelig glykogen2. Disse dataene tyder på at det gjenværende forlengelsesenzymet (dvs. GlgA2) produserer lengre kjeder før kjede trengsel. I ΔglgA2 ble den motsatte effekten observert med et mer dramatisk fall i tilpasningslinjen, noe som bekrefter at kjedene produsert av de resterende GlgA1 generelt er kortere enn de som syntetiseres av GlgA2 alene før sterisk hindring. Denne analysen antyder at begge isoformene har distinkt kinetikk og/eller at deres respektive konsert med forgrening av enzymaktivitet varierer.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method at JoVE.com

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

I den nåværende protokollen brukes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) -teknikken til å bestemme kjedelengdefordelingen (CLD) og gjennomsnittlig kjedelengde (ACL) av glykogen.

Bestemmelse av glukankjedelengdefordeling av glykogen ved hjelp av fluoroforassistert karbohydratelektroforese (FACE) metode

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Denne metoden gir en bedre forståelse av strukturelle organisasjoner av glykogenpartikler. Det er et viktig problem fordi befolkningen i Glucan-kjedene, den såkalte kjedelengdefordelingen, bestemmer de fysiske kjemiske egenskapene til glykogenpartiklene. For eksempel vannløselighet.En stor fordel med denne teknikken er at fluorescens er konstant uavhengig av glukansk kjedelengde. Det er bare ett APTS-molekyl bundet av Glucan. Dermed er fluorescensintensiteten direkte proporsjonal med antall Glucan-kjeder.Feltet for assistert kapillær elektroforese er egnet for å løse den medisinske mekanismen for glykogenmetaboliserende enzymer. For eksempel kan vi bestemme graden av polymerisering av Glucan kjeder overført ved å forgrene enzymer til akseptert Glucan. Reaksjonen må utføres under forhold.Derfor må regioner beskyttes mot fuktighet. Bland 200 mikroliter 0,5-2 milligram per milliliter renset glykogen med 200 mikroliter 100 acetatbuffer av pH 4,8. Tilsett 2 mikroliter Isoamylase og 1,5 mikroliter Pullulanase.Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Deretter inkuberer du ved 42 grader Celsius i 16 timer i et 1,5 milliliterrør. Stopp reaksjonene ved å inkubere ved 95 grader Celsius i 5 minutter.Sentrifuge ved 16,100 ganger G'i 5 minutter ved romtemperatur for å pellets og fjerne uoppløselig materiale. Fjern supervedlikeholdet med en pipette og overfør dem til nye kommenterte rør. Etter å ha tilsatt harpiksperler i tomt mikro-fuge rør, avsalt supernatantene ved å legge til tilsvarende 100 mikroliter av en anion kation utveksling harpiks perler og agitate.Samle prøvene ved pipettering, og legg dem i nye kommenterte rør. Frys prøvene. Oppbevar tørkede prøver ved romtemperatur eller 20 grader Celsius.Bland de tørkede prøvene med 2 mikroliter 1 molar natrium Cyanoborohydrid og Tetrahydrofuran, og 2 mikroliter av 8 amino 1-3-6 pyrentrisulfonsyre. Inkuber ved 42 grader Celsius i 16 timer i mørket. Tilsett 46 mikroliter ultra rent vann til hver prøve.For å fortynne prøvene 50 ganger, tilsett en mikroliter av prøven til 49 mikroliter ultra rent vann i 100 mikroliter mikrovialer. I virvel for å blande grundig. Plasser prøvene i mørket i 5 til 10 minutter mens du stiller inn ansiktet.For å utføre omvendt polaritetselektrose, sett opp metoden, sett injeksjonstrykket til 0,5 pund kraft per kvadrattomme. Sett deretter polariteten i reversmodus for separasjon. Fortynn den N-tilknyttede karbohydratseparasjonsbufferen til en tredjedel i ultra rent vann.Utfør APTS-merket Glucans-separasjon i den fortynnede bufferen ved 30 kilovolt i en bar smeltet silikakapillær. Sett deretter opp injeksjonstiden, og start analysen. Eksporter ASC- og CDF-filene som inneholder henholdsvis elektroferogramprofilen og integrasjonsdata.Åpne ASC-filen og tegn den relative fluorescensenheten i henhold til tidstabellen. Åpne CDF-filen. Fortsett med en første automatisk integrasjon og juster følgende parametere med dal-til-dal-integrasjon og minimumsareal.Kontroller og korriger eventuelle feilaktige integreringshendelser manuelt. Fluorescenssignalene som ble observert mellom 4,13 og 4,67 minutter stammer fra det ikke-utførte APTS. Den aleutiske tiden for merket Maltohexaose DP 6 ble estimert til 8,49 minutter.APTS-merket Glucans av bovint glykogen ble identifisert basert på den aleutiske tiden til DP 6. Det ble ikke påvist spor av fritt Maltooligosakkarid i kontrollprøven der glykogen ikke ble inkubert med debranching enzymer. Innsettingspanelet viser en separasjon av Glucan-kjeder opp til 44 DP. Kjedelengdefordelingen vises som prosentandelen av DP for hver DP. Den gjennomsnittlige kjedelengden ble beregnet ved å summere hver prosentkjede ganger Den tilsvarende graden av polymerisasjon.Ansiktsanalyse viste at de mest tallrike glukanerne er maltose og kaninlever, Maltohexaose i østers og Maltoheptaose i storfelever. Kjedelengdefordelingene av glykogen renset fra vill type og mutant cyanobakterielle stammer ble bestemt ved hjelp av ansiktsanalyse. Subtraktive analyser ble utført ved å trekke prosentandelen av hver DP av vill type fra prosentandelen av hver DP av mutanter.De gjennomsnittlige kjedelengdefordelingene av glykogen fra villtype og mutanter av Synechocystis ble normalisert i henhold til den maksimale toppen som ble observert for hver CLD. Denne teknikken gir en bedre forståelse av menneskelige sykdommer forbundet med en defekt i glykogenmetabolismen, spesielt Andersens sykdomssykdom, rike resultater fra opphopning av unormale glykogenpartikler i celler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En Rapid Laser Sondering Metode Forenkler Non-invasiv og berøringsfri Fastsettelse av Leaf termiske egenskaper

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillær elektroforese Separasjon av monoklonalt antistoff isoformer Ved hjelp av en nøytral kapillær

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysere superkomplekser av den mitokondriale elektrontransportkjede med innfødte elektroforese, in-gel-analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/Blue native elektroforese for separasjon og analyse av mitokondrie respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA geleelektroforese bruke Thiazole oransje i stedet for Ethidium Bromide eller alternativ fargestoffer

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...